病毒及其疫苗的生产制备技术

第25章病毒及其疫苗的生产制备技术

第一节病毒的生产制备

病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。

一、病毒生产的目的和用途

1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。

2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。

3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。

4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。

5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。

二、病毒生产制备的方法

1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。

2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。

3、细胞培养法（详见第二篇第18章）

不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。

以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。

第二节病毒疫苗的生产制备

病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基本相同，目前进行人工主动免疫，用于病毒病预防的疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。

一、病毒疫苗的种类

(一)灭活疫苗：目前常用的有流行性乙型脑炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍体细胞与地鼠肾细胞可用于生产狂犬病病毒固定毒灭活疫苗），流感灭活疫苗。常用甲醛为灭活剂，以灭活病毒核酸而不影响其抗原性。

(二)减毒活疫苗，通常采用自然法或人工法，通过动物传代或细胞传代筛选对人毒力低的变异株病毒。常用的有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及一些联合疫苗（如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗）。

(三)亚单位疫苗：用化学试剂裂解病毒，提取包膜或衣壳上的亚单位，除去其核酸，以此制成的疫苗称亚单位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神经氨酸酶亚单位疫苗。

(四)多肽疫苗：采用乙肝携带者血提取的HBsAg的乙型肝炎疫苗或采用基因工程法制备的HBsAg基因表达产物制备的疫苗。

(五)基因缺失的减毒活疫苗：在病毒的基因组中，使其有毒力的相关基因发生缺失而制成的减毒活疫苗称基因缺失的减毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3区缺失株（第二代），单纯疱疹病毒的α22基因缺失株，目前有待进一步研究。

(六)基因工程亚单位疫苗：将病毒表面抗原基因，通过基因重组，在酵母或CHO细胞中进行表达亚单位多肽抗原成分而制成的疫苗，称基因工程亚单位疫苗，如乙型肝炎病毒的表面抗原HBsAg的基因在酵母和CHO细胞中表达而提取获得的纯品HBsAg多肽。即将上市。

(七)重组牛痘多价活疫苗。以牛痘苗为载体来表达数十种外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒，经一次划痕接种可使机体同时能获得对多种病毒的免疫力，大大减少了接种次数。此外腺病毒和脊髓灰质炎病毒的活疫苗也可作为载体与轮状病毒的抗原基因重组后的活疫苗，经口服后可同时获得两种病毒的免疫力，有待于进一步研究、开发。

上述病毒疫苗有的是采用细胞培养技术和细胞工程来进行生产制备的，现将采用细胞工程制备病毒疫苗种类和敏感细胞以及生产方式规于下表。

二、细胞培养法制备的常用疫苗（如表25-1）。

表25-1 采用细胞培养法生产的常用病毒疫苗

疫苗制备疫苗

的细胞培养方法

名称活/死(疫苗株)

脊髓灰灭活（Salk株）猴肾细胞（原代/2-3代）转瓶培养质炎疫苗活（Sabin株）Vero细胞微载体培养

腮腺炎活（ME株）幼地鼠、狗肾转瓶培养疫苗豚鼠肾细胞罗氏瓶培养

麻疹活疫苗Edomonste、

L16、沪191、

Moraten、

Schwar2株

原代鸡胚纤维母

细胞，人二倍体

人羊膜、狗肾、羊肾

豚鼠肾细胞

罗氏瓶培养

转瓶培养

单纯疮疹

死（72株）兔肾、豚鼠肾罗氏瓶培养

病毒疫苗豚鼠胚成纤维细胞转瓶培养

巨细胞病毒疫

苗活（Towne株）

WI-38人胚肺细胞转瓶培养

狂犬病毒疫苗死（AV01/AV02株）

（CUS株）

人二倍体细胞微载体培养

流行性乙型

脑炎疫苗

灭活（5-3株）人二倍体细胞多层滋养增殖器

森林脑炎病毒疫苗灭活

鸡胚纤维母细胞

幼地鼠肾细胞

转瓶培养

三、用细胞培养制备病毒疫苗的优点：

病毒疫苗的制备开始多用动物脏器、禽类胚胎（第一代疫苗）。然而因来源困难，很不经济，制作麻烦，数量受限，更危险的是这些组织中间可能含有潜在致癌病毒和慢性病毒，后改用原代细胞来制作疫苗（第二代疫苗），如麻疹疫苗、乙脑疫苗等，随着细胞培养的发展，特别是自70年代后我国二倍体细胞株相继建立，为疫苗生产创造了极为有利的基础，这比用原代细胞制备疫苗更优越。如：

（1）在细胞传代期间可进行比较全面的检查，特别是对潜在病毒和致癌性的检查，确保安全。

（2）可使逐渐适应于无血清（或无蛋白）培基中生产繁殖，以排除过敏因素。

（3）可挑选对病毒敏感的细胞克隆。以利病毒在细胞中大量增殖，有助于疫苗产量的提高。

（4）易于大量生产和进行连续自动化工业生产，以满足量的需求。

国外已建立的二倍体细胞WI-38、MRC-5、IMR-90等，国内已建立KMB-17、2BS、SL-7等均已用于疫苗生产，如麻疹活疫苗、乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、腮腺炎疫苗等，从目前发展来看，用二倍体细胞制备疫苗将有取代其他原代细胞和传代细胞的趋势，但目前仍有一些病毒疫苗的制备还需用原代细胞，近年来有人主张用肿瘤细胞制备人用灭活疫苗。

四、提高疫苗的效力常采用的方法：

（1）细胞的药物处理：用某些药物处理细胞后可以刺激病毒繁殖（如下表），其方法为：在细胞形成单层后，用一些化学药物来处理，然后洗去，再接种病毒，就可使病毒提前成熟，产量高，现列表如下：

（3）毒种的选择：经过空斑挑选产量高的大空斑毒株，精制毒种可提高病毒产量。

（4）病毒液的浓缩：经浓缩后，病毒浓度增高，从而效价也随之上升。

五、影响疫苗质量的因素：

（1）毒种：毒种的优劣不仅影响疫苗的产量，而且也影响疫苗的质量，毒种不纯会产生相互干扰，减毒活疫苗毒种若毒力回升易造成事故，因此毒种的选择应挑选那些致病性低，免疫效价高而持久，抗原谱广的，易增殖，便于生产，可在传代细胞上传代的毒种。

（2）培养病毒的细胞：细胞若有潜在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原体污染均不能用作疫苗生产。对此因素应严格检查。此外若细胞本身发生转化后，不宜于制备活疫苗，只能制备一些灭活疫苗或亚单位疫苗。

（3）培养液：培养细胞的营养液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常会出现某种程度的过敏反应，为此，应尽量使细胞适应于无血清蛋白的培养基中，以消除过敏源。

（4）甲醛灭活剂的使用：甲醛能使病毒灭活，但仍保持其抗原性，因此普遍用来制备灭活病毒疫苗，但要控制含量。

病毒被灭活的程度与灭活的温度和甲醛的浓度等因素有密切关系。一般用热灭活的方法，采用在37℃灭活一定时间。经热灭活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和稳定性不受影响，而且灭活病毒的温度提高以后，灭活时间相对可以缩短，灭活剂的用量也可以减少。

甲醛能刺激局部而引起疼痛和红肿，并有释放组织胺的作用。因此制备疫苗时减少甲醛浓度是必要的。如果疫苗内游离甲醛含量降低到一定程度后，可考虑不需再用亚硫酸氢钠来中和甲醛。这对减少注射后疼痛及便于推广预防接种有重要意义。

六、生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法

(一)制备工艺流程

（1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺

猴肾细胞培养

←接种病毒（测0%正常细胞对照）收获病毒，合并，加MgCl2→

无菌试验→←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40）B病毒检查（兔肾细胞）→←病毒效价滴定

←合并，过滤加MgCl2

←无菌试验

分亚批→←柯萨奇病毒检查（乳鼠）

病毒滴定→←型特异性检查

B病毒复检（家兔）→←T特征试验

分装病毒滴定→←猴体残余致麻痹力试验

（安全试验）病理切片

结核杆菌检查→

分装→←无菌试验

病毒滴定→

→保存于-20℃待检定合格后

加工糖丸

脊髓灰质炎活疫菌工艺流程

2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺

地鼠肾

剪碎，胰酶消化

地鼠肾细胞悬液

37℃,3天细胞培养液，～

单层细胞

洗涤细胞，去除牛血清

10-4～10-5浓度病毒感染细胞

32～34℃培养2～3天

收获病毒液（收二次）

按1:2000加入甲醛

22℃，8天

灭活病毒液

合并，安全及效力试验

原液

加入亚硫酸氨钠

半成品

分装

成品

检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验，

防腐剂、试剂及残余牛血清含量等）

合格成品

(二)生产方法：

病毒和病毒疫苗的生产方法基本相同，其规模取决于细胞生产规模，因此上述介绍的细胞大量生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗，可根据需要及适宜生产条件来选用培养装置，如转瓶培养，因设备简单，便于生产单位采用。而多层培养，微载体培养，目前国外已用于生产，我国仍在研究中。悬浮搅拌培养的简易装置已应用于疫苗生产，全自动悬浮发酵罐，在干扰素生产中有应用，但在疫苗生产中正在试用，下面着重介绍微载体培养法生产病毒的技术。

1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产工艺

作者选VSV病毒来接种经微载体培养的敏感细胞，病毒的效价测定用A549细胞（也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50），病毒的效价为6 Log TCID50/m L，用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。

①VSV在方瓶贴壁细胞中的增殖（100mL方瓶，10mL培养基）待BHK21、BHK13、CHO-K1细胞长满单层，弃上清加入10-2VSV病毒悬液，37℃吸附1小时，加病毒维持液培养20小时，于-30℃冻存，待测效价。

②VSV在微载体悬液培养的细胞中增殖。

微载体培养的BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞，

3～4天后细胞密度已达1×106细胞/mL

静置30分钟

尽量吸去原培养基

37℃

将10-2VSV病毒按50mL培养体积加入1mL病毒液于微载体细胞中

37℃50r/min搅拌5分钟

静置吸附1小时（每20分钟搅拌2分钟）

加入病毒维持液至原体积

37℃继续搅拌培养20小时

于-30℃冻融后

2000 r/min 低温离心10分钟

收集上清，即为VSV增殖的病毒液，分装冻存，待测效价

结果，在微载体悬浮培养的三株细胞所繁殖VSV病毒不仅产量大，而且病毒效价平均高1LogTCID50，尤以CHO-K1效价最高，平均可达比原先的毒种效价还要高，又起到了提高病毒效价的作用。

此方法也可应用于生产病毒疫苗，只要疫苗株病毒的敏感细胞能在微载体上大量生产。若疫苗株是减毒活疫苗株，此法生产的病毒可直接制备活疫苗。若疫苗株为非减毒活疫苗株，此法生产的病毒可用甲醛灭活法制备死疫苗。

2、转瓶培养法

此法是目前各大生物制品研究所常用于生产疫毒疫苗的方法，如生产脊髓灰质炎病毒疫苗，麻疹疫苗等。

将细胞制备成悬液后，在温室内（37℃）使支架以8～12转/小时缓慢转动，以使细胞贴壁，当加入病毒后，待细胞出现+++以上细胞病理性改变(CPE)时，标志病毒已大量繁殖，此时收获病毒，按生物制品程序加工成疫苗。

3、罗式瓶培养

将许多大罗氏瓶，在净化室内，把制备好的细胞悬液人工加入瓶内，100mL/瓶，在温室内的货架上一排排放置，进行静置贴壁培养，待细胞呈单层后，倒去旧液，加含病毒疫苗株和维持液，继续静置培养，每天观察细胞和记录温室的温度，待细胞有明显的CPE产生时，收获病毒液，然后按疫苗生产加工工艺制成疫苗。

以上2、3两种方法是我国各大生物制品所常规方法，由于制品工艺的要求，目前仍然采用，但正在不断改进和采用新工艺、新方法和高技术来生产疫苗。