肝吸虫抗体快速检测试剂盒(胶体金法)

肝吸虫抗体快速检测试剂盒(胶体金法)
肝吸虫抗体快速检测试剂盒(胶体金法)

肝吸虫抗体快速检测试剂盒(胶体金法)

肝吸虫概述:

华枝睾吸虫简称肝吸虫,成虫寄生于人体的肝胆管内,主要引起患者的肝脏受损。人体感染肝吸虫病主要因为生食或半生食含有肝吸虫囊蚴的淡水鱼虾所导致的,当人体感染肝吸虫病后,机体会产生特异性抗体,通过肝吸虫血清抗体快速检测对该病的辅助诊断和流行病学的监测有着重要的意义!

产品简介:

肝吸虫快速检测试剂盒采有金标渗滤式间接法定性检测试验血清中的肝吸虫抗体IgM/IgG,适用于疑似肝吸虫病的大量人群进行快速筛查。

检测原理:

本试剂盒利用斑点免疫金渗滤技术,将肝吸虫纯化抗原预先包被在固相载体硝酸纤维素薄膜上,待检测时,将预先处理好的样本血清滴加在加样孔中,通过渗滤使抗体和抗原在膜上发生特异性免疫结合反应,形成抗原抗体复合物。然后滴加红色胶体金标记的第二抗体(显色液),与复合物中对应的的抗体结合,则形成肉眼可读取的检测结果。

试剂盒组成:

1、肝吸虫快速检测板(含预先包被的肝吸虫纯化抗原)

2、试剂A(洗涤液1瓶,0.02moI/L PH7.4PBS)

3、试剂B(显色液1瓶,含胶体金标记物)

4、原版说明书1份

包装规格:24T/盒,单人份独立包装

检测样本:只限血清

储存条件:原试剂盒包装于2-8℃密封避光保存

有效日期:18个月

生产企业:广州市标健生物科技有限公司

样本要示:

样本只限血清,建议最好采用新鲜血清标本,若是陈旧血清或高血脂血清恐影响检测效果。

检验方法:

1、将试剂盒取出,和样本一起恢复室温25℃左右。

2、拆开试剂包装,将检测板水平放于工作台。

3、在反应孔中间垂直加入2滴(试剂A),待液体完全渗透。

4、在反应孔正中央垂直加入50ul待检血清,待血清完全渗透。

5、加入4滴显色液(试剂B),待液体完全渗透。

6、加入2滴(试剂A),待液体完全渗透,观察结果。

检测结果的解释:

阳性结果:检测板的C端出现红色线条,T端也出现红色线条,表明肝吸虫IgM抗体阳性。阴性结果:检测板的C端出现红色线条,T端不出现红色线条,表明肝吸虫IgM抗体阴性。

无效结果:检测板的C端不出现红色线条,表明试剂失效,建议重新再检测一次。

注意事项:

1、本试剂盒为初筛产品,阳性结果并不能确诊为肝吸虫病感染,应结合患者临床综合症状或其它确诊试验确定。

2、当肝吸虫抗体含量低的血清样本,检测结果为阴性,不能被检测出来是有可能的,但批间和批内产品的阴性符合率和阳性符合率都≥95%以上。

胶体金标记实验步骤

胶体金标记实验步骤 点击次数:13 发表于:2008-08-19 14:02转载请注明来自丁香园 来源:丁香园 1、蛋白质的处理:胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值,在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下,二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时,则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 (1)待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子,然后100 000g4℃离心1h,去除聚合物。 (2)待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时,调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时,调至7.6;标记SPA时,调至5.9~6.2;标记ConA时,调至8.0;标记亲和素时,调至9~10. 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板,因此,在调节pH时,采用精密pH试纸测定为宜。 由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附,并可使溶胶聚沉,故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意,蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒,否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。 一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在,因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。 2、蛋白质最适用量的选择:胶体金与标记蛋白用量之比的确定 (1)根据待标记蛋白的要求,将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml.

(2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml~50μg/m l,分别取1ml,加入上列金胶溶液中,混匀。对照管只加1ml稀释液。 (3)5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。 (4)结果观察,对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管,均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的最低用量,在实际工作中,可适当增加10%~20%。 将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后,分别取0.1ml(含蛋白质5~40ug)加到 1ml胶体金溶液中,另设一管不加蛋白质的对照管,5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2小时,不稳定的金溶胶将发生聚沉,能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。 3、标记:胶体金与蛋白质(IgG)的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0,电磁搅拌IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10min,加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10. 在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。 下述标记步骤最为常见: ①用0、1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。 ②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液(体积为2~3ml),搅拌2~3分钟。 ③加入5ml1%PEG20000溶液。

免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖

浙江大学2001年10月

一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1~0.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1%氯化金,预热至60~70℃。 (2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不

免疫胶体金标记手册

大学电子显微镜室大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖

大学2001年10月

一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm围。 在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1~0.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1%氯化金,预热至60~70℃。 (2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入 不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60~70℃。K2CO3的作用是保 持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对pH的影响不大,K2CO3

【CN110501485A】一种用于快速检测的胶体金共价标记方法及装置【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910389678.6 (22)申请日 2019.05.10 (71)申请人 武汉优恩生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开 发区高新二路388号光谷国际生物医 药企业加速器1号楼305室 (72)发明人 冷毅斌 胡勤芹 夏红星 冯亮  (74)专利代理机构 武汉蓝宝石专利代理事务所 (特殊普通合伙) 42242 代理人 廉海涛 (51)Int.Cl. G01N 33/53(2006.01) G01N 33/532(2006.01) G01N 33/543(2006.01) (54)发明名称 一种用于快速检测的胶体金共价标记方法 及装置 (57)摘要 本发明实施例提供了一种用于快速检测的 胶体金共价标记方法及装置,其中方法包括:获 取待标记样本;将预设粒径的胶体金颗粒加入所 述待标记样本溶液中,形成金标记抗体蛋白复合 物;将所述金标记抗体蛋白复合物均匀涂覆在预 设载体上并进行干燥处理,即完成对待标记样本 的共价标记。通过对带标记样本进行胶体金共价 标记。提高了金标复合物在复杂介质中的稳定 性,对目标蛋白的选择性识别显著增强,从而相 对提高了金标试纸条的灵敏度。权利要求书1页 说明书3页CN 110501485 A 2019.11.26 C N 110501485 A

权 利 要 求 书1/1页CN 110501485 A 1.一种用于快速检测的胶体金共价标记方法,其特征在于,包括: 获取待标记样本; 将预设粒径的胶体金颗粒加入所述待标记样本溶液中,形成金标记抗体蛋白复合物; 将所述金标记抗体蛋白复合物均匀涂覆在预设载体上并进行干燥处理,即完成对待标记样本的共价标记。 2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,在将预设粒径的胶体金颗粒加入所述待标记样本溶液中之前,还包括: 采用柠檬酸钠还原法制备小粒径的纳米胶体金,即所述预设粒径的胶体金颗粒。 3.根据权利要求2所述方法,其特征在于,所述将预设粒径的胶体金颗粒加入所述待标记样本溶液中,具体包括: 以所述预设粒径的胶体金颗粒为种子金,匀速滴加氯金酸和含巯基的羧酸还原剂,通过逐步生长的方法制备表面带羧基的大粒径胶体金颗粒,将制备好的胶体金颗粒用交联剂活化得到功能化的胶体金颗粒。 4.根据权利要求3所述方法,其特征在于,所述预设粒径为11-13nm。 5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述将所述金标记抗体蛋白复合物均匀涂覆在预设载体上并进行干燥处理,具体包括: 将所述金标记抗体蛋白复合物均匀涂覆在玻片上; 对所述玻片上的所述金标记抗体蛋白复合物进行真空抽干。 6.一种用于快速检测的胶体金共价标记装置,其特征在于,包括: 第一模块,用于获取待标记样本; 第二模块,用于将预设粒径的胶体金颗粒加入所述待标记样本溶液中,形成金标记抗体蛋白复合物; 第三模块,用于将所述金标记抗体蛋白复合物均匀涂覆在预设载体上并进行干燥处理,即完成对待标记样本的共价标记。 2

胶体金标记工艺汇总

免疫金的特性 胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合,在免疫组织化学技术中,习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质(抗原或抗体)结合,这类胶体金结合物常称为免疫金复合物,或简称免疫金(immunogold)。 胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚,一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷,与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素,其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。 来源:Gold 2 免疫金的制备 1.用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点,也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。在调节胶体金的pH值时应注意,胶体金会阻塞pH计的电极,不可直接将电极插入胶体金溶液中,宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇(PEG,20000)稳定胶体金后,再调胶体金的pH 值。 2.将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中,放置室温反应2~5min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。 3.加入浓度为0.2%的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。 4.离心分离,去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异:对5nm 金颗粒可选用40000r/min离心1h;8nm金颗粒用25000r/min离心45min;14nm金颗粒用25000r/min离心30min,40nm金颗粒用15000r/min离心30min。 5.轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复原体积后再离心。如此洗涤2~4次。以彻底除去未结合的蛋白质。 6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。

免疫胶体金技术常见影响因素分析

免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程就是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响与制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1、1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物与表面活性剂的来源、类型与数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径与分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但就是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小与分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1、2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物与待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1、3样品垫及吸水纸的选择。样品垫与吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫与吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸与样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收与蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性与重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离与沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深与假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果。

丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒(胶体金法)

丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒(胶体金法) 【检验目的】 定性测定人血清(浆)中的HCV抗体,用于临床术前的初筛查检测。 【实验原理】 丙型肝炎病毒抗体诊断试剂(胶体金法)采用胶体金免疫层析技术,在玻璃纤维素膜上预包被金标鼠抗人IgG抗体(anti-IgG Ab),在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被丙肝混合抗原(Core、NS3、NS4、NS5)和人IgG抗体。检测阳性样本时,血清样本中HCV-Ab与胶体金标记鼠抗人IgG抗体结合形成复合物,由于层析作用复合物沿纸条向前移动,经过检测线时与预包被的抗原结合形成“Atenti-IgG Ab-HCV Ab-HCV Ag”夹心物而凝聚显色游离金标鼠抗人IgG 抗体则在对照线处与人IgG抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色,15分钟内观察结果即可。 【样本要求】 1、采集静脉血样本必须在无菌条件下操作,并避免样品溶血。 2、如果血清和血浆样品收集后 7天内检测,样品须放在0-4C保存;大于7天必须-20C—下冷冻保存。 3、常规抗凝剂不影响实验结果。 4、溶血、粘稠及高指标本不适于本试剂。含特殊物质的标本可能会导致检测结果不稳定, 在检测前须清除。 5、在标本中加0.1%NaN3不影响实验结果。 【试验方法】 测试条: 1、将待测标本从储存条件下取出,平衡至室温并编号。 2、将胶体金试纸条从包装盒中取出,打开铝箔包装袋,平置于台面上。 3、用塑料滴管加1滴(10卩)样本血清或血浆,加到试纸条指示箭头下端的加样处。 4、随即滴加2滴样本稀释液(约100^)1。 5、加样后,阳性标本可在1~15分钟内检出,建议15分钟后在最终观察并记录实验结果。 测试卡: 1、将待测标本从储存条件下取出,平衡至室温并编号。 2、将胶体金测试卡从包装盒中取出,打开铝箔包装袋,平置于台面上。 3、用塑料滴管加1滴样本血清或血浆,加到测试卡上的 S孔。 4、随即滴加2滴(约100 ^)1样本稀释液到测试卡上的 D孔。 5、加样后,阳性标本可在1~15分钟内检出,建议15分钟后在最终观察并记录实验结果。 【结果判断】 阳性:试纸条/试卡在检测区和对照区位置出现两条紫红色条带。 阴性:试纸条/试卡只在对照线位置出现一条紫红色条带。 失效:对照区(C)未出现紫红色条带,表明不正确的操作过程或试剂盒已变质 损坏。在此情况下,应再次仔细阅读说明书,并用新的试纸条/试卡重新测试。

胶体金法的定义和分类

胶体金是一种常用的标记技术,是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术,有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学,此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。 免疫胶体金技术的基本原理: 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。

胶体金标记技术

胶体金标记技术 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂,应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题,且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记,使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。 用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初,1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年,Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明,胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点,因此自其问世以来,在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。 近年来,它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善,有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。 制备方法 在溶液中金颗粒呈圆形,边缘平整,界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷,由于静电的排斥力,使其在水中保持稳定状态,形成稳定的胶体,所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法,抗坏血酸还原法,柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例(即增加或减少还原剂的量)可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一,所以目前常用后两种方法,以柠檬酸三钠还原法为例,有两种方法。 1.Frens标准方法: 1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸,随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。 2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色,大约再过70s,蓝色突然转变为亮红色, 3)继续煮沸约5分钟后结束反应。 4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。 5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm,如前所述要想得到更大或更小的金颗粒,该方法依然可行,唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外,采用此标准方法所需反应时间最短。2.Slot标准方法: 1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中,2)再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。 3)将该混合溶液加热煮沸约15~30min,直至溶液颜色变为亮红色, 4)冷却后,用0.1M K2CO3溶液调整PH值,该法制备的金颗粒直径约为15nm。 胶体金标记蛋白的原理是:在碱性条件下,胶体金颗粒表面带负电荷,可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合,这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。 胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术,其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法(IGS),它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色,需要较高浓度的标记物,耗费抗体或抗原的量较多,而且需要较大直径的金颗粒(40-50nm),才能获得较高的灵敏度,而且当金颗粒过大时,标记物不稳定,长期贮存容易发生自动聚集。 为克服以上缺点,免疫金银染色法(IGSS)应运而生。该方法的原理是,先用胶体金标记物作免疫金染色,再加入含银的物理显影液,则银离子靠电荷吸引,大量吸附于金颗粒周围,使显色结果呈现金属银的蓝灰色,同时将显色信号进一步放大。应用时,由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积,因此不需要高浓度的胶体金标记物,将胶体金标记物稀释几十倍,仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物,而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的

胶体金标记技术

胶体金免疫分析技术 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业,免疫分析正在向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒,目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果,但仍需一定时间,不适合远离医疗及检测中心的地区,更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要,在酶免疫分析的基础上,主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析,主要有以下两种方法:斑点免疫渗滤分析DIFA 和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术,是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查,由胶体金颗粒标记抗原或抗体,与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合,在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后,此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法,使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来,利用硝酸纤维素膜(NC)等为固相载体,以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行,建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术,并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子(0-100nm)分散在另一种物质中所形成的体系,通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶,用此金溶胶标记蛋白质(抗原、抗体或SPA、SPG),胶体金颗粒具有高电子密度的特性,故在金标蛋白的抗原抗体结合处,显微镜下可见黑褐色颗粒;当这些标记物在相应的标记处大量聚集时,可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点,从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短,仅需要数分钟就完成了ELISA 需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中,高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中,待测抗原在渗滤或层析时,流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触,很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中,待测抗原要在液相中经过扩散作用,逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时,标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物,故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理: 将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金),标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)或抗体,用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤、免疫层析实验。金标记免疫渗滤技术的原理同一般的免疫斑点试验,也是用已知抗原或抗体包被NC膜,再用金标记抗体或抗原来进行快速快速测定,阳性时斑点呈胶体金的红色。改进之处为采用了渗滤装置,更加简便。金标记免疫层析则是利用NC膜条状纤维的毛细管作用,使样品在涌动中与金标记物及包被在NC膜上的抗原或抗体结合,出现呈色的阳性信号。

实用胶体金标记技术

胶体金标记的实验操作 (1)蛋白质的处理:胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值,在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下,二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时,则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 1)待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子,然后100 000g4℃离心1h,去除聚合物。 2)待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH 值。标记IgG时,调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时,调至7.6;标记SPA时,调至5.9~6.2;标记ConA时,调至8.0;标记亲和素时,调至9~10。 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板,因此,在调节pH时,采用精密pH试纸测定为宜。 由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附,并可使溶胶聚沉,故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意,蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒,否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。 一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在,因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。 (2)蛋白质最适用量的选择: 胶体金与标记蛋白用量之比的确定 1)根据待标记蛋白的要求,将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml。 2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5μg/ml~50μg/ml,分别取1ml,加入上列金胶溶液中,混匀。对照管只加1ml稀释液。 3)5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。 4)结果观察,对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管,均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的最低用量,在实际工作中,可适当增加10%~20%。 将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后,分别取0.1ml(含蛋白质5~40ug)加到 1ml胶体金溶液中,另设一管不加蛋白质的对照管,5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2小时,不稳定的金溶胶将发生聚沉,能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。 (3)标记:胶体金与蛋白质(IgG)的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0,电磁搅拌IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10min,加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。 在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。 下述标记步骤最为常见:

免疫胶体金技术影响因素分析_张付贤

免疫胶体金技术影响因素分析 张付贤1,2,王兴龙2 (1.吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春 130062;2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062) 摘要:免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点,受到国内外科研工作者及基层工作人员的普遍关注。笔者从耗材的选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素,为制备胶体金检测产品提供理论依据和技术参考。 关键词:免疫胶体金技术;影响因素;选择;检测 中图分类号:Q-33 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009)05-0199-04 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1 耗材的选择 1.1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高(李云等,2002)。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标 收稿日期:2008-11-28 作者简介:张付贤(1982-),男,河南人,硕士,研究方向:兽医微生物与免疫学。 通信作者:王兴龙(1959-),男,吉林人,博导,从事分子免疫学研究。E-mail:w ang xl-2006@https://www.360docs.net/doc/5f13535110.html, 基金项目:吉林省科技厅计划项目(20050549)。记物在膜上的流动速率为最佳(邓省亮等,2007)。 1.2 结合垫的选择 结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附(张美玲,2006);玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3 样品垫及吸水纸的选择 样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2 关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果(Bassab等,2001)。 胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度(翟雷等,1996)。所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作

几种胶体金技术详解

胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业,免疫分析正在向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒,目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果,但仍需一定时间,不适合远离医疗及检测中心的地区,更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要,在酶免疫分析的基础上,主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析,主要有以下两种方法:斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术,是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查,由胶体金颗粒标记抗原或抗体,与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合,在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后,此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法,使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来,利用硝酸纤维素膜(NC)等为固相载体,以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行,建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术,并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子(0-100nm)分散在另一种物质中所形成的体系,通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶,用此金溶胶标记蛋白质(抗原、抗体或SPA、SPG),胶体金颗粒具有高电子密度的特性,故在金标蛋白的抗原抗体结合处,显微镜下可见黑褐色颗粒;当这些标记物在相应的标记处大量聚集时,可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点,从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短,仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中,高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中,待测抗原在渗滤或层析时,流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触,很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中,待测抗原要在液相中经过扩散作用,逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时,标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物,故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理: 将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金),标记金黄色葡萄球菌A

免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖 浙江大学 2001年10月

一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1- 500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探 针,其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金(HAuCI 4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍, 数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3?16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1?0.2%的 H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备12?150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径 的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残 基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液 时一次配完,暂时不用的可以用 1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20 C)。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时, 烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可4C保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3?16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1 %氯化金,预热至60?70C。 (2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1 %柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60?70C。K2CO3的作用是保持 溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对pH的影响不大,K2CO3 可以省略。 (3)将上两种溶液迅速混合并充分

胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理

胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理 从定性、半定量向全定量是即时检验(POCT)技术发展的一个趋势。全定量的POCT检测技术有多种原理。本文主要介绍胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理。 一、胶体金标记的全定量免疫层析POCT试剂装置结构示意图及作用 1、吸收垫:吸收多余液体。 2、PVC底板:提供试剂封装外壳。 3、C1、C2:标准质控区。羊抗鼠抗体结合于硝酸纤维膜上。 4、T:检测区。鼠源性单克隆二抗。 5、硝酸纤维素膜:提供抗原抗体反应的固相载体。 6、胶体金垫:含胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。 7、样品吸收垫:吸收样品液体。 二、原理 该方法的免疫学原理是一个双抗体夹心法。 样品加入样品吸收垫,样品中的液体首先溶解胶体金垫中含有的胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。其次样品中待测抗原与胶体金颗粒标记的鼠源性单克隆抗体结合,形成抗原-抗体*胶体金复合物,并靠毛细作用向检测线移动。在硝酸纤维薄膜的检测线上固定有另一鼠源性单克隆二抗。当样品层析至检测线时,可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金双抗体夹心复合物,并在检测线上聚积显现出一条可见的显色反应。无显色反应则表示样品中无抗原存在。而胶体金的量反应了待测抗原的量。从加样垫中泳动过来的过量胶体金标记的单克隆抗体是鼠源性的,无论携带抗原与否,均可被固定于标准的羊抗鼠抗体所捕获,形成显色反应,这种显色反应,既代表了整个反应体系是正确的,同时C1、C2区的显色反应的深浅,与检测区中被测抗原的量呈对应关系。胶体金颗粒在特定波长下,对光的吸收和散射与胶体金颗粒的量相关,通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射,从而获得待测抗原的量。 三、讨论 全定量是POCT的发展趋势,采用两点定标法是全定量的一个重要标志,只有两点定标才有可能实现真正的全定量。

免疫胶体金标记手册

免疫胶体金标记手册 浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖 浙江大学 2001年10月

一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1~0.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1%氯化金,预热至60~70℃。 (2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加 入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60~70℃。K2CO3的作用 是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对pH的影响不大,K 2CO3可以省略。 (3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温10分钟。自然冷却。

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