绿色荧光蛋白转入拟南芥愈伤组织

绿色荧光蛋白转入拟南芥愈伤组织

引言：

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属于十字花科，与甘蓝、白菜和油菜同科。由于拟南芥具有植株很小(株高约15 Cllfl)、生活周期很短(42～56 d)、种子丰富(每株3000粒以上)、易于繁殖和人工诱变等优点，早在1943年它就被选为模式植物进行研究；1980年公布了它的遗传图谱；1997年公布了拟南芥线粒体基因组，这是有花植物中第1个完整的线粒体基因组分析；2000年拟南芥国际合作组织完成了其核基因组全长测定，是迄今唯一完成全部基因组序列测定的植物。拟南芥在植物进化中处于相当高的位置，在拟南芥中发现的一些重要调节基因都能在其他植物中找到它们的同源基因。因此，如果从比较容易的拟南芥人手，获得的基因研究成果可以更容易地向农作物转化，表现出可观的经济效益。

绿色荧光蛋白（GFP）最早是由Shimomura等[1]从多管水母中分离出来的一种荧光蛋白。主要存在与水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内。其特点在于发光无需底物或辅助因子，其发光的主要原因是因为其独特的一级结构[2]。GFP作为一种报告基因还具有无种属特异性、分子量小、容易与其他蛋白形成融合蛋白、不损害细胞、易检测、可用于活体观察等特点[3]。本实验就是利用了其荧光和活体检测的优点对转化效率进行评测。

目前有关于GFP的研究多见于其在细胞中的瞬时表达[4,5]，但是它本身的发光是依赖于其特有的氨基酸序列，而且很容易和其他蛋白进行融合表达，因此可以将GFP蛋白和目的蛋白进行融合表达，通过荧光显微镜对目的蛋白在细胞或组织中的表达情况进行直接观察。这种方法相与传统的免疫荧光方法相比可以直接进行活体观察，且样品处理及观察更加简便。

一、实验原理

1.培养拟南芥愈伤组织

1.1配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。

1.2愈伤组织原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2，4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。

愈伤组织形成的过程分为3个时期：诱导期、分裂期、分化期（形成期）。愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。

1.3调节培养基的酸碱性至PH5.8。由于培养基的PH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。培养基若偏酸时用氢氧化钠（1mol/L）来调节，若过碱就用盐酸（1mol/L）来调

整。当PH值高于6.0时，培养基将会变硬；当PH值低于5.0时5.0时，琼脂不能很好地凝固。

1.4植物组织培养的优点：①研究材料来源单一，无性系遗传背景一致；②经济方便效率高；③条件可控误差小；④生长快周期短重复性强；⑤可周年试验或生产。

1.5组织培养实验室布局的总体要求：便于隔离，便于操作，便于灭菌，便于观察。

1.6组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。常用的物理方法有：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。常用的化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。不同物品要选用不同的灭菌方法。

2.实验室中常用仪器设备及其灭菌方法如下：

①培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法。具体方法如下：压力9.8×104—10.8×104Pa，温度在121℃，灭菌20—30min。②玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌③塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌④金属用具灭菌：灼烧灭菌。具体方法是：浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。⑤接种室灭菌：紫外灯照射、空气消毒灭菌。超净工作台：紫外灯照射，70%—75%的酒精擦洗。⑥外植体灭菌：水冲洗10—20min或更长时间70%—75%酒精中浸泡

30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗4—5次备用。

3.农杆菌转化

农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。根癌农杆菌含有Ti (tumor-inducing plasmid)质粒Ti 质粒上

的 T-DNAtransferred DNA在 Vir区virulence region基因产物的介导下可以插入到植物基因组中诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此 将外源目的基因插入到 T-DNA 中借助 Ti质粒的功能使目的基因转移进宿主植物中并进一步整合、表达。

根癌农杆菌的Ti质粒上有一段转移DNA(T-DNA)，具有向植物细胞传递外源基因的能力，而细菌本身并不进入受体细胞。农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括:

①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。

②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。

③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。

④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。因为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，况且其不能合成起诱导作用的信号分子，所以限制了农杆菌介导法在单子叶植物中的应用。不过近年来大量成功转化的实例表明，植物、真菌、哺乳动物甚至人类细胞都可以作为农杆菌的受体双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T-DNA 区域完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功激活处于反式位置上的T-DNA的转移。另一部分是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如Hyg基因或Lac Z基因等。双元载体系统的转化原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA 的转移。

根据受体材料不同分为浸花法、原生质体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。其中浸花法、叶盘法在许多植物上得到广泛应用。

二、实验目的

1.了解并掌握拟南芥愈伤组织的置备方法。

2. 了解并掌握制备感受态农杆菌的方法。

3. 了解并掌握重组质粒转入农杆菌的方法。

4. 了解并掌握农杆菌转入拟南芥愈伤组织的方法。

5.了解并掌握荧光显微镜的使用方法。

三、实验过程（包括实验步骤和实验材料）

1.培养拟南芥愈伤组织

1.1所需材料准备

拟南芥种子若干，70-80%酒精，无菌水，2,4-D（2mg/L），6-BA（1mg/L），MS固体培养基（琼脂糖7.2g/L），三角瓶；黑暗培养箱；培养皿；无菌滤纸；无菌镊子；保险膜等

1.2培养拟南芥愈伤组织

1.2.1.选取饱满、无霉变、成熟拟南芥种子（注意保持胚完整）

1.2.2.打开超净工作台消毒2h

1.2.3.将拟南芥种子转到50mL无菌三角瓶，加适量无菌水洗3~5次（以没过种子为准，下同）

1.2.4.倒入70~80%酒精适量，摇动搅拌，放置60秒（过程中适当轻摇动混匀）1.2.5.用无菌水洗4-5次，每次停留1分钟

1.2.6.倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干

1.2.7.无菌拟南芥种子放置在MS的固体培养基（琼脂糖7.2g/L），黑暗培养26~28度3周

2.将重组质粒转入农杆菌

2.1选用pCAMBIA1304质粒

2.2所需材料准备(注：因为农杆菌的培养周期较长，一定要保证有28度摇床可用。)

菌种：农杆菌EHA105利福平抗性,LB液体培养基3ml 50ml,LB固体培养基利福平和卡那抗性,抗生素：利福平50mg/ml和卡那抗性50mg/ml,CaCl220mmol/L,液氮,液体YEP培养基,涂布棒，枪头，滤菌膜，平板，锥形瓶，3ml液体培养及用管，1.5ml离心管，水浴锅，离心机，培养箱，摇床等

2.3 制备感受态农杆菌

2.3.1 挑取1个新鲜的单菌落到含3ml LB培养基中利福平浓度50 mg/L.

2.3.2 28℃，200 r/min 振荡培养过夜

2.3.3取0.5ml菌液加入50ml培养基中利福平浓度50mg/L ，28℃，200r/min振荡培养至培养液OD600=0.50

2.3.4取1.5ml菌液转移至预冷的1.5ml离心管中，冰浴30 min

2.3.54℃，5000 r/min 离心10 min，弃上清，重复取菌液3-4次，完成后将离心管倒置于灭菌滤纸上使其残液流尽

2.3.6 缓慢向离心管中加入20 mmol/L冰预冷的CaCl2转化溶液1ml，重悬菌液沉淀，冰浴中放置10 min，4℃，5000 r/min离心10min

2.3.7 弃上清，加入100ul 20 mmol/L的冰预冷的CaCl2转化溶液，重悬菌液沉淀。

2.4 重组质粒导入农杆菌

2.4.1 在感受态细胞中加入重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min

2.4.2 液氮速冻1min

2.4.3 迅速移至37℃融化，加入900ul液体培养基，28℃轻摇培养4h

2.4.4 6000r/min离心2min，弃上清

2.4.5 用100ul培养基重悬菌体，重悬液体后涂布于含利福平50mg/L和50mg/L 卡那霉素的固体培养基上，28℃倒置培养2d

2.4.6 挑取单菌落，接种到液体YEP培养基上，28℃，230r/min培养48h，菌液用于保存或转化。

3.将农杆菌转入拟南芥愈伤组织

3.1. 所需材料准备

(注：诱导培养基：MS+2,4-D 2 mg·L-1+6-BA 1mg·L-1；PH =5.8-6.0

共培养培养基：MS+2,4-D 2 mg·L-1 +AS 100 uM·L-1+6-BA 1mg·L-1；PH =5.8

选择培养基：MS+2,4-D 2 mg·L-1 +羧卞青霉素250 mg·L-1+潮霉素

50mg·L-1+6-BA 1mg·L-1；PH =5.8-6.0)

LB固体培养基（利福平和卡那抗性）,含100μM/L乙酰丁香酮的AAM培养基,无菌培养瓶,羧卞青霉素(100 mg/mL),潮霉素,无菌滤纸,无菌水,AAM培养基,共培养基：MS培养基;选择培养基

3.2.将农杆菌转入拟南芥愈伤组织

3.2.1. 处理农杆菌

从低温(－20℃) 冻存管中取少量菌液于附加Kan 50 mg/L和Rif 50 mg/L LB固体培养基，然后在26-28℃暗培养两天。

3.2.2. 农杆菌感染拟南芥

农杆菌在27℃固体LB培养基上暗培养2天后，用适量添加有100μM/L乙酰丁香酮的AAM培养基，将农杆菌洗脱，悬浮于添加有100μM/L乙酰丁香酮20 ml AAM培养基中，剧烈摇动，调整菌液浓度至OD600nm=0.1-1.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液。取经预培养的愈伤组织于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，28℃中暗培养2天。

3.2.3.洗脱农杆菌

两天后，挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250 mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干。第二天转移至选择培养基(添加250 mg/L羧卞青霉素，以及50 mg/L潮霉素)筛选抗性愈伤。

4.荧光显微镜观察结果

取转化后的愈伤组织制片，放在荧光显微镜下观察实验结果。

四、实验结果与讨论

1.实验结果

在培养愈伤组织的过程中多次出现杂菌，且没有生成愈伤组织。并且在后来的多次诱导过程时向诱导培养基中加入了适量的抗生素，虽然解决了杂菌生长的问题，但是仍然没有愈伤组织生成。愈伤组织培育失败，实验不能继续完成。2.讨论

愈伤组织培养时引入杂菌的可能有：实验操作的不熟练导致实验过程中没有

严格的维持无菌条件；使用无菌工作台之前没有进行彻底的消毒操作。

愈伤组织诱导失败可能的原因可能有：次氯酸钠处理后没有用无菌水洗净，抑制了脱分化过程；2-4 D在培养基中由于高温或其他原因导致其终浓度不对或者2-4 D已经失效。

五、参考文献

[1] Shimomm 0 et al. A Bioluminescent protein from the luminous Hydromedusan. Aequorea[J]．J Cell Comp physiol，1962，59(2)：223~229．

[2]Chalife et al. Green fluorescent protein as a maker for gene expression. Science,1994,263(5148):802~805

[3]王爱民,高霞莉. 根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达[J]. 徐州师范大学学报(自然科学版),2009,02:91-94.

[4]王泽宙,邱全胜. 绿色荧光蛋白基因mgfp4 在水稻愈伤组织中的瞬时表达[J]. 北京师范大学学报(自然科学版),2000,03:385-389.

[5]熊玲媛,陈亮,沈明山,黄胤怡,陈睦传. GFP-mut2 植物表达载体的构建及在甜菊愈伤组织中的表达[J]. 厦门大学学报(自然科学版),2002,05:546-550.