酵母双杂试验
pGBKT7和pGADT7不要同时转入细胞，要先转入一个，平板培养，挑单菌落做液体培养，再转入另一个质粒，同时转入两个质粒的效率太低。我做的时候转化率很高，从来没有出现过问题，转入第一个质粒（pGBKT7）通常在SD-Trp平板上可以有3000-4000个菌落，再转入pGADT7后，在双选择平板SD-Trp-Leu上至少也可以收获400-500个菌落。需要注意的是，细胞转入pGBKT7后，在-Trp上挑选单菌落做液体培养时，不要用YPD培养液，要用SD-Trp培养液，这样才可以使转化的细胞充分生长。
转化实验的条件也很重要，如果你觉得这中间有什么不放心，你可以把protocol发给我看看。我这里AH109长得很好，但实验室在国外，估计没法给你。
另外，你说AH109培养不好，是在什么选择平板上？在转完两个质粒以后做实验筛选时，应该先做LacZ和MEL1的显色，再做HIS3，最后做ADE2（因为ADE2的选择是最stringent 的）。还有什么问题可以继续问我。
1.YPDA配制方法如下：
先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ，加水885ml/L
另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，（如果量不多，也可以用50ml离心管）加水定容至100ml。以上两个瓶子同时灭菌：115摄氏度，20min 。
灭菌完后，再混合。最后加入已经过滤除菌的0.2％的ADE储液，15ml/L 。
121° 15min
-80°取菌种，划线，30° 培养3天, 表面光滑而湿润，把平板用封口膜封好，4°冰箱保存，防止霉菌污染。
2.设置阴性对照最好用空载体，因为pGBKT7-Lam+pGADT7-T组成的阴性对照，在SD\-Trp-Leu-His 板上是能够生长的，但生长速度要比阳性对照慢好多。而Y187或AH109空菌株，在SD\-Trp-Leu-His 板上不能生长，这说明，阴性对照在三缺板上有背景生长。
常用试剂的配制
(1) Kana ( 50rng/ml)溶液的配制:2.5g卡那霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全
溶解后定容到50 ml, 0.22^011滤膜过滤除菌,-2(rC保存.
(2) Amp(100rng/ml)溶液的配制:5g氨节青霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全溶
解后定容到50 ml, 0.22^m滤膜过滤除菌,-201保存.
(3) 20%葡萄糖溶液的配制:20g葡萄糖溶于40ml去离子水中,待葡萄糖完全溶
解后定容至100ml,在超净工作台中用0.22^011滤膜过滤除菌,4°C保存。
(4) 0.2%腺噪呤半硫酸盐:0.03g腺嘿呤半硫酸盐溶于12ml去离子水中,待完
全溶解后定容至15ml,在超净工作台中用0.22^1111滤膜过滤除菌,4°C保存。
(5) 60%甘油的配制:60ml甘油,加人去离子水,定容到100ml,混匀后,121
°C高温蒸汽灭菌20min,4°C保存。
(6) Tris-乙酸(TAE)的配方:
50X储存液:242g Tris 碱+57.1 ml 冰乙酸+100ml0.5inol/LEDTA(pH8.0)
工作液:40mmol/L Tris-乙酸+lmmol/LEDTA
YPD培养基
20g/L Difco peptone
lOg/L Yeast extract
20g/L Agar(for plates only)
对于包含腺嚼呤的YPD (YPDA)培养基,每升培养基中可加入15ml0.2%的腺
噪呤半硫酸盐溶液(终浓度为0.003%)。
加水至900 ml,调pH值为6.5,然后高温蒸汽灭菌。待培养基冷却到55°C左右
时加入100ml20%浓度D-葡萄糖溶液至终浓度为2%。
若向YPD或YPDA培养基中加kan等抗生素,可在高温蒸汽灭菌后待培养基冷
却到55°C左右后加入0.2-0.3 ml50mg/ml的kan(终浓度为10-15mg/ml)。
SD培养基
6.7g/L YNB(无氨基酸)
20g/L 琼脂粉(用于固体培养基)
800 ml 双蒸水
100 ml 灭过菌的10X缺失培养基
调pH值到5.8,然后高压蒸汽灭菌。待培养基冷却到55°C左右后再加入3-AT,
放线菌酮素,腺嘿呤或X-a-Gal等。
加入100 ml灭过菌的20%浓度D-葡萄糖溶液至终浓度2%。
酵母菌遗传转化溶液的配制
(1)PEG3350(50%W/V)的配制:取50gPEG3350,加入35ml双蒸水,磁力搅拌到其
溶解,定容到100ml,混勻,用0.45^un滤器过滤除菌,存于灭过菌的容器中,4°C保存。
(2)10XTE:10mM EDTA, 0.1M Tris-HCU周pH 值为7.5,高温蒸汽灭菌,4°C保存。
(3)10X LiAC:lM醋酸锂,用稀醋酸调pH值为7.5,高温蒸汽灭菌,4°C保存。
(4) 1 XTE/LiAC( 10ml): 1 m 110XTE+1 ml 10x LiAC+8mlddH20,现用现配。
(5)PEG/LiAC溶液的配制:配方见表3.
表3 PEG/LiAC溶液的配方
PEG/LiAC溶液成分lOmlPEG/LiAC溶液各成分用量PEG3350 (50%) 8ml
10xTE 1ml
10 x Li AC 1ml
现用现配,用前将其充分混勻。
(6)鲑精DNA ( lOmg/ml)的配制:0.2g鲑精DNA溶于20ml去离子水中,1ml
移液器反复吹打使其断裂,分成小份,-2(rC冷冻保存。用前将其置于沸水浴煮
5分钟,然后迅速置于冰浴中2分钟,如此重复3次,使鲑精DNA充分变性。
(7)X-a-Gal (20mg/ml)的配制:0.4g X-a-Gal 溶于20mlDMF 中,配成浓度为
20mg/ml的储存液,0.22^im滤膜过滤除菌,分装成小份,-2(rC避光保存。
(8) 10x氨基酸母液的配制,各成分用量如表4所示。
片段基因酶切产物及对应载体的酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分离纯化,然后将目的条带切胶回收,利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收。
目的片段与对应载体的连接遵循摩尔比为3:1的原则,基因片段的回收产物与载体片段的回收产物的具体用量取决于基因片段与载体的大小及其回收产物的浓度。
连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
阳性克隆的鉴定，挑取单克隆，摇菌，PCR，4度保存，凝胶检测。
摇菌：从LB平板上挑单菌落接种于10ml含kan抗生素的LB液体培养基中,37°C,200rpm,培养12 -16h，提质粒，-20度保存。
将菌落PCR验证的阳性克隆接种于5mlLB (含50mg/inl kan或含lOOmg/mlAmrp)液体培养基中,37°C,180rpm,过夜培养。提取质粒进行酶切鉴定。
酶切体系的电泳检测:将酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
酵母菌AH109营养型测试
用接种环从Yro平板上挑取单克隆,分别接种到SD/-Ura, SDZ-Ade, SD/-His,SD/-Met, SD/-Leu, SD/-Trp和YPDA固体平板上,3(rC倒置培养3-5天,观察菌体生长情况。
酵母双杂实验步骤
2.1.1酵母双杂交 2.1.1.1Gateway入门克隆 设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。 通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下： att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL pDONR221 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL 将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。 进行BP反应时，需注意以下几项： (1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P 入门载体； (2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可 以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对 于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的； (3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物 最好不要超过250ng。 2.1.1.2诱饵载体构建 重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下： 入门载体(50-150 ng)1-7μL pDEST32 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL
实验七 酵母菌细胞大小的测定
实验七酵母菌细胞大小的测定 一、实验目的 1.了解测量微生物大小的原理； 2.学习并掌握接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强微生物细胞大小的感 性认识。 二、实验材料 1.菌种：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬液，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 染色标本片。 2.仪器或其他用具：显微镜，接目测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片 三、实验原理 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具—测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和接目测微尺。 镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10μm）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。 接目测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将接目测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了接目测微尺。 由于接目测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用接目测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定接目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的接目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。 图7-1测微尺的安装 图7-2目镜测微尺图7-3用镜台测微尺校正接目测微尺
CLONTECH酵母双杂中文版
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
酵母双杂交技术
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
酵母菌实验报告
山东大学实验报告2009年11月日 姓名郑冲冲系年级08级生科一班组别同组者张健康于政达 学号200800140207题目酵母菌的培养、形态观察、死活鉴定和子囊孢子的观察 一、目的要求 1、掌握酵母培养基的配置和酵母菌的接种方法 2、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。 3、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的实验方法。 4、学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 二、基本原理 1、培养基：酵母菌的能源主要是糖，一般用麦芽汁琼脂培养基培养。但实验要求不是很严格时，可以用由酵母膏、蛋白胨、葡萄糖配置的培养基来培养；但酵母菌子囊孢子的观察要用麦氏培养基，其有利于子囊孢子的形成。 2、酵母菌的形态：酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片和水-碘液来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。 3、美蓝染色液：美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。 4、水-碘液染色液：该染液将革兰氏染液用碘液用水稀释4倍后得到的，亦可用于酵母形态和出芽生殖的观察。 4、子囊孢子的观察：酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，麦氏培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。 三、实验器材 1.菌种：酿酒酵母培养数天的酵母-麦氏培养基斜面 2.溶液与试剂：0.1% 吕氏碱性美蓝染液，5%孔雀绿，0.5%沙黄、95%乙醇，水-碘染液 3.培养基：酵母液体培养基，麦氏培养基。 4.仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯、接种环等。 四、实验步骤 1、酵母培养基的配置：蛋白质2%，酵母膏1%葡萄糖2%，加冷水100Ml，自然PH，在115℃下高压蒸汽灭菌30min。 2、接种和培养：无菌操作下，在灭菌的培养基中倒入少许酵母菌液即可。在28℃下培养48h 左右。 3、美蓝染色操作： 1>在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌液，混合均匀； 2>用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，避免产生气泡； 3>将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。 4>染色开始到过30min期间，观察死活细胞数量的变化； 4、水-碘液浸片法：滴加一滴水-碘液在载玻片的中央，无菌操作挑取少许酵母菌液至于染
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母双杂交试验流程
4月4日划线配培养基TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始8号8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5mlEP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O8.8ml
酵母双杂(共转)
酵母双杂交的原理及实验步骤 吴健2015.12.25 一酵母双杂交的原理 在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1 的转录。GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结 合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在 重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。酵母双杂交系统就是在 这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。除了 将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。 Fig1. 酵母双杂原理图
Fig2. 常用两种酵母菌的基因型 Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因
Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图
二酵母双杂交的基本步骤 1 酵母感受态的制备 配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。 1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌 落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种； 2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的 YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h； 3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震 荡培养20 h，直到OD 600 =0.3； 4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5； 5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块； 6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块； 7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec； 8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。制好的 感受态细胞应该立即使用（2 h 以内），不能长时间保存。 2 酵母小规模转化 2) 在预冷无菌的1.5 ml 的离心管中依次加入： 质粒DNA 0.5 μg herring testes carrier DNA（10mg/ml） 5 μl （使用前沸水煮5min，立刻放入冰上）感受态细胞50 μl 轻轻震荡混匀； 3) 加入0.5 ml 的PEG/LiAc 溶液，轻轻在振荡器上震荡混匀； 4) 在30℃水浴中孵育30 min，每隔10 min 混匀一次； 5) 加入20 μl 的DMSO（Dimethyl sulfoxide），42℃水浴热休克15 min，每隔5 min 混 匀一次； 6) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml YPD plus 液体培养基悬浮细胞块； 7) 30℃震荡培养90 min； 8) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml 的0.9%的NaCl 溶液悬浮； 9) 取1:10, 1:100, 1:1000 的稀释度涂皿；或者直接取100 μl涂于相应的SD平板上， 10) 30℃倒置培养直到单克隆长出，统计转化效率。挑取单克隆检测以及保存菌种， 备用。
(完整版)酵母菌实验
7.2 用酵母菌研究一个种群 实验原理 酵母菌繁殖快，是单细胞个体，常被用来研究种群。我们将观察在试管内肉汤培养基中的酵母菌种群的生长情况。 酵母菌的种群属于封闭种群类型。在自然条件下，开放种群的大小会随着生物个体的迁入或迁出而变大变小。在开放种群中，各种物质可通过种群进行循环。但在封闭种群中，情况有些不同，测定封闭种群的增长率比开放种群的增长率要容易得多。用浊度计测定培养液的浑浊度，就能知道酵母菌种群是如何随时间而发生变化的。通过细胞计数就可以知道酵母菌细胞的数量变化与浑浊度之间的关系。 目的要求 通过实验观察，说明种群是如何随时间而发生变化的。 学习酵母菌计数的方法以及取样法。 材料用具（2人一组） 2副护目镜；2支16mm×150mm有螺旋盖的试管，每支盛有10ml无菌肉汤培养液；2支18mm×150mm试管；盖玻片；有标尺的载玻片（2mm×2mm方格）；有刻度的吸量管（1ml）;滴管；比浊计或比色计；显微镜；试管架；玻璃标记笔；米尺；4张半对数坐标纸。 实验方法 请仔细阅读实验并提出3种假设，说明种群如何随时间而发生变化。把这些假设记在你的记录本上，并用你在实验中收集的数据对它们做出评价。 本实验采用的方法叫取样法—通过对样品中的酵母菌计数以估计试管中的种群大小。还可根据试管中培养液的浑浊度获得这一估算值。 实验步骤 实验从第0天—第7天。 （一）第0天： 1、在你的记录本上画好与表2.1类似的数据表。 2、用标记笔把两支螺旋盖的试管标上A和B，并在每支试管上标上你的组别。 表2.1酵母菌细胞的数目
3、教师将把0.1ml酵母菌贮存用培养物注入试管A中，轻轻倒转试管几次使酵母细胞分布均匀。试管B不加任何东西。将试管盖稍微拧松并将两支试管放在教师指定的地方。设置试管B的目的是什么？ 4、试管A中为刚开始增长的酵母菌新种群。就下周期间你认为可能会发生的变化评论你的假设。 5、为了确定酵母菌种群的增长速率，必须在实验过程中对酵母菌进行计数。拧紧试管盖将试管A轻轻倒转几次使酵母菌细胞分布均匀，然后用滴管从试管A中取出一滴培养液移到载玻片方格上，小心盖上盖玻片，不要有气泡。在显微镜高倍镜下进行镜检。 注意：观察酵母菌细胞时光线不要太强。 6、为了计算中央方格内酵母菌细胞的数目，先将方格左上部置于高倍镜下并记下酵母菌细胞数目，接着按顺时针方向分别统计方格右上部、右下部和左下部的酵母菌数，直到把整个方格内全部酵母菌数量统计完为止。要确保你所观察到的是酵母菌细胞而不是其他的什么东西。酵母菌细胞常常粘附在一起，但可以数出任何一个分离团块中的每一个细胞，酵母菌出芽时的芽体也应算为独立的个体。 7、至少要数300个细胞，如果少于300就应在原方格周围的另一方格内进行计数，直到达到300为止。用细胞数除以方格数即可得到每方格内的平均数。 8、为了知道每立方厘米（cm3）体积(1ml)内的细胞数，可用计得的细胞数乘以2500。这是因为每方格的面积是2mm×2mm,盖玻片下的培养液厚度是0.1mm,所以每方格的体积就是 2mm×2mm×0.1mm=0.4mm3,而1cm3=1000mm3,因此：细胞数 1000mm32500×细胞数 为了知道试管A中的细胞总数，可将最终获得的细胞总数乘以10，因为试管A中含有10ml 培养液。 9、让同组的另一人对一个新样品做同样的工作，将结果写在记录本上并计算两次计数的平均值。把第0天观察到的种群大小填写在你的数据表中。 10、对试管B重复步骤5—9。 11、使用比浊计测定两试管的浑浊度。算出读数的平均值，并将第0天的平均值写入你的资料表和班长的表格中。当酵母菌种群增长时你预测会出现什么情况？把你的预测写入记录本。 （二）第1—7天 13、多次倒转试管A使酵母菌细胞分布均匀，测定浑浊度，将第1天的平均值记在你的资料表和班长的表格中，对试管B重复同样的工作。 14、分别使用试管A和试管B中的一滴培养液重复步骤5—9的计数工作，并将第1天的结果写入你的资料表和班长的表格中。
蛋白的酵母双杂交操作手册大全
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
酵母菌发酵实验
酵母菌发酵实验 一、实验在教材中所处的地位与作用 本实验位于生物学八年级上册第五单元第五章第二节人类对细菌和真菌的利用。酵母菌在日常生活中很常用，可以用来发包子、馒头和酿酒，很具有代表性。该实验属演示实验，可直观地向学生展示酵母菌发酵现象，在实验过程中观察到液体中冒气泡，同时气球胀大，说明酵母菌发酵过程中产生了气体，与生活联系紧密，还可鼓励学生自己动手实践。 二、实验原型及不足之处 实验原型：生物学八年级上册教材P71 演示实验发酵现象在一杯温开水中加入一大勺糖和一小包酵母，进行搅拌。将这个杯子中的液体倒入透明的矿泉水瓶或玻璃瓶内，再往瓶内加一些温开水。将一个小气球挤瘪套在瓶口。将瓶子放在教室内的窗台上，每天观察瓶中的情况，看看瓶中的液体会不会冒出气泡，气球会不会胀大。 不足之处：该实验观察到液体中冒气泡，同时气球胀大，说明酵母菌发酵并产生了气体，但无法测知发酵过程中产生的是何种气体，也无法深入理解酵母菌在日常生活中的应用。 三、实验创新与改进之处 1、改用一个带橡胶塞的锥形瓶。 2、瓶口插一根“Y”形玻璃导管，排气端分别连挤瘪的小气球和橡胶管，橡胶管再连一根直的玻璃导管，橡胶管用夹子夹住。（见后图）
3、另用一个玻璃杯盛半杯澄清的石灰水，用来检测气体。 4、经过改进之后，就可以检测发酵过程中产生的是何种气体了。 四、实验器材 1、锥形瓶一个，“Y”形玻璃导管一根，直玻璃管一根，橡胶管一根，夹子一个，小气球一个，捆扎带一根，玻璃杯两个。 2、一杯温开水，一大勺糖，一小包酵母，半杯澄清的石灰水。 五、实验原理及装置说明 1、实验原理：酵母菌是兼性厌氧型真菌，喜欢含糖的环境，有氧时将葡萄糖分解成 co和水，无氧时将葡萄糖分解成酒精和二氧 2 化碳，同时都释放出能量。 2、装置如下图： 六、实验过程 1、在一杯温开水中加入一大勺的糖和一小包酵母，进行搅拌。将混合液倒入锥形瓶时，再将瓶内加一些温开水。
酵母菌的形态观察
【实验题目】 酵母菌的形态观察 【实验目的】 1.掌握酵母菌一般形态与细菌的区别 2.观察酵母菌的出芽生殖，区分酵母菌的死细胞和活细胞 3.学习酵母菌子囊孢子的观察方法 【实验器材】 1.菌种： 酿酒酵母2d麦芽汁斜面培养物 2.溶液和试剂： A) 0.1%吕氏碱性美蓝溶液、质量分数为95%的乙醇溶液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水 溶液、蒸馏水 B）香柏油、二甲苯 3.仪器及其它用品： 普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）等 【实验原理】 ?1、单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大部分采取出芽方式进行无性繁殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。 2、由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般采用美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。 3、采用美蓝染液水浸法可以对酵母菌的活细胞和死细胞进行鉴别。美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色，由于新陈代谢，活细胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型转变为无色的还原型，而死细胞或衰老细胞胞内还原性弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色，因此，用美兰染色后，活细胞呈无色，死细胞呈蓝色。 【实验内容及步骤】 1、酵母菌制片与简单染色--美蓝染液水浸片法 1)滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵母麦芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染液中，混合均匀。 2)用镊子取一盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。 3)将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据细胞颜色区分死细胞和活细胞。 4)染色30min后，再次观察，注意死活细胞的比例是否发生变化。 2、酵母菌子囊孢子的观察 1)涂片。先在洁净载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作挑取适量酵母菌菌体于蒸馏水中，混合均匀。 2)干燥固定。将载玻片在酒精灯上方来回移动，注意不要让载玻片距离火焰过近，以免烫死酵母菌细胞，可用手背反复试温度。 3)染色。孔雀绿染色 1-2min；水洗后用95%的乙醇溶液脱色30s；水洗后用番红染液复染1min；水洗后干燥。 4)镜检。将制好的装片放在显微镜下镜检，由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。【实验结果】 1、酵母菌死活细胞鉴定
文库构建及酵母双杂交技术
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
(完整版)酵母双杂交原理
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母单杂交-实验步骤总结
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。 （3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。 （4）95 ?C保温30 s，去除二级结构。 （5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 （7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。 （9）在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μL annealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μL BSA（10 mg/mL）0.5 μL Nuclease-free H2O 10.5 μL T4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL 总体积15 μL 注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。 （10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
酵母双杂交实验流程(精).doc
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
酵母双杂试验
pGBKT7和pGADT7不要同时转入细胞，要先转入一个，平板培养，挑单菌落做液体培养，再转入另一个质粒，同时转入两个质粒的效率太低。我做的时候转化率很高，从来没有出现过问题，转入第一个质粒（pGBKT7）通常在SD-Trp平板上可以有3000-4000个菌落，再转入pGADT7后，在双选择平板SD-Trp-Leu上至少也可以收获400-500个菌落。需要注意的是，细胞转入pGBKT7后，在-Trp上挑选单菌落做液体培养时，不要用YPD培养液，要用SD-Trp培养液，这样才可以使转化的细胞充分生长。 转化实验的条件也很重要，如果你觉得这中间有什么不放心，你可以把protocol发给我看看。我这里AH109长得很好，但实验室在国外，估计没法给你。 另外，你说AH109培养不好，是在什么选择平板上？在转完两个质粒以后做实验筛选时，应该先做LacZ和MEL1的显色，再做HIS3，最后做ADE2（因为ADE2的选择是最stringent 的）。还有什么问题可以继续问我。 1.YPDA配制方法如下： 先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ，加水885ml/L 另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，（如果量不多，也可以用50ml离心管）加水定容至100ml。以上两个瓶子同时灭菌：115摄氏度，20min 。 灭菌完后，再混合。最后加入已经过滤除菌的0.2％的ADE储液，15ml/L 。 121° 15min -80°取菌种，划线，30° 培养3天, 表面光滑而湿润，把平板用封口膜封好，4°冰箱保存，防止霉菌污染。 2.设置阴性对照最好用空载体，因为pGBKT7-Lam+pGADT7-T组成的阴性对照，在SD\-Trp-Leu-His 板上是能够生长的，但生长速度要比阳性对照慢好多。而Y187或AH109空菌株，在SD\-Trp-Leu-His 板上不能生长，这说明，阴性对照在三缺板上有背景生长。 常用试剂的配制 (1) Kana ( 50rng/ml)溶液的配制:2.5g卡那霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全 溶解后定容到50 ml, 0.22^011滤膜过滤除菌,-2(rC保存. (2) Amp(100rng/ml)溶液的配制:5g氨节青霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全溶 解后定容到50 ml, 0.22^m滤膜过滤除菌,-201保存. (3) 20%葡萄糖溶液的配制:20g葡萄糖溶于40ml去离子水中,待葡萄糖完全溶 解后定容至100ml,在超净工作台中用0.22^011滤膜过滤除菌,4°C保存。 (4) 0.2%腺噪呤半硫酸盐:0.03g腺嘿呤半硫酸盐溶于12ml去离子水中,待完 全溶解后定容至15ml,在超净工作台中用0.22^1111滤膜过滤除菌,4°C保存。 (5) 60%甘油的配制:60ml甘油,加人去离子水,定容到100ml,混匀后,121 °C高温蒸汽灭菌20min,4°C保存。 (6) Tris-乙酸(TAE)的配方: 50X储存液:242g Tris 碱+57.1 ml 冰乙酸+100ml0.5inol/LEDTA(pH8.0) 工作液:40mmol/L Tris-乙酸+lmmol/LEDTA YPD培养基 20g/L Difco peptone lOg/L Yeast extract 20g/L Agar(for plates only) 对于包含腺嚼呤的YPD (YPDA)培养基,每升培养基中可加入15ml0.2%的腺 噪呤半硫酸盐溶液(终浓度为0.003%)。 加水至900 ml,调pH值为6.5,然后高温蒸汽灭菌。待培养基冷却到55°C左右