生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程
生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程本规程适用于人用生物制品生产用动物细胞基质及检定用动物细胞，包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。细胞基质系指可用于生物制品生产的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。
生产非重组制品所用的细胞基质，系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。生产重组制品的细胞基质，系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。生产杂交瘤制品的细胞基质，系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。
一、对生产用细胞基质总的要求
用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定，须具有如下相应资料，并经国务院药品监督管理部门批准。
（一）细胞系/株历史资料
1.细胞系/株来源资料
应具有细胞系/株来源的相关资料，如细胞系/株制备机构的名称，细胞系/ 株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。
人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及健康状况及病原体检测结果的相关资料。
动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、
地域来源、年龄、性别、供体的一般健康状况及病原体检测结果的相关资料。
如采用已建株的细胞系/株，应具有细胞来源的证明资料。应从能够提供初始细胞历史及其溯源性书面证明材料的机构获得，且应提供该细胞在该机构的详细传代记录，包括培养过程中所使用的所有原材料的详细信息，如种类、来源、批号、生产日期及有效期、制备或使用方法、质量标准及检测结果等。
2.细胞系/株培养历史的资料
应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，外源插入序列，筛选细胞所进行的任何遗传操作或筛选方法、在动物体内传代过程以及细胞生长特征、培养液成分等。同时还应具有细胞鉴别、内源及外源因子检查结果的相关资料。
应提供细胞传代历史过程中所用的细胞培养液的详细成分并应具有朔源性。如使用人或动物源性成分，如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物或其他生物学活性的物质，应具有这些成分的来源、批号、制备方法、质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。
（二）细胞培养操作要求
细胞取材、建库及制备全过程应具有可溯源性及操作的一致性、并对各个环节的风险进行充分的评估。
1.细胞来源供体
所有类型细胞的供体应无传染性疾病或未知病原的疾病。神经系统来源的细
胞不得用于疫苗生产。
2.原材料的选择
与细胞培养相关的所有材料，特别是人源或动物源性材料，应按照本版药
典的相关要求进行风险评估，选择与生产相适应的原材料，必要时进行检测。所有生物源性材料均应无细菌、真菌、分枝杆菌、支原体及病毒等外源因子污染。细胞培养过程中所用的牛血清及胰酶应符合本版药典的相关要求。
细胞培养液中不得含有人血清。如果使用人血白蛋白，应使用获得国家药
品管理当局批准的人用药品。
用于生物制品细胞制备过程中不得使用青霉素或β-内酰胺(β-Lactam)类抗生素。配制各种溶液的化学药品应符合《中国药典》（二部）或其他相关国家标准的要求。
3.细胞培养体系：
应控制对细胞生长有重大影响的关键的已知可变因素，包括规定细胞培养液及其添加成分的化学组成及纯度，记录所有制备的培养用试剂并通过检定放行，规定细胞培养的理化参数（如pH、温度、湿度、气体组成等））的变化范围并进行监测，以保证细胞培养条件的稳定性。
4.细胞收获及传代
应结合生产工艺的特性，尽可能减少对细胞的操作。细胞收获及传代应采用可重复的方式,以保证收获时细胞的汇合率、孵育时间、温度、离心速度、离心时间以及传代后活细胞接种密度具有一致性。
传代细胞的体外细胞龄可采用细胞群体倍增水平或传代水平计算。
二倍体细胞的细胞龄通常以群体倍增水平计算，也可以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代粗略估算，即一瓶细胞传二瓶(1:2 分种率)，再长满瓶为一世代；一瓶传四瓶(1:4)为二世代；一瓶传八瓶(1:8)则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前 2/3 内。
连续传代细胞系的细胞龄可以群体倍增水平计算，也可以按照固定的传代比率进行传代，每传一次视为一代。
5.细胞系建立
如对细胞进行了对其特性有重要影响的操作，如具有了成瘤性，进行了细胞
克隆及遗传修饰等，这种细胞则应被视为一个新（或不同的）细胞系，应在原细胞名称后增加后缀或编号重新命名，并重新建立主细胞库。在细胞克隆过程中，应选择单个细胞用于扩增，详细记录克隆过程，并根据整合的重组 DNA 的稳定性、细胞基因组及表型的稳定性、生长速率、目的产物表达水平和完整性及稳定性，筛
选具有分泌目的蛋白最佳特性的候选克隆,可用于建立细胞种子。
6.细胞冻存
细胞应在大多数细胞处于对数生长期时进行冻存。应采用符合细胞培养物的最佳冻存方法；在每一次冻存时均应采用相同的降温过程，并记录每一次的冻存过程。
每一个细胞库冻存时，应将同一次扩增的处于相同倍增水平的细胞培养物合并，并在分装前混合均匀。每支冻存管中的细胞数应足以保证细胞复苏后可获得有代表性的培养物。
对于一个新的细胞库，除早代培养物在组织采集时或重组细胞筛选可能需要使用抗菌素外，细胞建库培养时不应使用抗菌素。
7.人员
生产人员应定期检查身体，已知患有传染性疾病的人员也不能进行细胞培养。在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作；在同一工作日进行细胞培养前，不得接触动物或操作有感染性的微生物
（三）细胞库
细胞库的建立可为生物制品的生产提供检定合格、质量相同、能持续稳定传代的细胞。
细胞建库应在符合现行药品生产质量管理规范（GMP）的条件下制备。
1.细胞库建立
细胞库为三级管理，即细胞种子、主细胞库及工作细胞库。。在某些特殊情况下，也可采用细胞种子及 MCB 二级管理，但须得到国务院药品监督管理部门的批准。
（1）细胞种子（Cell seed）
由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，于液氮或-130℃以下冻存，即为细胞种子，供建立主细胞库用。
对于引进细胞，生产者获得细胞后，冻存少量细胞，经过验证可用于生物制品生产，此细胞可作为细胞种子，供建立主细胞库用。
（2）主细胞库(MCB)
取细胞种子通过规定的方式进行传代、增殖后在特定倍增水平或传代水平同次均匀混合成一批，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下，经全面检定合格后，即可作为主细胞库，用于工作细胞库的制备，生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。
（3）工作细胞库(WCB)
工作细胞库的细胞由 MCB 细胞传代扩增制成。由 MCB 的细胞经传代增殖，达到定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下备用，即为工作细胞库。生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后细胞的传代水平应不超过批准用于生产的最高限定代次。所制备的 WCB 必须经检定合格（见本规程‘细胞检定’中有关规定）后，方可用于生产。
2.细胞库的管理
主细胞库和工作细胞库应分别存放。每一个库应在生产设施内至少 2 个不同的地点或区域存放。应监测并维护细胞库冻存容器以保证细胞库贮存在一个高度稳定的环境中。
非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。
每种细胞库均应分别建立台帐，详细记录放置位置、容器编号、分装及冻存数量，取用记录等。细胞库中的每支细胞均应具有细胞系/株名、代次、批号、
编号、冻存日期，贮存容器的编号等信息。
为保证细胞冻存后仍具有良好的活力，冻存前的细胞活力应不低于 90%，冻存后应取一定量的可代表冻存全过程的冻存管复苏细胞，复苏后细胞的活力应不低于 80%。二倍体细胞冻存后，应至少作一次复苏培养并连续传代至衰老期，检查不同传代水平的细胞生长情况。细胞冻存后，可通过定期复苏细胞及复苏后细胞的活力数据验证细胞在冻存及贮存条件下的稳定性。
（四）细胞检定
细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别、外源因子和内源因子的检查、成瘤性/致瘤性检查等。必要时还须进行细胞生长特性、细胞染色体检查、均一性及稳定性检查。这些检测内容对于 MCB 细胞和 WCB 细胞及生产限定代次细胞均适用。
细胞检定的基本要求见下表 1。细胞库建立后应至少对 MCB 细胞及生产终末细胞进行一次全面检定。当生产工艺发生改变时，应重新对 EOPC 进行检测。每次从 MCB 建立一个新的 WCB，均应按规定项目进行检定。
表 1、细胞检定项目要求
① 生产终末细胞:是指在或超过生产末期时收获的细胞，尽可能取按生产规模制备的生产末期细胞。
“+”为必检项目，“-”为非强制检定项目。
（+）需要根据细胞特性、传代历史、培养过程等情况要求的检定项目。
1.细胞鉴别试验
新建细胞系/株、细胞库(MCB 和 WCB)和生产终末细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞，且无其他细胞的交叉污染。细胞鉴别试验方法有多种，包括细胞形态、生物化学法(如同工酶试验)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性免疫血清)、细胞遗传学检测(如染色体核型、标记染色体检测)、遗传标志检测(如DNA 指纹图谱,包括短串联重复序列（STR）、限制片段长度多态性（RFLP-PCR）以及内含子多态性（EPIC-PCR）法等)以及其它方法（如杂交法、PCR 法、报告基因法等）。应至少选择上述一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属特性的鉴别。
2.细菌、真菌无菌检查
取混合细胞培养上清液或冻存细胞管样品，依法检查（附录 XII A），应符合规定。对于 MCB 及 WCB 培养物，至少取混合细胞培养上清液 10 毫升，尽可能采用薄膜过滤法检测。对于冻存细胞，至少取冻存细胞总量的 1%或至少 2 支冻存细胞管，可采用直接接种法检测。
3、分枝杆菌检查
取至少107 个活细胞用培养上清制备细胞裂解物，按照无菌检查法（附录XXX）进行分枝杆菌检查。
取细胞裂解物接种于适宜的固体培养基（如罗氏培养基（L?wensteinJensen medium）或 Middlebrook 7H10 培养基），每个培养基接种 1mL 并做 3 个重复。并同时以草分枝杆菌做为阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养 56 天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。
用于外源病毒检测的豚鼠接种法也可检测分枝杆菌，豚鼠法也可用于分枝杆菌检测，按表 2 所列方法进行试验和观察。豚鼠在注射前应观察 4 周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验，观察期末应进行结核菌素试验，并剖检观察主要脏器是否有节结形成。结核菌素试验为阴性，主要脏器无结节，为则符合要求。
分枝杆菌检查也可采用经过验证的分支杆菌核酸检测法替代培养法。
4．支原体检查
取细胞培养上清液样品，依法检查（附录 XII B），应符合规定。
5.细胞内、外源病毒因子检查
应注意检查细胞系/株中是否有来源物种中潜在的可传染的病毒，以及由于使用的原材料或操作带入的外源性病毒。细胞进行病毒检查的种类及方法，须根据细胞的种属来源、组织来源、细胞特性、传代历史、培养方法及过程等确定。如MCB 进行了全面检定，WCB 需检测的外源病毒种类可主要考虑从 MCB 到WCB 过程中可能引入的病毒，而仅存在于建MCB 前的病毒可不再重复检测。
5.1细胞形态观察及血吸附试验
取混合瓶细胞样品，接种至少 6 个细胞培养瓶或培养皿，待细胞长成单层或至一定数量后换维持液，持续培养两周。如有必要,可以适当换液。逐日镜检细胞，细胞应保持正常形态特征。
如为贴壁细胞或半贴壁细胞，细胞至少培养 14 天后，分别取 1/3 细胞培养瓶或培养皿，用 0.2%~0.5% 豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。一半加入红细胞后置2~8℃作用 30 分钟，一半置20~25℃作用 30 分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，结果应为阴性。
新鲜红细胞在2~8℃保存不得超过 7 天, 且溶液中不应含有钙或镁离子。
5.2体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子
用待检细胞培养上清制备活细胞或细胞裂解物，分别接种至少下列三种单层指示细胞，包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属同组织类型来源的细胞。待测样本检测前，可于-70℃或以下保存。
每种单层指示细胞至少接种 107 个活细胞或相当于 107 个活细胞的裂解物。接种量应占维持液的 1/4 以上，每种指示细胞至少接种 2 瓶。取培养 7 天的细胞各一瓶，取上清液或细胞裂解物再分别接种于新鲜制备的相应的指示细胞盲传一代，与初次接种的另一瓶细胞继续培养 7 天，观察细胞病变并在观察期末取细胞培养物进行血吸附试验、取细胞培养上清进行血凝试验。
用 0.2%~0.5% 豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验和血凝试验。将混合红细胞加入细胞培养瓶，一半置于2~8℃孵育 30 分钟，一半置于20~25℃ 孵育 30 分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况。取细胞上清从原倍起进行倍比稀释后，加入混合红细胞，先置2~8℃孵育 30 分钟，然后置于20~25℃孵育
30 分钟，分别观察红细胞凝集情况。
每种接种的指示细胞不得出现细胞病变，血吸附试验及血凝试验均应为阴
性。试验应设立病毒阳性对照，包括可观察细胞病变的病毒阳性对照、血吸附阳性对照及血凝阳性对照。如待检细胞裂解物对单层细胞有干扰，则应排除干扰因素。
若待检细胞已知可支持人或猴巨细胞病毒(CMV)的生长，则应在接种人二倍
体细胞后至少观察 28 天，应无细胞病变，且血吸附试验及血凝试验应均为阴性。
5.3动物和鸡胚体内接种法检测病毒因子
用待检细胞培养上清制备活细胞（或适宜时采用相当量的细胞裂解物），接
种动物体内进行外源病毒因子检测。待检细胞至少应接种乳鼠、成年小鼠和鸡胚(两组不同日龄)共计 4 组，如为新建细胞，还需接种豚鼠。原代猴肾细胞还需用家兔体内接种法或兔肾细胞培养法检查猴疱疹 B 病毒。按表 2 所列方法进行试验和观察。接种后 24 小时内动物死亡超过 20%，试验无效。
①经尿囊腔接种的鸡胚，在观察末期，应用豚鼠和鸡红细胞混合悬液进行直接红细胞凝集
试验。
②每只家兔于皮内注射 10 处，每处 0.1ml。
观察期内，如被接种动物出现异常或疾病应进行原因分析，观察期内死亡的动物应进行大体解剖观察及组织学检查，以确定死亡原因。如动物显示有病毒感染，则应采用培养法或分子生物学方法对病毒进行鉴定。（如观察期内超过 20%的动物出
现死亡，且可明确判定为因动物撕咬所致），试验判定为无效，应重试。
观察期末时，符合下列条件判为合格。
（1）乳鼠和成年小鼠接种组：至少应有 80%接种动物健存，且小鼠未显示可传播性因子或其它病毒感染；
（2）鸡胚接种组：卵黄囊接种的鸡胚至少应有 80%存活，且未显示有病毒
感染；尿囊腔接种的鸡胚至少应有 80%存活，且尿囊液血凝试验为阴
性；
（3）豚鼠接种组：至少应有 80%接种动物健存，且动物未显示有可传播性因子或其它病毒感染；
（4）家兔接种组：至少应有 80%接种动物健存，且动物未显示有可传播性因子或其它病毒感染（包括接种部分损伤）。
5.4逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测
可采用下列方法对待检细胞进行逆转录病毒的检测。
5.4.1逆转录酶活性测定：采用敏感的方法,如产物增强的逆转录酶活性测定法（PERT 或 PBRT 法）(本规程附录或其它适宜的方法，但灵敏度不得低于现行方法)。但由于细胞中某些成份也具有逆转录酶活性，因此，逆转录酶阳性的细胞，应进一步确认是否存在感染性逆转录病毒。
5.4.2透射电镜检查法
透射电镜检查：取至少1×107 个活细胞采用超薄切片法进行透射电镜观察。
5.4.3P CR 法或其它特异性体外法：根据细胞的种属特异性，在逆转录酶活性结果不明确或不能采用逆转录酶活性测定时，可采用种属特异性的逆转录病毒检测法，如逆转录病毒 PCR 法，免疫荧光法，ELISA 法等，逆转录病毒的定量 PCR 法还可用于逆转录病毒颗粒的定量。
5.4.4感染性试验：将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培养后检测。根据待检细胞的种属来源，须使用不同或多种的敏感细胞进行逆转录病毒感染性试验。
不同的方法具有不同的检测特性，逆转录酶活性提示可能有逆转录病毒，
透射电镜检查及特异性 PCR 法可证明是否有病毒性颗粒存在并进行定量，感染性试验证明是否存在有感染性的逆转录病毒颗粒，因此应采用不同的方法联合检测。若细胞逆转录酶活性检测阳性时，需进行透射电镜检查或 PCR 法及感染性试验，以确证是否存在感染性逆转录病毒颗粒。可产生感染性逆转录病毒颗粒，且下游工艺不能证明病毒被清除的细胞基质不得用于生产。
已知鸡胚成纤维细胞（CEF）或其它禽源性细胞含有逆转录病毒序列，常可
产生缺陷型逆转录病毒颗粒，逆转录酶活性为阳性，对这类细胞进行逆转录病毒
检测时，可直接检测细胞基质中是否存在外源性逆转录病毒污染，如禽白血病毒病毒、禽网状内皮病肿瘤病毒、感染性内源性逆转录病毒。在某些情况下，也可通过监测鸡群以保证无上述感染性逆转录病毒污染。
小鼠其他啮齿类动物来源的细胞系含有逆转录病毒基因序列，可能会表达内源性逆转录病毒颗粒，因此，对于这类细胞系，应进行感染性试验确定所表达的逆转录病毒是否具有感染性的。对于特定啮齿类细胞（如 CHO、BHK-21、NS0 和 sp2/0），且其收获液中是否有感染性逆转录病毒及其病毒颗粒的量，还应在生产工艺中增加病毒去除/灭活工艺。仅有高度纯化且可证明终产品中逆转录病毒被清除至低于现行检测方法的检测限下时，方可使用这类细胞。
5.5种属特异性外源病毒因子的检测
应根据细胞系/株种属来源、组织来源及供体健康状况等确定检测病毒的种类。若在MCB 或WCB 中未检测到种属特异性病毒，后续过程中不再进行重复检测。
鼠源的细胞系，可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验（MAP、RAP 及 HAP）检测其种属特异性病毒。
人源的细胞系/株，应考虑检测如人 EB 病毒、人巨细胞病毒（HCMV）、人逆转录病毒（HIV-1/2、HTLV-1/2）、人肝炎病毒（HAV、HBV、HCV）、人细小病毒B19、人乳头瘤病毒、人多瘤病毒、难培养的人腺病毒、人疱疹病毒-6/7/8 等。
猴源细胞系/株应考虑检测猴多瘤病毒（如 SV40）、猴免疫缺陷病毒（SIV）等。
这类病毒的检测可采用适当的体外检测技术，如分子检测技术，但所用方法应具有足够的灵敏度以保证产品的安全。
5.6牛源性病毒检测
若在生产者建库之前、细胞基质在建立或传代历史中使用了牛血清，则所建立的 MCB 或 WCB 和/或生产终末细胞至少应按照附录 IX 的要求检测一次牛源性病毒。待检细胞用培养上清制备成至少相当于 107 个活细胞/ml 的裂解物，进行检测。如果在后续生产过程中不再使用牛血清，且 MCB 和/或 EPC 检测显示无牛源性病毒污染，则后续工艺中可不再重复进行此项检测。
5.7猪源性病毒的检测
如果在生产者建细胞库之前，细胞基质在建立或传代历史中使用了胰酶，则所建立的 MCB 或WCB 和/或超过生产限定水平的细胞至少应检测一次与胰酶来源
动物相关的外源性病毒，包括猪细小病毒性病毒或牛细小病毒。如在后续生产过程中不再使用胰酶，且 MCB 和/或 EPC 检测结果显示无相关动物源性病毒污染，则后续工艺中可不再重复进行此项检测。如使用重组胰酶，应根据胰酶生产工艺可能引入的外源性病毒评估检测病毒的种类及方法。
5.8其它特定病毒的检测
根据细胞的特性、传代历史或培养工艺等确定检测病毒的种类，有些细胞对某些特定病毒易感，且上述检测方法无法检出，因此需要采用特定的方法检测，如 CHO 细胞检测鼠细小病毒的污染等。
6.成瘤性检查
成瘤性是细胞特性鉴定的一个参数，成瘤性检查是确定细胞基质在动物体
内是否能够形成肿瘤。
新建细胞系/株及新型细胞基质应进行成瘤性检查。
某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有成瘤性，而超过某代次则具有
成瘤性，如 Vero 细胞，则必须进行成瘤性检查。
用于疫苗生产的细胞系/株应进行成瘤性检查，但当未经遗传修饰的二倍体
细胞被证明无成瘤性后，可不做为常规检查要求。
已证明具有成瘤性的传代细胞，如 BHK21，CHO，HEK293、C127、NSO 细胞等，或细胞类型属成瘤性细胞，如杂交瘤细胞，用于生产治疗性产品时可不再作成瘤性检查。
按照本规程附录 2 进行成瘤性检查。如新建细胞或新型细胞基质具有成瘤性，
需采用定量的方法进一步分析细胞成瘤性的大小，并计算该细胞的半数致瘤量），并根据生产工艺及产品的特性，评估成瘤性的风险。
（TPD
50
体内法是成瘤性评价标准，但对于某些细胞，也可采用软琼脂克隆形成试验或器官培养试验等体外法检测细胞的成瘤性，特别适用于低代次时，在动物体内无成瘤性的传代细胞系。体外法的结果也可为细胞的成瘤性提供一定的参考数据。
7、致瘤性检查：
致瘤性检查是保证细胞基质中不存在可使细胞永生化并具有形成肿瘤的因子。细胞基质致瘤性可能由细胞 DNA（或其它细胞成份）或细胞基质中含有致瘤
性因子相关。来源于肿瘤的细胞或因未知机制形成肿瘤表型的细胞，含有致瘤性物质的理论风险性相对较高。
已建株的二倍体细胞，如 MRC-5、2BS、KMB
WI-38 及FRhL-2 新建主细胞库
17、
不要求进行致瘤性检查。
已建株的或有充分应用经验的连续传代细胞，如CHO, NS0, Sp2/0、低代次的Vero 细胞不要求进行致瘤性检查。
新型细胞系，特别是成瘤性为阳性的细胞，用于疫苗生产时，需进行致瘤性检查。
可采用待测细胞裂解物和/或细胞 DNA 按照本规程附录 3 的方法进行致瘤性检查。如根据细胞基质的表型或来源疑似有致瘤性病毒，建议用细胞基质裂解物接种动物进行致瘤性检查；若细胞基质具有成瘤性表型，建议用细胞 DNA 接种动物进行致瘤性检查。
对致瘤性检查中出现进行性结节的细胞基质，应开展进一步的研究鉴别致瘤性因子或致瘤性活性，并确定细胞的可适用性。
（五）生产细胞培养
生产用原材料的选择和细胞操作环境应符合本规程“细胞库的建立”中有关规定。
从冻存的 WCB 中取出一支或多支安瓿，混合后培养，传至一定代次后供生产用。其代次不得超过该细胞用于生产的最高限定代次。生产用细胞的最高限定代次应根据研究结果确定，但不得超过国际认可的最高限定代次。从 WCB 取出的细胞种子增殖的细胞不得再回冻保存用于生产。
二、连续传代细胞系的特殊要求
传代细胞系一般是由人或动物肿瘤组织或正常组织传代或转化而来，可悬浮培养或采用微载体培养，能大规模生产。这些细胞可无限传代，但到一定代次后，成瘤性会增强。应按本规程“细胞的检定”的规定进行细胞库的检查。对生产过程中细胞培养的要求如下：
1.用于生产的细胞代次
用于生产的传代细胞系，代次应有一定限制。用于生物制品生产的细胞最高限定代次须经批准。
2.生产过程中的细胞检查
除另有规定外，病毒类制品，在生产末期，取不接种病毒的细胞作为对照，
依法检查（附录 XII C），应符合规定。
三、人二倍体细胞株的特殊要求
新建的人二倍体细胞必须具有以下资料：建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明（医师出具的健康状态良好、无潜在性传染病和遗传性疾患等证明），以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面调查资料。
人二倍体细胞株应在传代过程的早期，选择适当世代水平（2-8 世代）增殖出大量细胞，定量分装后，置液氮中或–130℃下冻存，供建立 PCB 之用，待全部检定合格后，即可正式定为 PCB，供制备 MCB 用。
1.染色体检查及判定标准
新建人二倍体细胞株及其细胞库必须进行染色体检查。对于已建株的人二倍体细胞株，如 WI-38、MRC-5、2BS，KMB17 等，在建立 MCB 时可不必进行细胞染色体检查。但如对细胞进行了遗传修饰，则须按新建细胞株进行染色体检查。
（1）染色体检查
新细胞建株过程中，每 8~12 世代应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有 4 次染色体检查结果。每次染色体检查，应至少
随机取 1000 个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作记录以
备复查。其中至少选择 50 个分裂中期细胞进行显微照相，做出核型分析，并应粗数 500 个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。
每次染色体检查，应从同一世代的不同培养瓶中取细胞，混合后进行再培养，制备染色体标本片。染色体片应长期保存，以备复查。
可用 G 分带或 Q 分带技术检查 50 个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。
（2）判定标准
对1000 个和500 个中期细胞标本异常率进行检查，合格的上限(可信限 90% Poison 法)如表 3。
①亚二倍体如超过上限，可能因制片过程人为丢失染色体，应选同批号标本重新计数。
②一个中期细胞内超过 53 条染色体，即为一个多倍体。
2.无菌检查
每8~12 世代细胞培养物，应进行无菌检查，依法检查（附录 XII A），应符合规定。
3.支原体检查
每8~12 世代细胞培养物，应进行支原体检查，依法检查（附录 XII B），应符合规定。
4.病毒检查
二倍体细胞株传代过程中，至少对 2 个不同世代水平进行病毒包含体及特定人源病毒检测（见本规程一（四）5.5 项），结果应均为阴性。
5.成瘤性检查
每 8~12 世代应作一次成瘤性检查，（方法见本规程“细胞库细胞的检定”项下“成瘤性检查”），结果应无成瘤性。
6.生产过程中的细胞检查
除另有规定外，在生产末期，取不接种病毒的细胞作为对照，进行以下各项检定，应符合规定。
（1）染色体检查
可根据制品特性及生产工艺，确定是否进行生产过程中细胞的染色体检查。通常含有活细胞的制品或下游纯化工艺不足的制品，应对所用细胞进行染色体检查及评价。（见本规程“细胞库细胞的检定”项下“染色体检查及判定标准”）。但如采用已建株的人二倍体细胞生产，则不要求进行染色体核型检查。
（2）细胞鉴别试验
按本规程“细胞的检定”项下细胞鉴别试验进行。生产用细胞每年应至少进行一次该项检定。
（3）无菌检查
依法检查（附录XII B），应符合规定。
（4）支原体检查
依法检查（附录 XII B），应符合规定。
（5）对照细胞外源病毒因子检测
依法检查（附录 XII C），应符合规定。
四、重组细胞的特殊要求
重组细胞系通过 DNA 重组技术获得的含有特定基因序列的细胞系，因此重组细胞系的建立应具有细胞基质构建方法的相关资料，如细胞融合、转染、筛选、集落分离、克隆、基因扩增及培养条件或培养液的适应性等方面的资料。细胞库细胞的检查除应按本规程“细胞的检定”的规定进行，还应进行下述检查：1细胞基质的稳定性
生产者须具有该细胞用于生产的目的基因的稳定性资料，稳定性检测的项目及方法依据产品的特性确定，对于细胞基质来说，稳定性的分析是保证
MCB/WCB 与 EPC 之间的一致性，包括：重组细胞的遗传稳定性（如插入基因拷贝数、插入染色体的位点、插入基因的序列等）、目的基因表达稳定性、目的产品持续生产的稳定性，以及一定条件下保存时细胞生产目的产品能力的稳定性等资料。
2鉴别试验
除按本规程“细胞鉴别试验”进行外，还应通过检测目的蛋白基因或目的
蛋白进行鉴别试验。
五、原代细胞的要求
原代细胞应来源于健康的动物脏器组织或胚胎，包括猴肾、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾或动物的胎儿和其他组织，以及鸡胚和鹌鹑胚等正常组织，以适当的消化液消化、分散组织细胞进行培养，原代细胞不能建立细胞库，只能限于原始培养的细胞或传代少数几代内（一般不超过 5 代）使用，无法事先确定细胞代次。因此，只能严格规范管理和操作措施，以保证以原代细胞为基质所生产的制品质量。
（一）动物组织来源和其他材料
1．动物组织来源
应符合“凡例”的有关要求。对各种动物都应有明确健康状况和洁净级别
要求。
2．生产或检定用猴
多采用非洲绿猴、恒河猴等，我国以恒河猴为主。应为笼养或小群混养的正常健康猴。动物用于制备细胞前，应有 6 周以上的检疫期，检疫期中出现病猴或混入新猴，应重新检疫。从外面新引入猴群应作结核菌素试验及猴疱疹 I 型病毒(B 病毒)的检查。
胎猴肾可用于生产，对其母猴应进行检疫。
（二）原代细胞培养物的检查
用于细胞制备的动物剖检应正常，取留的器官组织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。
1.细胞培养原材料检查及细胞培养操作
按本规程“细胞培养操作要求”项进行。
2.细胞培养物的检查
（1）细胞形态检查
细胞在接种病毒或用于生产前，其培养物均应进行外观检查和镜检，应无任何可疑、异常和病变，否则不得用于生产。
（2）特定病毒检查
原代猴肾细胞培养应检查 SV40 病毒、猴艾滋病毒和 B 病毒；应采用 Vero 或原代绿猴肾细胞、兔肾细胞检查。地鼠肾原代细胞应采用 BHK21 细胞培养检查。观察细胞形态，如有可疑应在同种细胞上盲传一代继续观察。
（3）对照细胞检查
依法检查（附录 XII C），应符合规定。
六、检定用细胞的要求
检定用细胞是指用于生物制品检定的细胞，包括原代细胞、连续传代细胞或二倍体细胞，以及经特定基因修饰过的细胞。检定用细胞的质量对检定结果的判定具有重要的影响，为保证检定结果的有效性、可靠性及真实性，检定用细胞应符合下列要求：
（一）细胞资料
1.检定用细胞应具有明确的合法来源，及相关的来源证明资料。
2.如使用传代细胞系/株，应建立细胞库体系，即主细胞库及工作细胞库，
如细胞使用量较少，可建立单一主细胞库。应根据制品特性，在保证检测结果可靠性的基础上，通过验证确定该细胞允许使用的最高限定代次，在此基础上规定检定用细胞的代次范围。检定时从工作细胞库复苏细胞后，不能再回冻。
3.应详细记录检定用细胞建库的过程，包括细胞培养所用原材料的来源、批号，细胞生长液的配制方法、使用浓度等，以及细胞的传代及冻存过程，并建立细胞冻存及使用台账。
（二）细胞检定
应至少进行以下 1-3 项检定，根据检定用细胞用途的不同，还应按照 4 项下的有关要求进行相关的检定。
1、细胞鉴别试验
按本规程“一（三）1”项进行，或其他适宜的方法，应确认为本细胞，并且无其他细胞的交叉污染。
2、无菌检查
依法检查，应符合要求（附录 XII A）。
3、支原体检测
依法检查，应符合要求（附录 XII B）。
4.外源病毒污染检查
采用本规程“一（三）5.2”项及本规程“一（三）5.3”项检查，应无外源病毒污染。
5、其他检测：
（1）成瘤性检查：
用于成瘤性检查的阳性对照细胞，应采用本规程“一（三）6”项进行检查，应具有成瘤性。
（2）病毒敏感性检查：
用于检测活疫苗制品病毒滴度的细胞，应进行此项检查，证明所用细胞具有足够的相应病毒敏感性。
（3）细胞功能检查：
用于测定生物学活性、效力或效价测定的细胞，应进行此项检查，证明所用细胞能够有效评价待检样品质量。
附录 1
逆转录酶活性检查法
本法系以噬菌体MS2RNA 为模板，经反转录后再采用实时荧光定量PCR 法检测特异性扩增信号，从而测定供试品中的逆转录酶活性。
试剂
(1)供试品稀释液(A 液)
每 1L A 液含三羟甲基氨基甲烷－盐酸（Tris-HCl,pH7.5）25mmol,氯化钾50mmol, 二硫苏糖醇(DTT) 5mmol,四甲基乙二胺（EDTA）0.25mmol, TritonX-100 25ml,甘油 500ml。配制时，最后添加 DTT，混合后分装，-20℃保存，备用。
(2)供试品保存液(Ｂ液)
每 1L A 液中含 1mg 亮抑蛋白酶肽、0.7mg 抑胃肽及 1mg 抑蛋白酶肽。
(3)引物及探针序列
上游引物：5’-AAC ATG CTC GAG GGC CTT A-3’
反转录及下游引物：5’-GCC TTA GCA GTG CCC TGT CT-3’
探针：5’-(FAM)-CCC GTG GGA TGC TCC TAC ATG TCA-（TAMRA）-3’
(4)模板噬菌体MS2RNA(MS2 RNA)
(5)反转录缓冲液每 1L 反转录缓冲液含 Tris-HCl(pH8.3) 50mmol, 氯化钾 40mmol, 氯化镁 6mmol, DTT 2mmol，脱氧核糖核苷酸 200μmol,下游引物0.8×10－3 mmol。
(6)扩增缓冲液可采用市售荧光定量 PCR 混合液（Mix），每 30μl 反应体系中，加入上、下游引物各0.67×10－3 mmol，探针0.2×10－3 mmol，核糖核酸酶 A 10μg。若 Mix 中不含有 Taq DNA 聚合酶，可加入 24U 的 Taq DNA 聚合酶。供试品、阳性对照及灵敏度样品的制备
(1)取供试品 200μl，每分钟 5000 转离心 5 分钟，取上清液 100μl，加入
B 液 100μ l 和焦炭酸二乙醇（DEPC）处理的 5%Triton X-1002μ l，混匀后，置冰浴 15 分钟后，置-70℃保存备用。
(2)阳性对照用SP2/0 细胞培养上清液作阳性对照，同上处理后，按单次使用量分装，-70℃保存备用。
(3)标准曲线及灵敏度样本制备：
取 0.5ul M-MLV（200U/μ l）加到 99.5ul Buffer A 中，上下吹打 10 次并涡旋混匀，即将 M-MLV 稀释为 1012pU/ul（1U/ul）。以此样本为初始样本，取 5ul 至 45ulBuffer A 中，上下吹打 10 次并涡旋混匀，如此方法进行 10 倍系列稀释至103pU/ul，每次稀释时均采用新吸头吸取样本。
取 104pU/ul~109pU/ul 稀释度的 M-MLV 作标准曲线。104pU/ul 稀释度样本作为灵敏度对照。置冰浴备用。
检查法
（1）反转录
将已处理的供试品及阳性对照用 A 液作 10 倍稀释。
反转录反应管中加入反转录缓冲液 19.7μ l，500μ g/μ lMS2-RNA 0.3μ l，混匀后，标记，70℃放置 10 分钟，置冰浴。
在相应的反转录反应管中分别加入 5μ l 已稀释的标准曲线样品、供试品、阳性对照及灵敏度样品，以 A 液作阴性对照。反转录反应体系为 25μ l。37℃反应4 小时。
（2）实时荧光 PCR 扩增
取反转录产物 5μl 加至实时荧光 PCR 扩增缓冲液 25μl 中，反应总体系为30μl。混匀后，按下列条件进行扩增：37℃7分钟，预变性95℃5分钟，然后95℃20秒，57℃60秒，72℃10秒，进行 50 个循环，在57℃时采集信号，最后72℃延伸 2 分钟。
结果判定
（1）实验方法灵敏度认可标准：
灵敏度分析：分别检测 104、103pU/μ l 样品各 10 个重复。至少 104pU/μ l 的样品应全部检出（10/10），实验方法的灵敏度为合格。
（2）试验有效性：
标准曲线 R 应不低于 0.960，阳性对照应为阳性，Ct 值应≦28。灵敏度对照应为阳性，Ct 值应≦38。视为试验有效。
（3）待测样本结果判定：
①如果待测样本无 Ct 值结果.或 Ct 值≧40，且无明显的扩增曲线，则待测样本中逆转录酶活性判定为阴性。
②如果待测样本的 Ct 值结果<40，且有明显的扩增曲线，则按照下式计算样本中逆转录酶活性单位：待测样本中逆转录酶活性单位（pU/ml）=A*D*1000 其中：A 为测定值（pU/ul）， D 为样本稀释倍数，D=20，
注意事项
（1）如供试品为培养细胞，则将细胞传代后，培养 3-4 天长成单层，取上清检测，取供试品前不得换液。
(2)试验中所有试剂及吸头均需灭菌。与 RNA 操作有关的试剂及材料均需经过DEPC 处理。
（3）标准品稀释时，用新吸头吸取上一个稀释度样本加至下一个稀释管中，
反复吹吸 10 次，并涡旋混合均匀，然后换新吸头进行下一个稀释。
(4)与样本相关的操作建议使用带滤心吸头，并注意实验分区。
(5)定期对各区进行消毒，PCR 产物及其加供试品吸头应及时进行有效处理。
附录 2
成瘤性检查法
成瘤性是指待检细胞接种动物后，接种细胞在动物体内形成（肿）瘤的过程，成瘤性检查的目的是确定细胞基质接种动物后能否形成（肿）瘤。
待检细胞制备：从 MCB 或 WCB 复苏细胞，扩增至或超过生产用细胞龄限制代次10 代以上，收获细胞并悬于无血清液体中（如PBS），制备成浓度为每 1ml 含5×107 个活细胞的待检细胞悬液，细胞活力应不低于 90%，用于成瘤性检测。
阳性对照细胞：用 Hela 或 Hela S3 细胞或其它已知成瘤性为阳性的细胞，扩增至所需细胞量，用与待检细胞相同的液体悬浮细胞，并制备成浓度为每 1ml 含5×106 个活细胞的悬液，细胞活力应不低于 90%，做为阳性对照细胞。
阴性对照细胞：如需要，可用人二倍体细胞作为阴性对照，扩增至所需细胞量，用与待检细胞相同的液体悬浮细胞，制备成浓度为每 1ml 含5×107 个活细胞的待检细胞悬液，细胞活力应不低于 90%，作为阴性对照细胞。
动物：下述两种动物可任选其一：
① 裸鼠：4~7 周龄，尽量用雌鼠，每组至少 10 只。如使用新生裸鼠，则为
3~5 日龄。
修订实验动物概念的定义对中国实验动物行业发展的
2016年2月第26卷 第2期 中国比较医学杂志 CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE February,2016Vol.26 No.2 [基金项目]国家外国专家局访问学者项目(编号:GG143700014)。 [通讯作者]金东庆(1964-),男,研究员,硕士,研究方向:实验动物,133********,dongqing_jin@https://www.360docs.net/doc/5e6301502.html,。 “实验动物国家标准论坛”专题 修订实验动物概念的定义对中国实验动物 行业发展的重要性和意义探讨 金东庆1袁朱 冠2 (1.山东省实验动物中心/山东省医学科学院,济南250002;2.Department of Veterinary Pathobiology,College of Veterinary Medicine &Biomedical Sciences,Texas A&M University,Texas 77843-4467,USA) 【摘要】 中国实验动物行业经过30多年的发展逐步形成一个独立的、完整的、封闭的生产、使用和管理体 系,科学准确的实验动物概念不仅对实验动物行业本身,对动物生产和使用、保护、福利和伦理,对生命科学及相关行业和产业,科学普及和教育等事业都有着十分重要的意义和作用。通过我国实验动物的概念同美国的相比较,发现我国实验动物的概念存在定义不到位,范围不清晰,界限模糊等问题,造成生产、使用和管理中的一系列困惑和难题,影响和限制了实验动物行业的发展,也给相关行业带来了严重的后果和影响。因而适时修改实验动物概念的定义是必要的,有着积极的、现实的、客观的作用和影响。 【关键词】 实验动物概念;实验动物相关定义;标准化;行业发展影响 【中图分类号】R?33 【文献标识码】A 【文章编号】1671?7856(2016)02?0022?05doi:10.3969.j.issn.1671-7856.2016.02.005 Necessity and importance of amendment of the key concepts of laboratory animals in China JIN Dong?qing 1,ZHU Guan 2 (1.Shandong Laboratory Animal Center /Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 25002,China;2.Department of Veterinary Pathobiology,College of Veterinary Medicine &Biomedical Sciences, Texas A&M University,Texas 77843-4467,USA) 【Abstract 】 Laboratory animal industry forms an independent,comprehensive system responsible for the production,use and management of laboratory animals.Great advances have been made in this field in China over the more than thirty years of development.However,due to the great development and changes during this long time,there are also some issues which need to be amended and changed.To compare the concepts of experimental animals in China and developed countries such as USA.The key concepts on the laboratory animals are not well or clearly defined in the regulatory documents in China,which hinder the healthy development and effective regulation in this field,as well as the care and use of laboratory animals in research and education.In this article,we discuss the necessity of timely amendment and standardization of the key concepts and definitions related to laboratory animals,and the importance and impact of the key concepts on the development of animal industry in China. 【Key words 】 Laboratory Animal,concepts;Standardization of definitions;Impact on animal industry development
动物细胞工程知识点
动物细胞工程12月20日 动物细胞工程常用技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1、定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 2、原理：细胞增殖 3、过程 分散成单个细胞， 制成细胞悬液 注意： ①10代以内细胞保持正常的二倍体核型，无突变发生，常用于实践或冷冻保存。 ②超过50代，极少数细胞突破自然寿命极限，突变成癌细胞，具有无限增殖能力；若超过50代，细胞不再增殖，全部死亡，则说明细胞没有发生癌变。 ③分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。 思考回答： ⑴、为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养? 答：其细胞的分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 ⑵、动物细胞培养需要脱分化吗?为什么? 答：不需要。因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以没有类似植物组织培养的脱分化过程，要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 ⑶、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分?用胃蛋白酶行吗? 答：主要是蛋白质，不行，因为胃蛋白酶作用的适宜PH约为2，当ＰＨ大于6时就会失去活性，多数动物细胞培养适宜PH为7.2－7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。（胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2－8.4，胰蛋白酶活性较高） ⑷、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗?为什么?
答：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤，因此必须控制好消化时间。 ⑸、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 4、重要概念 ①细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 产生原因：培养贴附性细胞时，细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖。 培养要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于贴附。 ②细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 ③原代培养：动物组织消化后的初次培养 ④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。 5、培养条件： ⑴无菌无毒环境：无菌——对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素。；无毒——定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对自身造成危害。 ⑵营养： 成分：所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分。 培养基类型：合成培养基（将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基） ⑶温度和pH值：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜，多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ⑷气体环境：通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95％空气加5％CO2的混合气体的培养箱中进行培养。O2：是细胞代谢所必需的CO2主要作用是维持培养液的pH。 6、应用：生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。基因工程中受体细胞的培养。用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。
兽用生物制品及分类
兽用生物制品的分类与使用 一、兽用生物制品的分类 兽用生物制品指应用微生物学、寄生虫学、免疫学、遗传学和生物化学的理论和方法制成的菌苗、疫苗、虫苗、类毒素、诊断制剂和抗血清等制品。用于预防、治疗、诊断畜禽等动物特定传染病或其他有关的疾病。我国现生产的品种已有近200个，最常用的有几十个品种，按照其用途分为以下三大类： （一）预防用生物制品包括疫苗、菌苗、虫苗和类毒素。 1.疫苗疫苗是利用病毒经除去或减弱它对动物的致病作用而制成的。疫苗可分为两类：一类是活毒或弱毒疫苗。制成这种疫苗的病毒毒力必须是减弱了的，没有致病能力，也不会使动物发生严重反应。如猪瘟兔化弱毒冻干疫苗、鸡新城疫活疫苗等。另一类是死毒疫苗或灭活疫苗。制成这种疫苗的病毒已被化学药品或其他方法杀死或灭活。如猪口蹄疫O型灭活油佐剂疫苗、鸡产蛋下降综合征灭活疫苗等。 2.菌苗菌苗是利用病原细菌经除去或减弱它对动物的致病作用而制成的。菌苗可分为两类：一类是毒力减弱的细菌制成的活菌苗，如Ⅱ号炭疽芽胞苗、布鲁氏菌Ⅱ号活菌苗等；另一类是用化学方法或其他方法杀死细菌制成的死菌苗，如猪丹毒灭活疫苗、鸡大肠杆菌病灭活疫苗等。 3.虫苗虫苗是利用病原虫体除去或减弱它对动物的致病作用而制成的。常将菌苗、疫苗、虫苗通称为疫苗。 4.类毒素某些病原细菌，在生长繁殖过程中产生对动物有害的毒素，用甲醛等处理后除去它的有害作用，使动物注射后产生抵抗该细菌的能力，这类处理过的毒素，叫类毒素，如破伤风类毒素。 （二）治疗用生物制品包括抗血清和抗毒素。 1.抗血清动物经反复多次注射某种病原微生物时，会产生对该病原微生物的高度抵抗能力。采取这种动物的血液提出血清，经过处理即可制成抗
中国实验动物学报
‘中国实验动物学报“2018年总目次 2018年一第26卷一1~6期 第1期 MiR-31转基因小鼠的构建及其在组织器官的表达付明阳,王春芳,李宵,等(1) …………………………………鱼腥草素钠对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织 一PI3K二AKT1及mTOR mRNA 表达的影响吴中华,闫玲玲,杨爱东,等(8) ………………………………………抑制外周神经元PAR2-PKA /PKCε通路对痛转化模型一大鼠痛阈的影响房军帆,王思思,孙海榉,等(13)………反复注射顺铂诱导小鼠慢性肾功能不全模型的建立黄统生,郭赟,杨陈,等(20)……………………………………基于胰腺癌患者来源异种移植模型的化疗药物筛选张贺,陈薛,张彩勤,等(29)……… ……………………………复方贞术调脂胶囊调控MEKK2-Wnt 偶联拮抗β-catenin 一泛素化改善大鼠糖皮质激素骨质疏松症洪郭驹,陈鹏,韩晓蕊,等(36)……………………………………………NOD 小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性舒冠男,滕夏虹,许倩倩,等(45)………………………………亲和吸附材料特异性清除肠源性内毒素有效性和 一安全性探讨向勇平,崔辉,刘丹,等(52)…………………半胱氨酰白三烯受体拮抗剂通过下调自噬减轻长爪沙鼠一的全脑缺血再灌注损伤石巧娟,郭红刚,楼琦,等(57) ………………………………………………………………大气细颗粒物致炎动物模型系统评价侯天芳,马元元,王广发(65)……………………… ……………………………雌二孕激素对牛子宫内膜上皮细胞αvβ3体外诱导 一差异表达的影响詹同彤,潘兴乾,王彦平,等(72)………食蟹猴肌肉萎缩模型的建立刘雪萍,李振明,邓信宁,等(79)…………………………………………………………豚鼠频闪光诱导性近视和形觉剥夺性近视外侧膝状体一多巴胺含量的比较佘曼,李炳,李涛,等(86)……………大鼠荷子宫肌瘤组织移植瘤模型的建立宋阳,甄玉花,关永格,等(91)………………………………………………自然衰老过程中SD 大鼠免疫系统结构功能的变化朱华,于品,徐艳峰,等(95)……… ……………………………大鼠腰椎腹侧神经根牵拉模型的建立刘吉宏,葛立军,陈焱,等(101)……………………… …………………………金思维对东莨菪碱致记忆障碍小鼠脑胆碱能系统的影响董云芳,冯慧利,陈芳,等(107)… …………………………高脂饲料喂养时间对2型糖尿病肾病大鼠模型的影响高雪,安至超,何其英,等(114)…… …………………………清燥救肺汤及其分解剂对肺炎支原体感染小鼠肺部炎症一相关因子的影响吴振起,敏娜,岳志军,等(120)………糖尿病足神经病变动物模型研究进展李丹,陈龙菊(128) ………………………………………………………………产后抑郁动物模型及行为学评价方法研究进展唐娅辉,曾贵荣,吴莉峰,等(133)…………… ………………………‘中国实验动物学报“‘中国比较医学杂志“入选网络首发首批示范期刊(51)………………………………………………会讯(132) (2) C57BL /6J 小鼠黑色素瘤肺转移模型的构建孟星君,李孝东,刘俊,等(139) …………………………………………硫辛酸合成酶在Lepr db /db 小鼠肝肾中的表达彭强,赵英政,闫婷婷,等(145)……………… …………………………模式生物海洋青鳉鱼的视觉结构与功能发育陈剑明,刘肖岑,徐永健(150)……………… …………………………中国地鼠口腔颊黏膜癌中miRNA 与mRNA 表达谱一的关联分析李莉红,庞文彪,常凯,等(158)……………WHBE 兔与日本大耳白兔腹泻型肠易激综合征模型一的肠道菌群研究徐孝平,徐剑钦,黄俊杰,等(165)……维吾尔医异常黑胆质证大鼠模型的尿液代谢组研究米热阿依四亚力昆,……… ………………………………………阿合尔扎马尼四麦麦提,巴哈古力四阿卜都热合曼,等(174)移植不同饲料利用效率猪的粪便可定向改变 一伪无菌小鼠的生长性能李天天,何贝贝,李娜,等(181) ………………………………………………………………实验室饲养和野外生存条件下东方田鼠肠道菌群 一的多样性冯洁,沈志敏,王胜昌,等(188)………………系统性红斑狼疮小鼠肠道微生物与抗dsDNA 抗体水平
常州生物制品产业园建设项目可行性报告
常州生物制品产业园建设项目 可行性报告 规划设计/投资方案/产业运营
常州生物制品产业园建设项目可行性报告 茶多酚广泛存在与各类茶之中，可以通过萃取方式、树脂吸附方式和离子沉淀方式从茶叶中提取茶多酚物质。茶多酚因为化学结构中存在大量的酚羟基而具有非常强的抗氧化能力，其抗氧化能力远远超过常见的抗氧化剂，如VC、VE和人工合成抗氧化剂BHT、BHA，并且茶多酚在使用时只需要少量的使用就可以达到很好的效果，另外由于其化学结构的特点，该物质在具有抗氧化能力的同时对食品中的色素和营养物质起到一定的保护作用，能够使食品药品及其他生活用品能够在较长时间内保持新鲜，且不会有潜在的副作用。 该茶多酚项目计划总投资9014.32万元，其中：固定资产投资6592.22万元，占项目总投资的73.13%；流动资金2422.10万元，占项目总投资的26.87%。 达产年营业收入18867.00万元，总成本费用14944.34万元，税金及附加173.14万元，利润总额3922.66万元，利税总额4636.86万元，税后净利润2941.99万元，达产年纳税总额1694.86万元；达产年投资利润率43.52%，投资利税率51.44%，投资回报率32.64%，全部投资回收期4.56年，提供就业职位419个。
项目建设要符合国家“综合利用”的原则。项目承办单位要充分利用 国家对项目产品生产提供的各种有利条件，综合利用企业技术资源，充分 发挥当地社会经济发展优势、人力资源优势，区位发展优势以及配套辅助 设施等有利条件，尽量降低项目建设成本，达到节省投资、缩短工期的目的。 ...... 茶多酚作为一种新型的抗氧化剂，是目前最具应用前景的天然添加剂，广泛应用于医药、医疗保健、食品行业、日用化学品、农业生产等方面。 近几年，茶多酚市场需求愈发强劲，2014年我国茶多酚市场销售总量约为2850吨，到2015年我国茶多酚市场销售总量达到3233吨。其中有60%以 上的茶多酚销往国外市场。
高中生物 动物细胞培养和核移植技术教案 新人教版选修3
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
动物细胞工程
细胞工程第一讲 一、概述 1、细胞工程（cell engineering ）定义 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、细胞工程的研究内容 （1）动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。 （2）细胞融合 改良性状，培育新品种 （3）染色体工程 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 （快速繁育和产物大量制备） （改良性状，培育新品种） （培育新品种，单倍体和多倍体） （获得人们需要的成体） （无性繁殖，改变性状） 克隆 转基因技术
主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦 （4）胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 （5）细胞遗传工程 克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 （1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 （2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 （1）萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试（20世纪初-30年代中期）德国植物生理学家Haberlandt在1902年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，
兽用生物制品概述
兽用生物制品概述 兽用生物制品是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质。这类物质专供相应疾病的诊断、预防和治疗之用。从狭义上讲，可将用于畜禽疾病的诊断、检疫、治疗和免疫预防的诊断液、疫苗和抗血清统称为兽用生物制品。 一、生物制品简史 自11世纪起，我国就有峨嵋山人用天花病人的痂皮接种儿童鼻内或皮肤划痕以预防天花的记载，以后又相继传到日本和欧洲，这种种痘术被视为生物制品创制及主动免疫的雏型。1976年英国医生詹纳根据种痘术的启示，用牛痘浆或痘痂给人接种预防天花，发明了牛痘疫苗，在英语中也由牛痘（Vaccinia）而延伸为疫苗(Vaccine）。其后，法国免疫学家巴斯德在1881年及其之后的工作中，用理化方法以及生物学方法，减低病原微生物毒力，相继研制成了用减毒株制成的炭疽芽孢苗、连续通过兔体获得的减毒狂犬病疫苗以及减毒禽霍乱和猪丹毒，为免疫学和生物制品学奠定了基础。1889年耶森等从白喉杆菌培养物滤液中分离到白喉菌素，免疫小鼠和家兔后在血清中发现有中和白喉菌素的物质，从而创制了抗毒素血清，用于治疗感染，使之获得被动免疫，这一血清学的发现为以后制备各种被动免疫血清提供了科学依据。贝菲福和科勒在1898年提出制造灭活苗的方法。罗曼在1923年用加热或福尔马林溶液使一些细菌的蛋白毒素（如破伤风毒素）失去毒性，但免疫原性不变，并命名为类毒素，用以免疫动物获得保护。此后，又相继研制出了明矾、氢氧化铝和矿物油等作佐剂，为提高生物制品的免疫效果起到了重要作用。值得一提的是活德菲等人在本世纪30年代用鸡胚增殖鸡痘病毒获得成功，首次成功地在实验室大量增殖病毒，为病毒疫苗的研制奠定了基础。冈德氏1949年又用鸡胚组织培养技术，为生物制品的研制开辟了一个新途径。1975年科勒和密尔斯坦又创造了淋巴细胞杂交瘤技术，从而使单克隆抗体的研制得到蓬勃发展。自20世纪80年代起基因工程技术迅速发展，获得了大量基因重组疫苗和遗传工程疫苗新制品，把生物制品的研制推向了现代高新技术领域。生物制品生产工艺中应用生物发酵法大量培养细菌、细胞培养法大量增殖病毒、真空冷冻干燥技术生产活疫苗等先进技术的应用，使生物制品的生产得到了很大的发展与提高。 我国从1918年起便研制出了鼻疽菌素、牛瘟血清等，开创了我国兽医生物制品的新时代。1930年上海商检局设立了兽医生物制品研究机构，生产出了牛瘟、炭疽、猪瘟及禽霍乱等高免血清及牛痘、狂犬病组织苗等。继后南京中央农业实验所畜牧兽医系、广西家畜保育科、四川家畜保育所、兰州西北防疫处、江西农学院、中央畜牧实验所以及在全国先后建立的以生产抗血清和组织苗为主的血清厂，生产为数不多的抗血清和几种疫苗。到1950年，全国共有9个兽医生物药品厂，年生产生物制品3500余万毫升，1952年组建了国家兽医生物制品监察所，制定出了我国第一部《兽医生物药品制造及检验规程》，及至80年代末，全国已有29个兽医生物制品厂，年产量达90亿毫升以上，从业人员超过万名，截止1993年国家批准的兽医生物制品标准已达138种。 二、兽用生物制品分类 生物制品由于微生物种类、动物种类、制备方法、毒株性状、应用对象等不同而品种繁杂。按其性质、用途和制造方法可分为疫苗、类毒素、诊断制剂、抗血清、微生态制剂等几大类。我们在此只对防制动物疫病的重要生物制品——疫苗进行讨论。
中国实验动物行业分析报告
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中国实验动物行业分析 (最新版报告请登陆我司官方网站联系) 公司网址: https://www.360docs.net/doc/5e6301502.html, 1
目录 中国实验动物行业分析 (3) 第一节2009-2014年9月实验动物行业总产值分析 (3) 第二节2009-2014年9月实验动物行业产出结构变动分析 (3) 第三节2009-2014年9月实验动物行业产能过剩情况分析 (4) 第四节2009-2014年9月实验动物行业产销率与产品库存分析 (5) 第五节2009-2014年9月实验动物行业盈利能力分析 (6) 2
3 中国实验动物行业分析 第一节 2009-2014年9月实验动物行业总产值分析 2009-2013年我国试验动物行业总产值的增长率呈现上升趋势，其中2009年的行业总产值为85.58亿元，2013的总产值为101.31亿元，同比2012年增长率为1.12%。2014年1-9月我国实验动物行业的总产值为76.13亿元，预测2014年全年的总产值将会与2013 年的总产值相当。 图表- 1：2009-2014年9月试验动物行业总产值分析 中元咨询整理 第二节 2009-2014年9月实验动物行业产出结构变动分析 在我国目前的实验动物产出结构中，普通级动物数量占比呈现下降趋势，而SPF 所占的比例呈现上升趋势，由2009年的25.64%增加到2014年的36.33%。
4 图表- 2：：2009-2014年9月实验动物行业产出结构变动分析 中元咨询整理 第三节 2009-2014年9月实验动物行业产能过剩情况分析 图表- 3：2009-2014年9月实验动物行业产能过剩情况分析 中元咨询整理 2009年我国实验动物产能为1899.32万只，2013年实验动物产能增加到2011.74万只，同比2012年增长率为14.27%。2014年1-9月我国实验动物产能
动物生物制品及其应用
《动物生物制品及其应用试题》试题 一、选择题（3×10） 1. 疫苗是用于疾病（）的生物制品。 A.诊断 B.治疗 C.预防 D.免疫调节 2. 用于疾病治疗的生物制品不包括（）。 A. 高免血清 B. 类毒素 C.蛋黄抗体 D.干扰素 3. 下列不属于高度传染性的疾病的是（）。 A. 口蹄疫 B.狂犬病 C. 高致病性蓝耳病 D.猪瘟 4. 口蹄疫是口蹄疫病毒引起的动物共患的一种急性热性、高度传染性疾病，仔猪常不见症状而猝死。 A. 偶蹄 B.奇蹄 C.各种 D.所有 5.农业部制定的口蹄疫免疫方案中，所有牛、羊、骆驼、鹿必须进行（）强制免疫。 A.亚洲I型口蹄疫 B. O型口蹄疫 C. A型口蹄疫 D. O型和亚洲I型口蹄疫 6. 我公司目前重点推出的市场化销售疫苗为：（） A. 口蹄疫和蓝耳苗 B.口蹄疫和猪瘟苗 C.口蹄疫和伪狂犬苗 D.猪瘟和伪狂犬苗 7. 以下不是我公司口蹄疫疫苗特点的是： ( ) A. 进口设备悬浮培养保证均一性 B. 浓缩纯化保证抗原含量高（PD50高） C.杂蛋白少 D.采用国产佐剂 8. 我国能繁母猪的数量大概范围在 ( )万头左右 : A. 2000 B. 3000 C. 4000 D. 5000 9. 我公司的高致病性蓝耳病疫苗为（）疫苗 A. 灭活 B.水佐剂 C. 需要在-15℃保存的活 D. 可在2-8℃保存的活 10.中国动保的猪瘟活疫苗优势之一为（） A. 毒株独特 B. 采用进口油佐剂 C.耐热保护剂 D. 浓缩纯化保证抗原含量高（PD50高）； 二、填空题（4×15） 1. 根据是否含活的病原体，可将疫苗分为活疫苗和。 2. 蓝耳苗用TCID50表示每头份疫苗中病毒的，而口蹄疫疫苗则用PD50表示。 3. 好疫苗的标准是、、、。
南宁生物制品项目投资建议书
南宁生物制品项目投资建议书 泓域咨询
报告说明 随着基因工程、微生物工程、细胞工程、酶工程等基础学科技术 的不断进步，生物合成法已逐渐取代传统化学合成工艺，成为食品营 养强化剂行业的主流生产方式。生物合成具有绿色、安全的优势，能 够减少对自然资源的依赖，以更小的环境代价获得更高经济产出，缓 解资源、能源、健康、环境、安全等重大问题。 本期项目总投资包括建设投资、建设期利息和流动资金。根据谨 慎财务估算，项目总投资45036.24万元，其中：建设投资37582.34 万元，占项目总投资的83.45%；建设期利息323.40万元，占项目总投资的0.72%；流动资金7130.50万元，占项目总投资的15.83%。 根据谨慎财务测算，项目正常运营每年营业收入77300.00万元， 综合总成本费用60833.95万元，净利润10261.65万元，财务内部收 益率18.67%，财务净现值4273.71万元，全部投资回收期5.15年。本期项目具有较强的财务盈利能力，其财务净现值良好，投资回收期合理。 本期项目技术上可行、经济上合理，投资方向正确，资本结构合理，技术方案设计优良。本期项目的投资建设和实施无论是经济效益、社会效益等方面都是积极可行的。
“十三五”时期是我国全面建成小康社会的决胜期，也是南宁贯 彻“四个全面”战略布局、落实“三大定位”新使命、勇当广西“两 个建成”排头兵的关键期。必须深刻认识国内外环境的新变化，准确 把握发展的历史方位和阶段特征，抓住用好重大战略机遇，促进经济 社会持续健康发展。 报告深入进行项目建设方案设计，包括：项目的建设规模与产品 方案、工程选址、工艺技术方案和主要设备方案、主要材料辅助材料、环境影响问题、项目建成投产及生产经营的组织机构与人力资源配置、项目进度计划、所需投资进行详细估算、融资分析、财务分析、国民 经济评价、社会评价、项目不确定性分析、风险分析、综合评价等。 本报告为模板参考范文，不作为投资建议，仅供参考。报告产业 背景、市场分析、技术方案、风险评估等内容基于公开信息；项目建 设方案、投资估算、经济效益分析等内容基于行业研究模型。本报告 可用于学习交流或模板参考应用。
2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
中国动物疫苗及兽用生物制品生产企业名录
中国兽用生物制品生产企业名录 河北省：2 唐山怡安生物工程有限公司（唯一专注于宠物疫苗研发、销售）瑞普（保定）生物药业有限公司 上海市：5 上海海利生物生物药品有限公司 申联生物医药（上海）有限公司 上海优耐特生物医药有限公司 上海佳牧生物制品有限公司 北京市：4 乾元浩生物股份有限公司 北京兽医生物药品厂 北京翎羽禽病防治技术开发有限公司 北京信得威特科技有限公司 山东省：9 山东滨州沃华生物工程有限公司 山东绿都生物科技有限公司 青岛澳兰百特生物工程有限公司 青岛宝依特生物制药有限公司 齐鲁动物保健品有限公司 青岛易邦生物工程有限公司 山东滨州华宏生物制品有限责任公司 山东泰丰生物制品有限公司 山东信得科技股份有限公司 河南省：5 乾元浩生物股份有限公司郑州生物药 普莱柯生物工程股份有限公司 河南省宝依特生物技术有限公司 郑州康沃生物技术有限公司 鹤壁神康生物制品有限公司 江苏省：7 乾元浩生物股份有限公司南京生物药长 南京天邦生物科技有限公司 南京梅里亚动物保健有限公司 扬州威克生物工程有限公司 扬州优邦生物制药有限公司 江苏南农高科技股份有限公司 常州同泰生物药业科技有限公司 四川省：7 中牧实业股份有限公司成都药械厂 四川华神兽用生物制品有限公司
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动物细胞培养技术 思考题
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
化学药品和治疗用生物制品上市后研究技术指导手册
化学药品和治疗用生物制品上市后研究技术指导手册 1. 背景 在上市前研究数据基础之上，上市后研究要求和上市后风险控制是审评审批决策的要素；上市后研究更是药品全生命周期监管的重要环节。我国的药品注册法规体系对上市后研究有明确的要求，如在《药品注册管理办法》（2007版）中规定，以下新药应进行上市后研究（Ⅳ期临床试验）：化药属于注册分类1和2类；生物制品新药等。虽然有上述规定，但由于各种原因，长期以来，我国未能形成完善的药品上市后研究和评价体系，未能形成上市前、上市后研究和评价的良好衔接和全链路管理。严重影响了对上市后药品的动态评估和全生命周期监管。为尽快弥补这一不足，药品审评中心起草制定了《化学药品和治疗用生物制品上市后研究管理规范（草案）》，为使该规范能够良好实施，作为这一文件的配套文件，特制定本手册。本技术指导手册主要从技术角度为申办人提供指导。 2. 研究目的 基于不同的药物研发和监管历史，在对于药品安全、有效、质量可控的基本认识相同的情况下，不同的国家，对药品注册上市基本条件尺度的把握上会有所不同。现实情况下，我国上市前临床研究的水平和质量相对薄弱，而临床对突破性治疗的需求非常强烈，这在一定程度上都影响到新药上市前证据的强度。因而，者要求我们的上市后研究在关注安全性问题之外，可能要求更加丰富的临床药理学研究，可能要求增加随机对照临床试验以强化有效性数据等。因而，对目前我国的上市后研究的目的应有以下内容：评估药物在普通或特殊人群中使用的获益与风险 评价药物广泛使用条件下的有效性 评估已知与药物使用有关的严重风险 评估与药物使用有关的严重风险信号 当数据提示存在严重风险的可能性时，鉴定其是否为非预期的严重风险 进一步完善药物上市前的有效性数据 完善临床药理学信息
石家庄生物制品产业园建设项目可行性研究报告
石家庄生物制品产业园建设项目可行性研究报告 投资分析/实施方案
报告摘要说明 我国对茶多酚的研究开始于五六十年代，而专业研究开始于七十年代，目前我国对茶多酚的研究在国际上处与领先水平。国内生产的茶多酚含量 大于89%，咖啡碱小于2%。 茶多酚广泛存在与各类茶之中，可以通过萃取方式、树脂吸附方式和 离子沉淀方式从茶叶中提取茶多酚物质。茶多酚因为化学结构中存在大量 的酚羟基而具有非常强的抗氧化能力，其抗氧化能力远远超过常见的抗氧 化剂，如VC、VE和人工合成抗氧化剂BHT、BHA，并且茶多酚在使用时只需要少量的使用就可以达到很好的效果，另外由于其化学结构的特点，该物 质在具有抗氧化能力的同时对食品中的色素和营养物质起到一定的保护作用，能够使食品药品及其他生活用品能够在较长时间内保持新鲜，且不会 有潜在的副作用。 该茶多酚项目计划总投资4592.80万元，其中：固定资产投资3336.13万元，占项目总投资的72.64%；流动资金1256.67万元，占 项目总投资的27.36%。 本期项目达产年营业收入10305.00万元，总成本费用8196.62万元，税金及附加88.23万元，利润总额2108.38万元，利税总额 2487.42万元，税后净利润1581.29万元，达产年纳税总额906.14万
元；达产年投资利润率45.91%，投资利税率54.16%，投资回报率 34.43%，全部投资回收期4.40年，提供就业职位158个。 茶多酚作为一种新型的抗氧化剂，是目前最具应用前景的天然添加剂，广泛应用于医药、医疗保健、食品行业、日用化学品、农业生产等方面。 近几年，茶多酚市场需求愈发强劲，2014年我国茶多酚市场销售总量约为2850吨，到2015年我国茶多酚市场销售总量达到3233吨。其中有60%以 上的茶多酚销往国外市场。 茶多酚是由茶叶中多种酚类组成的物质，其衍生物被称之为“茶多酚”。茶多酚拥有调节血脂、预防心脑血管疾病、清除自由基、延缓衰老、抗辐射、美容祛斑等功效，有较高的保健价值，市场需求量较高。随着市 场需求量的持续攀升，茶多酚行业对于茶多酚研究的不断加深，茶多酚使 用领域持续扩大，行业发展前景广阔。