发酵下游工程总结

由微生物发酵而获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，通常称为下游技术（Downstream Processing），也称为下游工程或下游加工过程。发酵工程下游工程的特点:

1）成分复杂，发酵液是复杂的多相系统

2）所需产物在培养液中浓度较低(最高10%左右)3）普遍存在下游工程代价高，回收率较低等问题

4）生产的产品有些具有生物活性

5）生物安全问题（biosafety）

下游工程的生产过程发酵液的预处理和过滤提取精制成品加工

发酵液特性:

1发酵产物浓度较低，大多为1%-10%，悬浮液中大部分是水

2悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大

3固体粒子可压缩性大

4液体黏度大，大多为非牛顿型流体

5性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响

改变发酵液过滤特性的方法:

物理化学方法包括：调pH(等电点)、热处理、电解质处理、添加絮凝剂、添加表面活性剂、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。

凝聚是在中性盐（电解质）的作用下，由于胶体粒子之间双电子层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。

絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。

絮凝作用形成的颗粒更大混凝：对于带负电荷的菌体或蛋白质来说采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电子层电位和产生吸附架桥的双重机理，所以称之为混凝。

固-液分离设备:板框压滤机硅藻土过滤机真空转鼓过滤机碟片式离心机倾析式离心机

微生物代谢产物大多数会分泌到胞外，称为胞外产物。而有些目的产物存在于细胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。

细胞破碎方法p278

珠磨机(法,bead mill)工作原理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下快速搅拌或研磨，珠子之间以及珠子与细胞之间的相互剪切、碰撞，使细胞壁破裂，释放出内含物。

高压均质器(高压匀浆机)工作原理：从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬浮液从阀室与阀杆之间的环隙中高速喷出，速度可达450m/s，高速喷出的浆液撞击到静止的碰撞环上，由于突然减压和高速冲击作用，在剪切和撞击力等综合作用下细胞破裂。

超声波破碎工作原理：超声波（15～25kHz）能引起细胞的空穴作用——剪切应力——流体流动——细胞膨胀、破裂

Hughes （压碎器）press法是一种利用冷冻挤压原理制成的高速匀浆器

工作原理：菌体-25～-30℃——形成冰晶——从小孔中挤出——靠高速挤压作用，使冰晶磨损。

某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂（盐酸胍、尿素）、表面活性剂（SDS）、抗生素、金属螯合剂（EDTA）等，可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使细胞内物质有选择的渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法（chemical permeation）。

渗透压法原理：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液，20%），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和细胞膜膨胀破裂，从而使细胞通透性增大。

冻融法原理：冻融法是通过水结晶的形成和随后的融化而进行细胞破碎。冷冻的目的是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性，而且由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。

酶溶法原理：利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键而达到破壁的目的，即利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再破坏细胞膜，以提高胞内产物的通透性。

自溶法原理：采用诱导的方式激活自身溶胞酶系统将菌体溶解。

发酵产品的提取

盐析法盐析法又称中性盐沉淀法，在发酵液中加入中性盐能破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电荷，促使蛋白质或酶沉淀。一般应用于蛋白质分离和酶制剂工业的发酵液提取。

盐析的机理

①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；

②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；

③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。

盐溶（Salting in）在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶。

等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。主要用于一些两性电解质的产物中，例如抗生素、氨基酸和蛋白质。

等电点（pI, isoelectric point）:蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质在电场中的迁移率为零。符号为pI。

有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶液，随着有机溶液浓度的

增大，水对蛋白质分子表面电荷基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。

常用的有机溶剂是甲醇、乙醇和丙酮。

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：

1、与盐溶液一样具有脱水作用，

2、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。

选择性变性沉淀法选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。

利用液体混合物中各组分(component)挥发性(volatility)的差异，以热能为媒介使其部分汽化从而在汽相富集轻组分、液相富集重组分而分离的方法。

蒸馏是将液-固、液-液混合物分离成较纯或近于纯态组分的单元操作。

1. 工作原理:

利用液体混合物中各组分(component)挥发性(volatility)的差异，以热能为媒介使其部分汽化从而在汽相富集轻组分、液相富集重组分而分离的方法。

2. 适用范围:

白酒、酒精、甘油、丙酮等发酵产品的提取和精制及某些萃取过程中的溶剂回收常采用蒸馏。

萃取是用一种溶剂将产物从另一种溶剂（如水）中提取出来，达到浓缩和提纯目的的单元操作。1. 工作原理:

利用欲萃取得到的成分在两种互不相溶的溶解度的不同，使其从一种溶剂转入另一种溶剂而实现分离。

2. 适用范围:

广泛用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物的提取

反胶束或称逆胶束(Reversed micelle) 是指当有机溶剂中加入表面活性剂并令其浓度超过某临界值时，表面活性剂便会在有机溶剂中形成一种稳定的大小为毫微米级的聚集体。

影响反胶团萃取的因素:

（1）溶液的pH

pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质

（2）溶液的离子强度

影响微胶团的静电状态

凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如pH，以及对反胶束的静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。

（3）表面活性剂的浓度和种类

（4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）

超临界流体是处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的高密度流体。在临界温

度以上压力不高时与气体性质相近，压力较高时则与液体性质更接近，由此形成的超临界流体的性质介于汽液两相之间，并易于随压力调节的特点。

超临界流体萃取原理

超临界萃取是利用SCF作为萃取剂，从液体和固体中萃取出特定成分，以达到某种分离的目的。

一般说来，物质的溶解能力与其密度成正比关系。所以，在临界点附近，温度和压力的微小变化往往会导致溶质的溶解度发生几个数量级的变化。利用超临界流体的这个性质进行分离操作效果奇佳，而且过程无相变，能耗较低。因此，超临界流体已突破了一般流体的范畴。

离子交换分离法是利用溶液中的溶质离子与离子交换树脂的活性离子交换时结合力大小不同而进行分离的一类方法。

离子交换树脂的类型:

离子交换树脂由不溶性的高分子聚合物骨架、功能基团和活性离子三部分组成。在水溶液中，树脂的活性离子可从功能基团上解离下来，在骨架与溶液间自由迁移，并可与溶液中的同性离子发生离子交换作用。若活性离子为阳离子，可与溶液中的其他阳离子发生交换，则这类树脂称为阳离子交换树脂；若活性离子为阴离子，可与溶液中的其他阴离子发生交换，则这类树脂称为阴离子交换树脂。

精制

结晶是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程。是获得纯净固态物质的重要方法之一。一般把许多性质相同

的粒子（包括原子、离子、

分子）在空间有规律地排列

呈的格子状的固体叫做晶体。

若物质结晶时有水合作用，则所得晶体水合物中有一定数量的水分子，称为结晶水

饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；

过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；

影响晶体质量的因素

晶体质量主要是指晶体的大小、形状（均匀度）和纯度三个方面。影响因素主要包括：（1）影响晶体的大小的因素——温度、晶核质量、搅拌等。

（2）影响晶体的形状的因素——改变过饱和度、改变溶剂体系、杂质

（3）影响晶体的纯度的因素——母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布

（4）晶体的结块

（5）重结晶

常用的结晶方法（1）等电点结晶——氨基酸提取

（2）添加有机溶剂结晶

（3）将部分溶液蒸发结晶

（4）将热饱和溶液冷却，添加晶种结晶——谷氨酸和柠檬酸

（5）盐析结晶——酶制剂和抗生素精制

结晶过程(包括：形成过饱和溶液、晶核形成和晶体生长三个阶段

过饱和溶液的形成热饱和溶液冷却部分溶剂蒸发法真空蒸发冷却法化学反应结晶

在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。

工作原理：靠溶质在

电场中移动速度不同而实

现分离。应用最普遍的是凝胶电泳法等电聚焦一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术

色谱分离（chromatographic resolution, CR）亦称为层析分离它是一种物理分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中。其中一个相为固定的，称为固定相；另一个相则流过此固定相，称为流动相

分离机理p300

吸附色谱（adsorption chromatography，AC）是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。

原理：利用吸附剂对组分吸附能力的差异进行分离。

物理吸附和化学吸附

通过范德华力、静电引力、疏水作用、共价结合力及氢键等与待分离物质的极性官能团作用。

常用吸附剂: 活性炭、氧化铝、碳酸钙、磷酸钙（羟基磷灰石）、硅胶等。

分配色谱（distribution chromatography，DC）的流动相和固定相都是液体，因而又称为液-液色谱

原理：是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。

离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲和力而将他们分离。

适用范围：大多数生物大分子都是极性的，都可使其电离，所以离子交换色谱广泛用于生物大分子的分离纯化。特别是蛋白质、多肽、核酸等。

凝胶色谱（gel chromatography，GC）是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱

凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及相对分子质量的测定。

亲和色谱（affinity chromatography，AFC）

原理：把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，当含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。

保留时间：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间

膜分离（Membrane Separation）是以选择性透过膜为分离介质，在膜两侧一定推动力的作用下，使原料中的某组分选择性地透过膜，从而使混合物得以分离，以达到提纯、浓缩等目的的分离过程。

分类：包括电渗析、反渗透、超滤、扩散渗析等：其中的反渗透、超滤相当于过滤技术。

蒸发浓缩是用加热方法使溶液加热沸腾，使一部分溶剂（通常是水）蒸发后除去得到浓度较高的料液的操作。

干燥是将潮湿的固体、半固体或浓缩液中的水（或溶剂）蒸发除去的过程。

清洁生产是将综合性、预防性的环境战略持续地应用于生产过程、产品和服务中，以提高效率和降低对人类和环境的危害。