细菌内毒素检查注意

细菌内毒素检查法的正确理解

·如何全面理解细菌内毒素检查法中污染物对试验结果的影响？

·如何正确认识器皿洗涤的重要性？

·如何正确理解鲎试剂的抗干扰能力和鲎试剂的特异性？

许多客户对污染的认识是不全面或错误的，他们认为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现，但试验结果正好与他们的认识有时正好相反，可能阳性对照全为阴性，对此亦有百思不得其解。要正确理解这个问题，首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理，鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。在日常工作中，我们要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。

图1 鲎试剂与内毒素的反应机理

1、PH值：鲎试剂生物活性在pH 6-8时酶活性稳定；pH ≤3 或≥10时，酶活性受到抑制。故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.8-8.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。

2、器皿：内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度玻璃吸管。因为注射器刻度准确度差，而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素，试验误差大。同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，铁离

子对鲎试验反应有较强的抑制作用。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果，故宜慎用。

3、金属阳离子：离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。

4、其它物质：如血液中的凝血因子、络合剂、抗凝剂等，都可能干扰鲎试剂与内毒素的反应，同时消毒剂和有机溶剂对鲎试验都有抑制作用。

一、器皿洗涤的重要性

《中国生物制品操作规程》389页——细菌内毒素检查法“玻璃器皿的洗涤”规定：“将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥（禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗）后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用新鲜蒸馏水冲洗，禁用纯化水和久置的蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水内在质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用新鲜多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。

二、抗干扰能力和鲎试剂的特异性

有客户在做白蛋白的干扰试验时使用两个厂家的鲎试剂，干扰试验结果其中一个厂家的鲎试剂需要稀释4倍而另一个厂家的鲎试剂需要稀释8倍才能排除干扰。据此向我们咨询是否稀释倍数小的鲎试剂抗干扰能力强？而稀释倍数大的鲎试剂抗干扰能力就差？我们认为对一些粘度较大

的产品白蛋白、医用透明质酸钠，建议使用8倍或16倍稀释来建立内毒素常规检查规程（SOP），因为鲎试验是一种复杂酶反应，任何一种药品、生物制品的浓度或粘度对试验结果皆有影响，是抑制还是增强反应仍需做具体的分析。单纯以干扰试验的稀释倍数来判断鲎试剂的质量是片面的。

如何判断鲎试剂抗干扰能力，必须从几个方面进行分析：

1、鲎试剂灵敏度的差异不同厂家的鲎试剂虽然标示值（λ）相同，但仍然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml的鲎试剂，若有的产品真实灵敏度可能是0.75EU/ml或1.0EU/ml；而另一个厂家的鲎试剂可能是0.35EU/ml或0.25EU/ml时，按0.5-2λ误差标准都是合格产品，但对同一检品虽然在相同的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品对内毒素的检出水平却不同。

2、鲎试剂与内毒素脂多糖反应的差异在正常的药品、生物制品生产时，因不同时期的原料来源和水源的因素，都可能导致半成品或成品污染的菌株不同，而导致内毒素脂多糖物质与鲎试剂反应的活性不同。有的鲎试剂对革兰氏阴性菌或各种微生物产生的内毒素脂多糖均有敏感性，有的鲎试剂可能只对革兰氏阴性菌产生的内毒素敏感而对其它微生物产生

的内毒素脂多糖不敏感，故同一检品虽然在相同稀释倍数下，两个厂家的鲎试剂对内毒素的检出能力亦不同。

3、PH值的影响鲎试剂生产用水质量和BET水PH值的差异，可影响鲎试剂对内毒素脂多糖反应敏感性。有的鲎试剂生产公司（或厂）的原料用水不是多效蒸馏水，而是利用一般纯化水，而且PH值都在6.0以下。而鲎试剂的酶反应最佳PH值为6.8-8.0，所以一直以来美国、英国药典和日本药局方规定检品必须调节PH值6.0-8.0。

近几年来，鲎试剂特异性差所造成的后果比较隐蔽，不易被使用者所发现，但是这种危害性往往以人的生命为代价所表现出来。《法律在线》报道：２０００年５月４日晚１０时，８岁女童何某某因扁桃体发炎，被父亲带到河南省某中心医院就诊。医院为她所用的药物为青霉素，所用液体是该医院自己生产的２５０ｍｌ袋装生理盐水（批号20000427）。输液约２０分钟后，何某某开始出现胸闷、全身颤抖等症状。６小时后，经抢

救无效死亡。２０００年５月８日，该医院将何一一使用的该院自制氯化钠注射液样品送往省质量检验部门检验，检验结果是：细菌内毒素不符合规定。经医疗事故技术鉴定委员会鉴定，“患儿何某某因输入细菌内毒素超标的液体引起输液反应，输液反应导致主要脏器缺血缺氧，功能衰竭死亡”（豫医鉴〖2001〗10号），这是一起严重的由于内毒素漏检所造成的悲剧。用我厂生产的海浪牌鲎试剂来检验该批生理盐水，同样检测出该药品注射液内毒素不合格。同样的事故还发生在吉林省公主岭地区某制药厂和河北邯郸某制药厂，他们分别使用某企业的鲎试剂都没有检验出。产品中的内毒素而造成产品漏检，造成临床大面积严重的输液反应，这种情况都是鲎试剂特异性差的一种表现。对内毒素不合格的药品，便威胁到人民群众的生命安全。

鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。目前我厂研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。如下图：

鲎试剂的特异性（专属性）差的另一种表现，是将其它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。

例如在山东省青州某制药厂，该药厂生产5%葡萄糖注射液（规格：100ml 产品批号：0307040101）内毒素限量是合格的，但是用某公司的鲎试剂检验却是阳性。该产品经我厂（湛江海洋生物制品厂）通过凝胶法检验是合格的。我们对这种现象进行研究分析，认为应从鲎试剂的特异性方面考察。我们通过定量检测，对这一批药品的反应数据、反应曲线和反应速率曲线进行研究分析，认为该批药品内毒素检测合格，验证了凝胶法结论的正确性，为该制药厂挽回经济损失。

通过以上几个方面的分析，干扰试验结果时稀释几倍能排除干扰并不重要，而对内毒素的检出能力（鲎试剂的特异性）才是最关键的，也是判定鲎试剂质量的唯一标准。

三、污染的全面理解

通过以上几个方面的分析，我们应认识到内毒素的污染只是其中之一，污染物的种类很多，影响情况也很复杂，比如样品中的药品及其它成分影响了样品的PH值、鲎试剂的特异性、内毒素的活性等。这些污染物可能对鲎试剂与内毒素反应产生增强和抑制作用，其中以抑制作用为主。试验环境（检验室空气洁净度、温度和湿度等）和操作程序都可能引起试验结果的差异，应引起大家的注意。

问题在于，虽然乙醇能破乳并在一定浓度一下没有干扰，但我的产品本身存在干扰。在稀释倍数已经不能再大的情况下，参照药典的说明进行了过滤后（滤头用的是milipore的无菌无热源的专用滤头），就不存在干扰了。

可是对于验证的做法存在疑问，方法一，按05版SOP的方法，制备4λ工作标准品和2倍样品等比混合，得到的“2λ/供试品”为阳性，即没有干扰，方法二，按课题组长的提议制备400λ及供试品原液（稀释200倍后成为供试品）混合，共同稀释200倍后，得到的“2λ/供试品”为阴性，即有干扰。（两种方法均过滤）

另外，我单独验证了过滤环节，不存在干扰。这样的试验重复了好几次，结果无一例外。

分析下来，很有可能内毒素被吸附了，在样品稀释倍数较大的情况下，吸附不明显。像这种情况应该选择那种方法？按照药典规范操作样品的确是合格的。