试验动物与细胞系

尾加压素II在2型糖尿病小鼠骨骼肌组织

中的表达情况

作者:张思凡

单位:北京市陈经纶中学

辅导老师: 黄臣田超

指导专家:王学江

摘要 (2)

前言 (3)

实验目的 (3)

材料与方法 (4)

实验结果 ........................................... 错误！未定义书签。讨论 . (9)

结论 (11)

参考文献 ........................................... 错误！未定义书签。附录 ............................................... 错误！未定义书签。致谢 ............................................... 错误！未定义书签。

摘要

目的探讨T2DM时小鼠骨骼肌组织UII/UT系统的表达变化情况。

方法采用免疫组化、RT-PCR实验观察骨骼肌组织中UII/UT系统的表达；采用血糖测定仪检测2型糖尿病的特征。

结果 1. 在遗传性2型糖尿病小鼠模型上，证实2型糖尿病小鼠骨骼肌组织中UII/UT系统高表达。用放免法测定到2型糖尿病小鼠血浆UII含量明显高于对照小鼠；骨骼肌组织UII含量和释放到孵育液中的UII含量分别较对照动物高；免疫组化染色发现T2DM小鼠骨骼肌组织中UII的含量较对照组增高。

结论 1. 2型糖尿病小鼠骨骼肌UII/UT系统上调。

2. UII抑制胰岛素刺激的骨骼肌的糖摄入，提示骨骼肌UII可能以旁/自分泌方式作用于骨骼肌参与了胰岛素抵抗的发病

关键词尾加压素II；2型糖尿病；胰岛素抵抗

前言

胰岛素抵抗指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要表现之一，主要是肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性和反应性降低。胰岛素抵抗发病机制目前并不完全清楚，不仅与遗传因素高度相关，而且与胰岛素信号传导缺陷、多种脂肪源性细胞因子表达异常、物质代谢异常、炎症介质和氧化应激等诸多因素有关。越来越多的研究提示血管活性因子、尤其是缩血管因子的调节紊乱参与胰岛素抵抗及糖尿病的发病，如血管紧张素II、内皮素等。尾加压素II也是体内重要的血管活性肽，具有与内皮素相似或更强的收缩血管和促进血管平滑肌细胞增殖效应。

尾加压素II最早是从鱼的脊髓尾部下垂体中分离出的生长抑素样环肽，后证实从软体动物到哺乳动物的神经系统均存在UII，并且目前已经从人体中克隆出来。UII的特异性受体是人体内一种孤立的G蛋白耦联受体，又称为UT。UII与UT结合后引起一系列生物学效应，参与多种疾病的发生。例如，在中枢神经系统中，可以引起交感神经兴奋，释放肾上腺素和促肾上腺皮质激素，对心率、呼吸和血压也具有一定的调节作用。在心血管系统，UII可以引起冠状动脉收缩和反射性心动过速。在外周血管中，UII是迄今为止发现的最强的缩血管物质，可引起内皮炎症，导致内皮损伤。在肾脏，UII可以减少肾脏血流，使上皮细胞增殖。近来研究发现，UII对胰腺也具有一定的作用，可以减少胰岛素的分泌。

由于UII是迄今为止发现的最强的缩血管物质，因此人们对它的研究最初主要集中在心血管方面。在心血管系统中，UII参与了心力衰竭和心肌肥大，冠心病和冠状动脉粥样硬化，肾功能衰竭等这些疾病。近年大量实验资料显示UII还参与糖代谢的调节、在糖尿病及其并发症的发病中具有重要作用，尤其是2型糖尿病。2型糖尿病占糖尿病总数的90%以上，它的发生主要与胰岛素抵抗有关。

目前有大量数据表明炎症因子是骨骼肌胰岛素抵抗的一个病因，而它与骨骼肌中UII/UT系统有何关系并不清楚。本工作旨在观察T2DM时骨骼肌组织中UII/UT系统内源性表达的变化及其意义，及影响这种表达的因素。

实验材料与方法

一、实验动物与细胞系

KK小鼠是日本学者培育的一种轻度肥胖型T2DM动物，KK小鼠有明显的多食，从5周龄起，血糖、血胰岛素水平逐步升高，1岁龄时，多食、高血糖、高胰岛素血症、肥胖及肝脏对胰岛素的敏感性可自发恢复正常，但其生命明显缩短。对照组小鼠（C57BL/6J）体重20-30g，12周龄。所有小鼠实验当日清晨空腹自尾静脉采血测定其空腹血糖，随后自由饮食，1-2小时后测其随机血糖。分离双下肢的比目鱼肌，用中性福尔马林固定用于免疫组化。

肌原细胞C2C12细胞株购自中国医学科学院基础研究所。

二、主要试剂和仪器（表1、表2）

表1 主要试剂

Table 1 Main regents

试剂生产厂家

DMEM高糖培养基美国Hyclone公司

特级胎牛血清美国Gibco公司

青霉素-链霉素溶液美国Gibco公司

胰蛋白酶(trypsin) 美国Gibco公司

二甲基亚砜(DMSO) 美国Sigma公司

UII放免试剂盒UII多克隆一抗UII多肽Honenix Pharmaceuticals Honenix Pharmaceuticals Honenix Pharmaceuticals

山羊抗兔IgG 北京中杉金桥生物技术有限公司DAB染色试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司

表2 主要仪器

Table 2 Main instruments

仪器

生产厂家电子天平

德国Sartorius 公司超速低温离心机

美国Sigma 公司紫外可见分光光度计

Unico 公司二氧化碳培养箱

美国Revco 公司 PB-600 型恒温水浴箱

BOEKELScientific 倒置显微镜

日本Olympus 公司石蜡切片机

北京东方仪器厂制冰机

日本三洋公司 pH 计

德国Sartorius 公司超纯水制备装置

美国Millipore 公司微量移液器

德国Eppendorf 公司超净工作台

硝酸纤维素膜天津泰斯特公司 Waters 公司

二、实验方法

1．C2C12细胞的培养及传代

该细胞系用含15%胎牛血清，青霉素100 U/ml ，链霉素100 U/ml 的高糖

DMEM

培养基在37℃，5% CO2条件下培养。

（1）细胞复苏

①紫外照射超净台30min，擦

②于-80℃低温冰箱中取卵圆

细胞一支，37℃水浴中迅速融化，

加至8ml完全培养基中，1200r

离心8min。

③弃上清，沉淀用3ml完全培

养基重悬，接种至细胞培养

瓶中，放入孵箱培养。

（2）细胞传代

①紫外照射超净台30min，擦拭超净台台面。

②弃原培养基，PBS洗两次。

③加入胰酶消化至细胞变圆，细胞间隙变宽，弃胰酶，加入3ml培养基终止消化。

④吹打细胞使细胞呈悬浮状态，分瓶，补足培养基，放入孵箱培养。

（3）细胞冻存

①紫外照射超净台30min，擦拭超净台台面。

②弃原培养基，PBS洗两次。

③加入胰酶消化至细胞变圆，细胞间隙变宽，弃胰酶，加入3ml培养基终止消化。

④1200r离心8min，弃上清，沉淀用冻存液重悬（冻存液配制：血清：DMSO=9:1）。

⑤度降温：4℃放置1h，-20℃放置30min，-40℃放置30min，放入-80℃低温

冰箱保存。

（4）细胞计数

将稀释后的细胞悬液滴于计数板上，使悬液自由充满盖片下方间隙，勿留气泡，稍候片刻，镜下观察并计算出四角大格内的细胞数。压线者只计上线和右线的细胞，然后按下式计算出细胞浓度：（4大格中的细胞数/4）*10000*稀释倍数=细胞数/ml。

2. 免疫组织化学染色

1）切片常规脱蜡至水

2）缓冲液洗3min/2次

3) 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性北京染色，将切片放在3%过氧化氢中孵育30分钟

5）抗原修复：15min

95℃，室温45-60min

6）滴加一抗工作液 4℃孵

育过夜

7）缓冲液洗5min/2次

8）滴加酶标二抗，在室温

下孵育30min

9）缓冲液洗5min/2次

10）向1mlDABPlus Substrate中滴加1-2滴DAB Plus Chromogen，混匀后滴加到切片上，孵育3-15min

11）自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

研究过程

1 检测T2DM组和对照组小鼠血糖、血浆中胰岛素含量

8只KK小鼠和8只C57BL小鼠。实验前禁食2-4h，自由饮水。使用罗氏血

糖测定仪自尾部采血测定小鼠空腹血糖及随机血糖含量。采用放免法测定血浆中

胰岛素含量。

2检测小鼠骨骼肌组织中UII的表达

取两组小鼠骨骼肌组织做石蜡切片进行免疫组织化学染色检测两组小鼠骨骼肌组织中UII蛋白的表达及其组织细胞定位

3分离双下肢的比目鱼肌，取10mg左右的组织。37°C孵育4h，孵育结束后，取孵育液放免方法测定其UII含量。

实验结果

1kk小鼠呈典型T2DM表现

kk小鼠为轻度肥胖型T2DM动物，具有多食、高血糖、高胰岛素血症、肥胖特征。我们的实验结果显示：与对照组比较，kk小鼠组成的T2DM组动物更肥胖，体重重93.6%；空腹血糖高91.3%；血浆胰岛素含量高86.6%。表明kk小鼠呈典型T2DM表现，与文献报道一致，见表1。

Control T2DM

Body weight（g）20.2±1.6 39.1±2.4*

Casual blood glucose(mmol/L) 9.5±2.4 23.0±1.9*

Fasting blood glucose(mmol/L) 4.6±1.1 8.8±0.5*

Plasma insulin(pmol/mL) 299.3±39.4 558.5±71.0*

2免疫组化结果显示对照组小鼠骨骼肌细胞有棕黄色的颗粒，主要分布于胞浆中；而T2DM组可见到较强的UII蛋白的表达，提示T2DM时骨骼肌组织中UII/UT系统高表达。

3T2DM小鼠骨骼肌分泌释放UII增加

以往的文献已报道T2DM时，动物及人血浆中UII含量升高，但其升高的来源并不清楚，有文献报道血管内皮细胞时血浆中UII的一个来源。骨骼肌占体重的70%，而且骨骼肌组织作为一个内分泌器官受到了越来越多的重视，那么骨骼肌是否能够产生和释放UII，且T2DM时骨骼肌产生和释放的UII是否是血浆中UII升高的一个来源并不清楚。我们的结果发现，与对照组相比较，T2DM组血浆中UII含量高51.4%，与文献报道相一致；骨骼肌组织UII含量高21.8%，但差异无统计学意义，表明骨骼肌组织能够产生UII。

Control mice T2DM mice Plasma UII content(pg/mL) 137.5±31.4 208.1±28.7*

Skeletal muscle(pg/mg protein) 3.3±0.3 4.0±0.5*

Cell incubation liquid(pg/mg

36.0±8.4 51.8±4.2*

protein)

*P<0.05 vs. control group

讨论

本工作采用遗传性T2DM小鼠为观察对象，发现由KK小鼠组成的T2DM组呈现肥胖、空腹高血糖、随机血糖及血浆中胰岛素的含量均明显高于有C57BL 小鼠组成的对照组，呈典型T2DM表现，与文献报道一致。用放免方法测定到T2DM小鼠血浆UII含量明显高于对照C57BL小鼠，骨骼肌组织UII含量和释放到孵育液中的UII含量分别较对照动物高21.8%和44.1%，说明骨骼肌组织能够

产生UII，而且能够分泌UII。免疫组化显示对照组小鼠骨骼肌也富含UII，而T2DM 小鼠骨骼肌组织中UII的表达较对照组明显增多，这从形态学的角度进一步证明了T2DM时骨骼肌中UII含量明显增加。

胰岛素抵抗指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要表现之一，主要是肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性和反应性降低。IR发病机制目前并不完全清楚，不仅与遗传因素高度相关，而且与胰岛素信号传导缺陷、多种脂肪源性细胞因子表达异常、物质代谢异常、炎症介质和氧化应激等诸多因素有关。越来越多的研究提示血管活性因子、尤其是缩血管因子的调节紊乱参与胰岛素抵抗及糖尿病的发病，如血管紧张素II、内皮素和儿茶酚胺等。血管紧张素II主要通过干扰胰岛素信号传递、抑制脂肪细胞分化、降低胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性、诱导抑制胰岛素作用的细胞因子生成等多方面的作用，在胰岛素抵抗的发生和发展中起着重要作用。UII也是体内重要的血管活性多肽，具有与内皮素相似或更强的收缩血管和促进血管平滑肌增殖效应。我们的研究表明UII参与了骨骼肌葡萄糖的摄取。

近年大量实验研究资料发现骨骼肌也是一种重要的内分泌器官，能表达、合成和分泌多种生物信号分子，以内分泌、旁分泌和自分泌方式参与代谢调节和某些疾病的发病过程。我们的结果表明骨骼肌中UII/UT系统参与了胰岛素抵抗的发生。

Kazuhito等人报道了T2DM患者血浆UII水平明显升高，为了了解血浆中UII升高的来源，他们培养了人冠状动脉内皮细胞和脐静脉内皮细胞，结果发现这两类血管内皮细胞上都表达UIImRNA，考虑到血管床占人体相当大的一部分，推测内皮细胞可能是血浆中UII的重要来源。但是，他们又发现在血管内皮细胞UIImRNA的表达水平明显不如脊髓高，与人的心脏、肝脏和肾脏相当。因此不能排除血中UII其他来源的存在。鉴于目前越来越多的资料显示骨骼肌合成和分泌许多生物活性物质，认为骨骼肌也是人体重要的内分泌器官。按其重量计算，骨骼肌约占人体体重的40%，可被视为人体最大的分泌器官。本实验证实骨骼肌

合成和分泌UII，推测骨骼肌源UII可能是机体及血循环中UII的重要来源之一。

UII刺激骨骼肌胰岛素抵抗发生的机制尚不清楚，值得进一步探讨。

创新点

本工作首次报道2型糖尿病小鼠骨骼肌UII/UT系统上调；UII抑制胰岛素刺激的骨骼肌的糖摄入，提示骨骼肌来源的UII可能以旁/自分泌方式作用于骨骼肌参与了胰岛素抵抗的发病。

参考文献

?[1] 李京艳,唐洁,王敬,周毓玲,冀秋娣. 对氧磷酶-1与2型糖尿病的关系研究[J]. 天津医科大学学报.

2007(04)

?[2] 应俊,肖伟,潘若望,曹小恩,李佩珍,张洪勤. 瘦素受体基因Pro1019 Pro变异与浙南地区2型糖尿病的相关性研究[J]. 中国微循环. 2009(05)

?[3] 应俊,石楠松,潘若望,李佩珍,张洪勤. 瘦素受体基因Gln223Arg变异与浙南地区2型糖尿病的相关性研究[J]. 中国老年学杂志. 2009(07)

?[4] 杨光燃,杨金奎. 2型糖尿病视网膜病变易感基因研究进展[J]. 医学综述. 2011(20)

?[5] 闻杰,陆志强,李晓牧,吴丹,张忆文,滕香宇,谭燕,殳雪怡,杨永年. 亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性及同型半胱氨酸与2型糖尿病微量白蛋白尿的相关性[J]. 上海医学. 2008(01) ?[6] 陈静,潘琳,赵学锋,柴莉,魏颖丽,霍正浩. 肿瘤坏死因子α基因启动子区-308位点多态性与2型糖尿病的相关性研究[J]. 宁夏医学杂志. 2009(05)

?[7] 钟严伟,高玲,吴少庭,耿艺介,余英祥. PC-1基因K121Q多态性与2型糖尿病相关性研究[J]. 中国热带医学. 2006(12)

?[8] 李慧华,杨敏,余敏,周宏灏,刘昭前. β3-AR Trp64Arg遗传多态性对T2DM患者罗格列酮疗效的影响[J]. 中国药理学通报. 2009(03)

?[9] 陈萍,潘艳慧,孙冬琳,白静,傅松滨. 亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与2型糖尿病的关系[J]. 齐齐哈尔医学院学报. 2008(06)

?[10] 王群,马增霞,邱书娟. 血管紧张素转换酶基因多态性与2型糖尿病肾病的相关性[J]. 山东医药.

2007(26)

(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告

一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗：硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水；冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工

医学实验动物学考试重点总结

名词解释：实验动物（laboratory animal）：指经人工培育，对其携带的微生物、寄生虫进行严格控制，遗传背景明确，可用于科学实验、药品、生物制品的生产和检定及其它科学研究的动物。实验用动物：是指一切用于实验的动物，除了符合严格要求的实验动物外，还包括家畜和野生动物等。实验动物与实验用动物：遗传控制不同,微生物控制等级不同,培育的形质和目标不同。人类疾病的动物模型：是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。实验动物标准化：遗传质量标准化微生物质量标准化环境标准化营养标准化按遗传控制标准，实验动物分为：近交系（CH3），突变系（裸鼠），杂交系（F1），封闭群（远交系）（KM小鼠，wister大鼠）按基因型分：1、同基因型动物（如近交系、F1代） 2、不同基因型动物（如封闭群）按微生物控制程度分级：普通级，清洁级，SPF级，无菌级（2001年版的国家标准中，大小鼠取消普通级动物，犬、猴只分普通级和SPF级，豚鼠、地鼠和兔仍然分4级） SPF动物定义：除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。（屏障环境中饲养，种子群来源于无菌动物或剖腹产动物。饲养管理同清洁动物）无菌动物的特点：形态学及生理学特点： ①形态学：盲肠肥大（增大5～6倍），肠壁薄，易发肠扭转。心脏、肝脏、脾脏相对较小。 ②生理学: 血中无抗体，巨噬细胞吞噬能力弱。体内不能合成维生素B和K。无菌鸡生长较快、无菌豚鼠和无菌兔生长较慢。无菌大小鼠与普通大小鼠生长速度相同。

（3)饲养要求：隔离环境中饲养，种子群来源于剖腹产动物或无菌卵的孵化。由于肠道无菌，饲养困难，应注意添加各种维生素。每2～4周检查一次动物的生活环境和粪便标本。悉生动物：概念：悉生动物是指在无菌动物体内植入已知微生物的动物。又称已知菌动物。植入一种细菌的动物叫单菌动物；植入两种细菌的动物叫双菌动物；植入三种细菌的动物叫三菌动物；植入多种细菌的动物叫多菌动物。（由于肠道接种有利于消化吸收的细菌，故饲养较无菌动物容易，形态学和生理学方面与普通动物无异。）近交系：经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。特点： 1、其基因纯合度达到98.6%，个体差异小，似同卵双生反应一致重复性好，用少量动物即可获得精确度很高的实验结果，个体相互之间可以接受皮肤、器官移植。 2、隐性基因纯合使许多病态性状得以暴露，可获得大量先天性畸形及先天性疾病的动物模型.如高血压、白内障、糖尿病.动物模型。缺点：出现近交衰退。近交衰退是近交过程中动物群体由于基因分离与纯合发生一系列不利于个体或群体发育的变化和现象。 F1代动物：两个无关近交系杂交形成的第一代动物。特点：虽然基因杂合，但个体之间基因杂合的一致,个体差异小。除具有近交系的优点,还具有生命力强耐受性强,可长期进行观察，具有杂交优势，个体相互之间可以接受皮肤、器官移植。封闭群动物（远交系）：以非近亲交配方式繁殖生产的一个实验动物种群，5年以上不从外部引新血缘或至少繁殖四代以上，在封闭条件下交配繁殖，保持了一定杂合性和群体遗传特征。每代近交系数增加量<1％。在人类遗传研究、药物筛选、毒物实验等方面起着不可代替的作用等。突变系动物：指正常染色体的基因发生了变异，动物具有一种或多种遗传缺陷。例如：无胸腺裸鼠、严重联合免疫缺陷动物SCID小鼠。为肿瘤、免疫疾病的研究提供了理想的材料。

高中生物动物细胞培养和核移植技术教案新人教版选修3

动物细胞培养和核移植技术备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课教学目标知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。过程与方法情感态度与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯物主义观念。教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。教学用具多媒体课件课时安排1课时教学内容设计与反思板书设计:

教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。（1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养植物体细胞杂交（2）植物体细胞杂交的结果是产生了？（3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？二、讲授新课: （一）动物细胞工程动物细胞工程常用的技术手段动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。（二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程：引导学生阅读课文44--46面相关内容。

普通动物学实习报告

动物学课程实习报告一、实习目的和要求; 1,通过实习，掌握潮间带的标本的采集方法 2，学会将采集到的标本进行浸泡和处理 3，将学过的知识更好的应用于实践，对采集的标本进行分类，学以致用，增强对课本知识的理解 4，了解湛江潮间带的常见物种。二、实习时间和地点：5月7号到5月20号，雷州珍稀水生动物省级自然保护区,南三岛和兴海楼实验室三、实习内容 1、海洋环境的介绍：主要讲解潮间带的环境情况，动物的分布特点，湛江沿海潮间带主要经济类群，其养殖现状。了解潮汐活动的一般规律。 2、实习方法介绍和固定药品的配制方法。 3、潮间带不同动物的采集和处理方法，观察动物的生态环境和形态特征。要求学生最少采集7—8个门的动物种类。 4、标本的具体处理技巧和分类。四、实习工具药品采集工具：大小水桶、大塑料瓶、花铲、锄头、捞网；标本泡制器材：烧杯、玻璃缸、量筒、镊子；药品：甲醛。泡制方法：将甲醛配制成10%的福尔马林，用于浸泡采集到的标本。五、动物分类：（一）多孔动物门 1、日本矶海绵采集地点：潮间带形态特征和简介：群体呈不规则山形，故又称山形海绵。身体柔软具弹性，表面粗糙，橙红或橙黄色。体表有许多管状突起，高约10mm，还有许多不甚明显的细小入水孔，体壁骨针杆状。多分布于岩石海岸的低潮线附近，顾着于海藻下方或岩石的背阴面，常群体连成一片。鉴定：寻常海绵纲单轴海绵目矶海绵科（二）腔肠动物门 2、海鳃采集地点：浅海区和潮间带形态特征和简介：中央茎下部是柄，使群体固定在泥沙中。上部羽茎有水螅体，或分支而著生数个水螅体。中央茎是初级的水螅体，口和触手退化，仅剩一肉质茎，茎的中央有角质棒加固。茎的分支是次生的水螅体。群体上的水螅体有数个到35,000个。从两极到热带深浅海域均有分布。鉴定：珊瑚纲海鳃目 3、草莓海葵采集地点：浅海区和潮间带

动物细胞工程试题及详解

动物细胞工程试题 1用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是（C）A都须用液体培养基 B都需用培养箱 C都要在无菌条件下进行 D都可体现细胞的全能性解析：动物细胞离体培养主要是获得细胞的代谢产物，植物体细胞离体培养体现的是全能性。植物体细胞是固体培养基。动物体细胞培养需要二氧化碳培养箱。动物细胞培养： 1、动物细胞的培养：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 2、动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。 3、动物细胞培养液的特点：液体培养基含动物血清。 4、动物细胞培养需要满足以下条件 (1)充足的营养供给——微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。 (2)适宜的温度：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。 (3)无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 (4)气体环境：95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 5、动物细胞培养的过程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理

分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 2下列关于细胞工程的叙述，错误的是（D） A. 电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B. 去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C. 小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D. 某种植物甲乙两品种的体细胞杂交与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同解析：A正确诱导原生质体融合的方法有物理法（离心振动电刺激）化学法（聚乙二醇PEG）生物方法（灭活的病毒）. B正确去除植物细胞壁需要纤维素酶和果胶酶，将动物组织分散成单个细胞需要胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间。C正确小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合既可以无限增殖，又可产生特异性抗体。D错误，假设甲植物体细胞是2N,乙植物体细胞是2M，甲乙体细胞杂交染色体数目为2N+2M；而甲乙品种杂交染色体数目是N+M。 3制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括（A） ①细胞培养②细胞融合③胚胎移植④细胞核移植 A．①②B．①③C．②③D．③④ 解析：单克隆抗体的制备过程是人工诱导经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，再经筛选获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，经过培养获得的杂交瘤细胞获得单克隆抗体。 4利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（D） A. 用纯化的核衣蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体 B. 体外培养单个浆细胞可以获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体

普通生物学实验整理全套

普通生物学实验内容提要本书共编入20个实验，包括显微镜的使用、细胞、动植物组织、个体解剖以及制片、标本的制作等方面的内容，能帮助学生印证理论，学习和训练基本实验技能。实验后附有思考题，能启发和开阔学生的思路，培养综合与分析问题的能力。本书适合我院本科、基地班及大专生物工程专业学生作为普通生物学实验教材，也可供有关专业人员和中学教师参考。目录实验一显微镜的构造和使用实验二生物绘图技术实验三细胞的形态与结构实验四细胞的有丝分裂实验五植物组织实验六植物组织制片技术实验七叶绿体的制备及其对染料的还原作用实验八植物根的形态与结构实验九植物茎的形态与结构实验十植物叶的形态与结构实验十一植物的繁殖器官实验十二植物腊叶标本的制作实验十三动物组织（一）实验十四动物组织（二）实验十五 ABO血型鉴定实验十六人体动脉血压的测量实验十七血细胞的计数实验十八原索动物及脊椎动物类群（一）鱼类实验十九脊椎动物——鸟类实验二十脊椎动物类群（二）哺乳类

实验一显微镜的构造和使用一、目的要求了解普通光学显微镜的构造和各部分的性能，学习本掌握正确的使用技术二、材料和用品生物切片标本；显微镜；二甲苯、香柏油三、方法和步骤（一）、了解显微镜的构造和性能光学显微镜是研究生物学的常用工具，由一组光学放大系统和支持及调节它的机械系统组成，有的还带有光源部分。其结构见图1。图1 显微镜的结构 1、机械系统（1）、镜座和镜柱镜座是显微镜底部的沉重部分，它使显微镜重心较低，以使之不致倾倒。其上直立的短柱部分为镜柱，支持镜臂和镜台。（2）、镜台又名载物台，是放置玻片标本的平板。其中央有一圆孔，称镜台孔，以便从下方来的光线由此通过。镜台上有压片夹用以固定标本。较好的显微镜装有标本移动器（或称推进尺），既可固定载玻片又可转动螺旋前后左右移动标本。有的标本移动器上还带有标尺，可利用标尺上的刻度寻找所要观察的标本位置。（3）、镜臂为镜柱之上弯曲的部分，以便于持握，有些老式显微镜的镜臂与镜柱之间有一个能活动

动物细胞培养技术实验

实验十五动物细胞培养技术及其应用一．实验目的通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。四．实验方法与步骤（一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。胰蛋白酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛血清。细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,

动物细胞培养技术思考题

《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。你认为精确配制各种溶液？答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。

人教版生物选修三2.2动物细胞工程专项练习题

动物细胞工程专项练习题 1．美国科学家已经在实验室中成功培育出膀胱，并顺利移植到7名患者体内。这种技术为那些急需器官移植的患者带来福音。回答下列问题：（1）科学家从患者的膀胱上取下一小块活细胞样本，将其中的肌肉细胞和膀胱上皮细胞分别置于不同的培养皿中培养。在培养之前，需用 _____处理以分散细胞，将动物组织块消化后的初次培养称为代培养。与植物组织培养的培养基相比，其培养基的主要不同点是含有等一些天然成分。（2）约一周后将培养皿中培养的细胞放在由胶原质制成的“支架”上继续培养，再过7周左右，原先的数万个细胞已经繁殖到15亿个左右，布满“支架”，膀胱上皮在内，肌肉在外，形成“新膀胱”。细胞数目大量增加，其增殖方式是；由这些细胞再形成肌肉和膀胱上皮的过程中要经过。（3）医生将“新膀胱”移植到患者膀胱的上面，这样新器官会继续生长并与老器官“重组”取代老器官中丧失功能的部分。新器官与老器官的“重组” （填“是”或“不是”）基因重组；“新膀胱”移植后， ______________（填“会”或“不会”）引起免疫排斥反应。（4）除上述方法外，还可将患者的体细胞核移入去核的 ______中，利用体细胞技术，形成相应组织、器官用于疾病的治疗。 2．下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物（二倍体）的流程。回答下列问题：（1）图中A 表示正常细胞核，染色体数为2n ，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用_________________的方法。②代表的过程是__________。（2）经过多次传代后，供体细胞中_______________的稳定性会降低，因此，选材时必须关注传代次数。（3）若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是__________________________________。（4）与克隆羊“多莉（利）”培养成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了__________________________。 3．下图为利用小鼠制备抗埃博拉病毒的单克隆抗体过程示意图，图中A ～F 分别表示生物技术或细胞名称，请同答有关问题：（1）若A 细胞是经抗原刺激的小鼠B 淋巴细胞，则B 细胞一般选用__________，C 过程不同于诱导植物原生质体融合的常用诱导因素是____________________。（2）在杂种细胞的培养过程中，为了防止污染，通常还要在细胞培养液中添加一定量的__________。（3）单克隆抗体的制备过程需要经过多次筛选，首先用特定的选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，其具有的特点是_______________，还需进行克隆化培养和__________，最终获得足够数量的________________________，选出符合要求的细胞后，可在体外条件下培养或注射到__________内增殖。（4）利用上述技术生产的单克隆抗体可制作成诊断盒，用于准确、快速诊断埃博拉病毒的感染者，这体现了单克隆抗体____________________的特性。 4．人乳头状瘤病毒（HPV ）与宫颈癌的发生密切相关，抗HPV 的单克隆抗体可以准确检测出HPV ，从而及时监控宫颈癌的发生，以下是以HPV 衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体的过程，请据图回答：（1）单克隆抗体制备过程中涉及的细胞工程技术有________________。（2）将经融合处理后的细胞转到HAT 培养基上培养的目的是，该细胞（填“能”、 “不能”）产生专一性抗体，所产生的抗体（填“一定”、“不一定”）能抗HPV 。（3）对于抗体检测呈______性的杂交瘤细胞克隆应进行克隆化培养，克隆化培养的方法最常用的是有限稀释法，即稀释细胞到3～10个/mL ，每孔加入细胞稀释液______mL （填“0．1”、“1”或“10”），使每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的。（4）科学家从某些无限增殖细胞的细胞质中分离出了无限增殖调控基因（prG ），该基因能激发动物细胞分裂，这为单克隆抗体的制备提供了更多的思路。除本题描述的一种制备单克隆抗体技术外，请再简要写出一种制备单克隆抗体的思路 __________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________。 5．不同类型的细胞表达不同的基因组合。那么不同类型的动物细胞都具有全套基因吗？科学家进行了如图所示的克隆研究。Ⅰ～Ⅶ代表有关过程，a ～h 代表有关结构或个体。据图回答问题： (1)a 细胞的名称是________，选用该细胞作为核移植受体细胞的原因是 ________________________________________________________________________。 (2)对b 的操作方法通常是__________。若g 是能产生人生长激素的羊，则培育g 时，应将人生长激素基因导入___________，为了尽快获得大量的生长激素，但让g 进行有性生殖会丢失目的基因，你将通过________________技术来实现。 (3)从 d 中取出细胞进行培养时，一般不超过______代，原因是 ________________________________________________________________________。此培养过程中与植物细胞培养过程中所用的培养基有何不同？_________________________________。 (4)如果图中的细胞均是人体细胞，则获得的h 细胞或器官可用于供体本人组织器官的移植，其优点是

医学实验动物学简答题

1.简述“近交系动物” 2.经至少连续20代的全同胞亲兄妹或亲子交配培育而成，同品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的共同祖先，该品系称为近交系。 3.近亲交配的弊端固定基因时，有害的隐性基因也会纯合，出现不利的性状而造成育种失败；近交可能导致多基因之间丧失平衡，从而使高度纯化的动物对不良环境的调节适应能力降低；近交使动物失去为保持足够生物适合度所必需的最低水平的基因杂合性，从而影响动物生长率，寿命，对疾病的感受性，生活力，体力及繁殖能力。 4.简述“封闭群动物” 以非近交交配方式进行繁殖生产的一个实验动物种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上，称为一个封闭群，或叫远交群。 5.简述“哨兵动物” 指为微生物检测所设置的指示动物，用于监控实验动物饲养环境中病原及病原感染的动物。哨兵动物一般采用来源于与被监测动物遗传背景相同的、免疫功能正常的清洁级或SPF级封闭群动物。通常有二个功能：1. 实验初期意外缺损时的补充；2. 微生物定期检测 6.简述空气洁净度“级”的含义，各种动物实验环境设施对“级”的要求是什么级是空气洁净度的计量单位，含义:每立方英尺空气中含有大于等于0.5μm的尘埃粒子数。屏障环境：洁净度7级(英美制一万级)；隔离环境：洁净度5级(英美制一百级) 7.简述营养动物从外界摄取自身所需要的食物，经消化、吸收，用来维持生命活动的行为或作用。

8.简述标准化饲料根据不同动物的营养需求和动物的食性，经人工配合、加工而成的营养全面、适口性好、符合微生物要求的饲料。 9.简述颗粒饲料优越性 ①原料配合合理，符合营养标准和不同动物的食性；②加工过程中经过高温、挤压，杀灭了大量微生物和寄生虫，普通级动物可直接饲喂；③压制成型，避免了动物采食过程中的大量浪费；④大幅度减少了粉尘；⑤颗粒饲料有利于进一步包装灭菌处理。 10.简述人类疾病动物模型的定义和分类定义：在生物医药研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和材料。分类：诱发性动物疾病模型、自发性动物模型、抗疾病型动物模型、生物医学动物模型11.简述安乐死在动物实验过程中或结束时，对不欲保留的动物（动物承受不可缓解的疼痛、非存活手术和样本采集），实施痛苦感最低或者无痛苦感死亡的科学方法。 12.裸鼠的解剖生理特点 ①毛囊发育不良，外观几乎全身没有被毛，称裸体外表，故称“裸鼠”；②胸腺严重萎缩，仅有胸腺残迹或异常的胸腺上皮。故不能分泌胸腺素，不能使T细胞正常分化，因而细胞免疫力低下；③IgG的产生需要T细胞和巨噬细胞的参与，因此其免疫球蛋白主要是IgM，只有极少量的IgG；④自发肿瘤现象罕见，可能与NK细胞的活性高有关；⑤裸鼠易患鼠肝炎和病毒性肺炎；⑥纯合裸鼠母性极差，且受孕率低，乳房发育不良。通常以纯合雄鼠与带有nu基因的杂合雌鼠交配，可获1/2裸小鼠；⑦必须饲养在屏障环境中。 13.在动物实验设计、实施和完成阶段，有关动物福利和保护环境方面我们应该注重哪些？

动物细胞培养及应用发展史

细胞培养技术

细胞培养发展史及其应用（一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。（二）细胞培养技术及其历史细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。

动物细胞工程(1)

第三节动物细胞工程动物细胞与组织培养、细胞核移植与动物体细胞克隆学习目标： 1.简述动物细胞培养的过程、条件及其应用； 2.简述克隆动物的概念含义和基本原理； 3.简述体细胞核移植技术和动物克隆技术，以及应用前景；课前导学：一、动物细胞工程包括的主要技术动物细胞工程的主要技术包括____ 、_____ 、___ ___、_______________、________________等技术。其中_________________________是其他动物细胞工程技术的基础。二、动物细胞与组织培养 1．概念：动物细胞与组织培养是指在体模拟____ _ __，将动物细胞或组织在无菌、温度适宜和营养充足的条件下培养，使其、并维持原有和的技术。 2. 材料：动物或出生不久的的器官或组织。 3. 过程：（1）动物细胞培养：（2）动物组织培养：（3）动物细胞培养和动物组织培养的区别：动物细胞培养过程中需要用 __________________等使________________________________________________。 4.培养条件：（1）温度：最适温度是°C左右。（2）PH：最适PH范围是_______。（3）气体：主要是和，气体的含量不仅影响培养环境的，还直接影响。（4）营养物质：如、无机盐、氨基酸、维生素、核酸、嘌呤、嘧啶、和生长因子等。 5.培养基的种类：天然培养基：主要取自动物血清、动物组织提取液和鸡胚汁等，具有营养价值高、成分复杂的特点。合成培养基：人工配制的，具有成分明确、便于控制实验条件的特点。缺点是缺乏天然培养

常用的五种动物细胞培养方式

?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

细胞实验室

一．建设方案之动物细胞培养实验室（设备片）在生命科学科领域中细胞学有着至关重要的地位，近年来细胞学发展迅速，并取得了相当大的进展，细胞学相关实验室的建设也是各个研究院及院校生物学科必备的实验室。细胞相关实验所需仪器及耗材种类繁多，接下来就细胞培养实验室常用仪器作下简单介绍：一、纯水系统细胞培养用水一般要求双蒸水（0.8MΩ以上），实际上普通蒸馏水经玻璃器皿中按标准方法蒸馏二次得到的双蒸水是不能满足要求的，而且水中的内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。因此建议配置正式的水纯化系统。二、液氮罐为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃，因此，需要液氮罐。在此环境中，一般细胞可以保存十年具有活性。三、超净工作台/生物安全柜细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行，因此超净工作台或生物安全柜就必须配备。四、CO2培养箱 CO2培养箱是细胞培养的必备仪器，它为细胞提供了一个体外培养的舒适环境，如适宜的温度、湿度、酸碱度、O2浓度等。细胞在体外培养时很容易受到各种细菌、微生物的感染，因此，CO2培养箱的灭菌和抑菌能力就显得尤为重要。五、恒温水浴从液氮或超低温冰箱中取出细胞冻存管需要立即放于37℃水浴中快速复苏之后才传代培养，因此，恒温水浴也是细胞实验室必备仪器。六、超低温冰箱细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般4℃下存放30 min，转放-20℃ 1 hour，再转入-70至-80℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)，这时就必须配备一台-86℃超低温冰箱。一般超低温冰箱保存细胞可达数月，对于不需要长期冻存的细胞，可暂时放于超低温冰箱保存。七、离心机细胞培养需要离心收集传代细胞，所以需要配置低速的常温离心机，对于后期细胞内容物的

动物细胞工程实验指导讲解

实验时间实验内容 4月11日实验一培养用液的配制、除菌与分装 4月18日实验二细胞的传代培养 4月25日实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401 实验四染色体制备（6-10组）301 5月2日实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401 实验四染色体制备（1-5组）301 5月9日实验五细胞的复苏与冻存

实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】 1.掌握常见培养用液的配制方法。 2.掌握常用的灭菌方法。 3.了解每种培养用液的作用。【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS 材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。【实验步骤】 1．PBS（1000mL）的配制分别称取NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g ；KH2PO4 0.2g于烧杯，加入800 mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS 用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。

普通动物学考研复习题教程文件

2011普通动物学考研复习题

2011动物学复习题一、简答（26分） 1.为什么爬行动物是真正的陆生动物。（7分）（1）体披骨质鳞片或骨板，皮肤干燥，缺乏皮肤腺；（1分）（2）具真正的牙齿。具次生颚，内鼻孔后移，口腔与鼻腔分开；（1分）（3）胸椎、肋骨与胸骨形成胸廓，可保护内脏和加强呼吸作用；（1分）（4）大、小肠交界处开始出现盲肠，可消化纤维；（1分）（5）具有羊膜动物式的排泄器官后肾；（1分）（6）大脑明显分为两半球，纹状体，表层出现神经细胞集中的新脑皮；（1分）（7）完全脱离水的束缚，在陆地繁殖，体内受精。（1分） 2.两栖类对陆生的初步适应和不完善性？（6分）（1）陆生的初步适应：基本解决了在陆地运动（1分）、呼吸空气（1分），同时发展了适于陆生的感官和神经系统（1分）。（2）不完善性：肺呼吸的功能不够强，尚需皮肤呼吸和鳃呼吸加以辅助（1分）；皮肤裸露，保持体内水分的问题没有解决（1分）；不能在陆地上繁殖，卵受精、卵发育、幼体发育均在水中进行（1分）。 3.举例说明鸟类是如何完成双重呼吸的。（8分）（1）肺：一个由各级支气管形成的彼此吻合的密网状管道系统。当气管进入胸腔后分为左、右支气管，即初级支气管，然后再分支为次级支气管、三级支气管，三级支气管再分支出许多微支气管。（2分）（2）气囊：鸟类特有。是呼吸的辅助系统，由单层上皮细胞膜围成，无气体交换功能，共4对半，位于体壁与内脏之间。（1分）后气囊：腹气囊一对和后胸气囊一对（1分）前气囊：锁间气囊一个、颈气囊一对、前胸气囊一对（1分）（3）“dpv”系统、单向流、双重呼吸概念（3分） 4．学习行为及其类型？（5分）（1）学习行为是动物由经验得来的发生适应性改变的行为。（2分）

普通动物学实验教学大纲

生物科学专业普通动物学实验教学大纲实验1 动物的组织和早期胚胎发育一、实验目的 1．了解动物的4类基本组织的结构和功能。 2．了解动物的早期胚胎发育过程。二、实验内容 (一)上皮组织：复层扁平上皮。 (二)结缔组织：疏松结缔组织；透明软骨、兔的血液装片、骨磨片。 (三)肌肉组织：横纹肌、平滑肌。 (四)神经组织：脊髓的前角细胞。（五）文昌鱼早期胚胎发育各期装片观察。三、实验难点和重点 (一)疏松结缔组织：家兔处死、取样及制片观察；主要结构：胶原纤维，弹性纤维。 (二)血液组织：家兔心脏取血及处理方法，涂片方法。各种血成分的辨认：红细胞、白细胞、血浆等。 (三)肌肉组织：骨骼肌（横纹肌）、平滑肌、心肌。 (四)上皮组织(复层扁平上皮)：食道多层扁平细胞。 (五)软骨组织：（六）文昌鱼早期胚胎发育装片观察单细胞期、2细胞时期、4细胞时期、8细胞时期、多细胞时期；囊胚期；原肠胚。实验2 眼虫和变形虫一、实验目的通过眼虫、变形虫及其他鞭毛虫、肉足虫的观察，了解鞭毛虫纲与肉足纲的主要特点，并认识一些有经济价值或常见的种类。二、实验内容 (一)眼虫和变形虫的观察。三、实验重点和难点

(一)眼虫的的观察方法和主要结构。 (二)变形虫的观察方法和主要结构：实验3 草履虫的观察一、实验目的通过草履虫及其他纤毛虫的观察，了解纤毛纲的主要特征并认识一些习见的种类。二、实验内容 (一)草履虫的观察。 (二)示范：棘尾虫、钟虫和喇叭虫。三、实验重点和难点草履虫的形态结构及运动方式。口沟、胞口、胞咽；食物泡；伸缩泡、收集管。大核、小核。实验4 水螅的观察一、实验目的通过对水螅及其他腔肠动物的观察，了解腔肠动物门的主要特征。二、实验内容（一）水螅活体的观察（二）水螅切片和装片的观察（三）腔肠动物主要类群标本的观察三、实验重点与难点 (一)水螅的观察：外形特征：体型；基盘、垂唇、触手。内部结构：外胚层、中胶层和内胚层；消化循环腔；外皮肌细胞、间细胞、刺细胞（刺丝囊）、腺细胞。实验5 涡虫的观察一、实验目的