皮肤科实验室检查技术操作常规原始版..

常见皮肤科

实验室检查技术操作常规

一．真菌（癣菌）直接镜检

【方法】

1．取材部位：临床医师采取头癣，体癣，股癣，足癣，甲癣标本。

2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴5-10%KOH，加盖玻片，在酒精灯火焰上过三次以消化角质蛋白，普通光学显微镜下检查。

【结果判断】

可见真菌菌丝和/或孢子，可判断为阳性。

二．疥螨虫镜检

【方法】

1．取材部位：临床医师采取标本。

2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴5-10%KOH（或加NS），加盖玻片，在酒精灯火焰上过三次以消化角质蛋白，普通光学显微镜下检查。

【结果判断】

见到以下任何一项均可判断为阳性。

1．成虫：低倍镜下看到完整或破碎的成虫。如用NS，有可能发现活动的成虫。

2．虫卵：可以见到虫体的同时见到成堆或散在的虫卵。

三．阴虱检查

【方法】

1．取材部位：临床医师夹取标本。

2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴NS，加盖玻片，普通光学显微镜下检查。

【结果判断】

见到以下任何一项均可判断为阳性。

1．成虫：低倍镜下看到完整或破碎的成虫。如用NS，有可能发现活动的成虫。

2．虫卵：可以见到虫体的同时见到成堆或散在的虫卵。

四．毛囊虫（蠕螨）的检查

【方法】

临床医师采取，在扩张的毛囊口挤压出一点皮脂或用刀片刮出些皮脂，在载玻片加一滴

液体石蜡或甘油，加盖片轻压使皮脂变薄，普通光学显微镜下检查。

【结果判断】

低倍镜下发现活的毛囊虫，可判断为阳性。

五、淋球菌检查

（一）淋球菌直接镜检

【方法】

1．男性患者：先用NS拭尽尿道口，手指挤出尿道内脓液，用无菌棉拭子沾取脓液涂在载物玻片上。

2．女性患者取宫颈口脓液，用无菌棉拭子沾取脓液涂在载物玻片上。

3．自然干燥后，革兰染色或美兰染色待检。

【结果判断】

涂片中见大量多形核白细胞，细胞内有革兰氏阴性球菌，呈卵圆形或圆形，成对排列。为阳性结果。

（二）淋球菌培养

【方法】

临床取材后，立即接种于培养基中，不得冷藏后再接种。在5-10% CO2，37度培养24-48小时后观察结果。（市场上可见试剂盒）

【结果判断】

在血平皿可见圆形，平滑，透明或灰白色菌落，直径0.5-1.0mm，革兰氏染色阴性。必要时，做生化检查确定菌种。

六、衣原体检查

（一）免疫荧光法

【方法】

取材方法：男性患者用白金耳或特制尿道棉拭子插入尿道口内2-4cm，转动1周，停留约10秒钟后取出分泌物；女性患者经窥阴器暴露宫颈，用无菌拭子蘸去宫颈表面分泌物，用另外一个干净拭子伸入宫颈口内1-2cm，转动1周，停留10秒钟后取出分泌物。

取材后用试子头部在载玻片上涂片，无水乙醇室温固定15分钟，室温晾干，加荧光标记的衣原体单克隆抗体，37℃温育30分钟后磷酸盐缓冲液洗涤次。封片后在荧光显微镜下观察结果。

【结果判断】

阳性标本可以见到亮绿色包涵体。敏感性可达70-90%。

（二）细胞培养法

【方法】

1.标本取材方法同“免疫荧光法”。取材后标本可以直接接种，也可-80℃保存备用。

2.利用滋养细胞培养沙眼衣原体。将MyCoy细胞（或Hela细胞）种植于含圆形盖玻片或不含盖玻片的24孔塑料细胞培养板。细胞生长液是含10%胎牛血清Dulbecco改良的MEN 培养液。

3.标本接种标本化冻后将标本管蜗旋振荡15-30秒。将24孔塑料细胞培养板内的细胞培养液吸取，每孔加入0.2-0.3ml接种物，每份标本接种两孔，一孔接种含盖玻片的24孔细胞培养板，另一孔接种不含盖玻片的24细胞培养板。同事将沙眼衣原体血清型E和L2/434/Bu用衣原体培养液1:400稀释，每孔加入0.2-0.3ml作为阳性对照，仅加入衣原体培养液的孔作为阴性对照。接种完毕后离心细胞培养板（×1500g，1小时，35℃）。培养板37℃静置2小时，然后吸去接种物病加入衣原体培养液（含万古霉素、庆大霉素、两性霉素B、放线菌酮等），37℃和5%二氧化碳培养72小时。

4、荧光抗体染色鉴定吸取培养板孔内的培养液，PBS洗涤2次，无水乙醇室温固定15分钟，室温晾干，取出盖玻片，加入抗沙眼衣原体单克隆荧光抗体。37℃温育30分钟后磷酸盐缓冲液洗涤3次。封片后在荧光显微镜下观察结果。

【结果判断】

荧光显微镜下观察，细胞内有3个以上苹果绿色的荧光颗粒者判作阳性。阴性标本的另一不含盖玻片的孔应进行盲传，即用超声波破碎机打击该孔，接种在新一代McCoy细胞上。同样的方法再次荧光抗体染色，鉴定培养结果。

（三）快速酶分析法

【方法】

取材方法同“免疫荧光法”

目前国内外许多生物技术公司都提供沙眼衣原体快速酶免疫分析（EIA）试剂盒，不同厂家对试验要求不尽相同，操作方法有所不同。可以参照试剂盒上提供的具体操作步骤进行。

【结果判断】

通过显色条带肉眼观察，也可采用酶标仪测定结果。此方法的特点时快速、简单，不足之处在于敏感性较低，原因与这种检查需要疣足够多的抗原量有关。

七、疱疹病毒免疫荧光法检查

【方法】

1.取材部位

在新发生1-天内的水疱部位取材（新发疱疹处存在的病毒数量最多，随着疱疹破溃、愈合、病毒数量迅速减少）。

2.操作方法

用手术刀或钝刀将水疱挑破，刮取基底部为取材，然后图片，室温干燥后用冷丙酮固定10分钟，磷酸盐缓冲液洗2次，加入荧光素标记抗HSV抗体，37℃温育30分钟后乙酸盐缓冲液洗涤3次。封片后在荧光显微镜下观察结果。

【结果判断】

阳性结果：细胞内可见亮绿色着色。

八、阴道毛滴虫直接镜检

【方法】

在载玻片上加1滴生理盐水，将棉拭子蘸取阴道分泌物（男性为尿道分泌物或前列腺液）混入盐水中，立即在显微镜下查看。

【结果判断】

镜下见到呈波状移动的毛滴虫为阳性。有时可见毛滴虫周围的白细胞被推移。

九、皮肤斑贴试验

【方法】

1. 试验部位：上背部脊柱两侧的正常皮肤。

2. 去除斑试器的保护纸、将准备好的变应原按顺序置于铝制斑试器内。斑试物排练顺序为自上→下，自左→右并做标记。斑试剂用量，软膏制剂用25ul 直接放入斑试器中，液体制剂用25ul 滴在放入斑试器中的滤纸片上（10号甲醛）。注意加斑试物时尽量不要沾到斑试器边缘。

3. 将加有斑试物的斑试器胶带自下向上贴牢、贴平并用手掌轻轻压几下，以便排出空气。

4. 斑贴试验时间：48小时。

5. 观察结果时间：贴敷后48小时，首先去除斑试器，为避免斑试器压迫皮肤所可能造成的反应，应在去除斑试器至少30分钟后观察结果。

斑贴试验注意事项：

1. 皮炎急性期不易作斑贴试验，病人应在皮炎完全消退两周后作斑贴试验。

2. 必须嘱咐受试者，如发生强烈反应，可随时去掉斑试物。

3. 病人受试前两周及受试期间不要内服皮质类固醇激素（强的松15mg/日即可抑制斑贴试验反应），试验前两天及受试期间易停用抗组织胺类药物。

4. 斑试期间不易洗澡、饮酒及搔挠斑试部位。

5. 应保持斑试物在皮肤上48小时，尽量不要过早地去除斑试物，试验部位要有标记，胶带粘贴一定要密闭，以避免出现假阳性结果。必要时（如高度怀疑对该变应原过敏而72小时呈阴性者），在斑贴后第七天进行第三次观察或重复试验。

6. 斑贴过筛试验的同时，不应忽视对患者实际接触的可疑制敏物质进行斑贴试验。

【结果判断】

（－）：无反应。

（+ ）：红斑。

（+ + ）：红斑、水肿。

（+ + + ）：红斑、水肿，并出现水疱。

（+ + + + ）：红斑、水肿。

十．梅毒实验室诊断

（一）快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）

【方法】采集患者血样，收集血清。

1．定性试验：将被检血清0.05ml（血浆也可）加于专用纸卡的反应圈内（内径18mm），并铺展均匀。继用经校准过的平口针头（60±2滴/ml）垂直加1滴RPR抗原悬液于反应圈内的血清中，100r/min机械式手工转动8min。于光线充足处及时以肉眼观看结果。必要时可稍许倾斜卡纸，以助观看。

2．半定量试验：取一排试管，用生理盐水将被检血清作倍比稀释。其余操作同定性试验。以发生凝集反应的最高稀释度为该血清的反应素滴度。按下法报告结果：非反应性（N）：炭粒均匀悬浮或中央呈集一点。反应性（R）：出现特征性炭黑凝集而不论其凝集程度。凡反应性结果的血清应再做半定量试验，标明其滴度。

每次试验时用已知阳性血清作为阳性对照。

【结果判断】

阳性圆圈内出现黑色凝集颗粒或絮片，根据沉积物的多少记录为++、+或+-。

阴性不出现沉积物

主要用于初筛实验或治疗后随访。

（二）不需要加热血清反应素试验（USR）

【方法】

玻片定性实验(1)吸取待检血清(不必灭活)0.05ml，加于玻片的圆圈中，并分散到整个圆圈。用1ml注射器专用针头吸取抗原，每份待检标本上滴加1滴，摇动玻片4分钟，观察结果。

定量试验同RPR

【结果判断】

先用肉眼观察，再用低倍显微镜(放大100倍)观察抗原颗粒或凝集沉淀，按以下方式记录实验结果。

阴性（-）：颗粒细小，分布均匀。

可疑阳性（±）：颗粒分布不规则，或为细小的粗糙物。

弱阳性（+）：在显微镜下可见小块状物，均匀分布。

阳性（+ +）：肉眼可见小块状物，在显微镜下可见较大的块状物，悬液清亮。

强阳性（+ + + ~ + + + +）：肉眼可见大或较大的块状物。

玻片半定量实验玻片定性实验阳性[(+ +)以上]者做半定量实验，以进一步诊断。先将待检血清用0.9%氯化钠稀释成6个稀释度，即血清原液1：2、1：4、1：8、1：16、1：32，各取0.05ml稀释血清加在玻片的圆圈内，按定性实验方法操作和判定结果。

主要用于初筛实验或治疗后随访

（三）性病研究实验室试验（VDRL）

【方法】

1.VDRL抗原配置方法

（1）吸取0.3mlVDRL缓冲液置30ml小瓶。

（2）吸取0.3mlVDRL抗原逐滴迅速加入小瓶内的VDRL缓冲液内（约4秒钟），随后摇动10秒钟，使之混匀。

（3）立即加入2.4mlVDRL缓冲液，盖上瓶盖，来回颠倒摇动小瓶10秒钟30次，即为VDRL抗原。此抗原仅可用1天。

2.VDRL玻片定性和定量试验

方法与USR试验完全相同，由于VDRL抗原配置时混悬的技术较高，而配置成的VDRL 抗原仅可使用1天，往往会造成抗原的浪费（每次最少需配置约200人份量），而且待测血清需在试验前灭火，故给实验室带来许多不变，临床上除用脑脊液检查外已甚少用此方法。

（四）梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）

【试验原理】

试验血球为用螺旋体特异性抗原包被经过醛化和鞣化的鸡红细胞，对照血球为没有用上述抗原包被的经过醛化和鞣化的鸡红细胞，如果是阳性标本，当和致敏的鸡红细胞混合后，抗体和抗原的结合会引起致敏血球的凝集，在血凝板底部形成凝集块，如为阴性标本，则血细胞在孔底形成致密的沉淀。

【操作方法】

1.在反应板的第一排：每孔加25ul（1滴）稀释液

2.在反应板的第二排：每孔加100ul（4滴）稀释液

3.在反应板的第三排和第四排：每孔加25ul（1滴）稀释液。

4.取标本25ul，加在第一排的孔中。

5.对样品进行以下稀释：用25ul移液器将加样后的第一排孔中的液体混匀后取出

25ul加入第二排的孔中，混匀后再取25ul加入第三排的孔中，混匀后，从第三排

孔中吸出25ul丢弃，另从第二排孔中取25ul加入第四排孔中，混匀后，再从第四

排孔中吸25ul丢弃。

6.在第四排孔中加25ul（1滴）试验细胞悬液，在第三排孔中加75ul（1滴）对照细

胞悬液。轻轻摇晃反应板后加盖静置45~60分钟后判读结果。

【结果判断】

目测：凡出现细胞凝集者为阳性反应，不出现凝集者为阴性反应。

—/不凝集：细胞沉积在板孔中央呈边缘光滑的纽扣状；

±/可凝：细胞沉积在板孔中央呈边缘光滑的环状；

＋/凝集：细胞形成多边形或不规则环状沉积；

2+~4+/强凝集：细胞形成边缘粗糙不规则形状或薄膜状覆盖到板孔底。

加入对照血细胞的反应孔不应出现凝集，如果出现凝集，说明存在抗血细胞抗体，应重复试验。重复试验时，应先用对照细胞悬液将细胞悬液将标本按1：4稀释，在室温静置45~60分钟，再经1000rpm离心5分钟，取上清液按1：5稀释，再进行试验，如果加入试验细胞悬液仍出现凝集，可判为阳性结果。

【注意事项】

1.反应板使用前最好使用清洁液处理后，凉干后再使用。

2.将试剂从冰箱取出后平衡至室温，充分混匀后进行试验。

3.室温应保持在25-30，建议放入28℃恒温箱中。

4.结果判断应严格按操作时间进行。

5.如因运输中有试剂盒倒置或振动，造成部分悬液中的细胞粘在瓶盖上，在操作中

切勿将粘在瓶盖上的细胞再混入悬液中，否则可能会影响试验结果。

主要用于确证试验

（五）梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）

【材料】

1.溶解溶液A：用于溶解致敏颗粒C和非致敏颗粒D。

2.血清稀释液B：用于稀释血清标本。

3.致敏颗粒C

4.非致敏颗粒D

5.对照用阳性血清E

6.U型反应板。

【方法】

1.吸取B液100μl加入第1孔，B液25μl分别加入第2至第10孔中。

2.血清稀释，吸取待检血清25μl放入第1孔，混匀后吸取25μl到第2孔，重复其稀释步骤至第10孔时，混匀后弃去25μl液体;。

3.滴加致敏和未致敏颗粒，混匀细胞工作液，第3孔加25μl未致敏颗粒;第4至第10孔加25μl致敏颗粒；颗粒加入完毕，将反应板置微量振荡器上振荡30s，置湿盒内，15℃-25℃孵育2h观察结果。

【结果】

+ +~ + + + +：颗粒凝集覆盖整个孔底，多边形膜状，边缘粗糙。

+：颗粒凝集呈多边形性粗糙大环状。

±：颗粒浓集呈边缘光滑小环状。

阴性- ：颗粒聚集在孔底中央、光亮、边缘光滑。

定量试验以出现阳性反应(1+)的最高稀释度作为最终滴度。

主要用于确证试验

（六）荧光螺旋体抗体吸收实验（FTA-ABS）【方法】

1.抗原片制备：Nichols株梅毒螺旋体（每高倍视野20条）抗原悬液，在玻片上涂数个直径为5mm的菌膜，干后以甲醇固定。

2.待检血清预处理：待检血清先经56%30分钟灭活，取50ul血清与200ul吸附剂（Reiter 株非致病密螺旋体）混匀，37℃作用30分钟，以充分吸除非特异性抗体。

3.夹心法荧光显色：吸附后的待检血清用磷酸盐缓冲液（PBS）作1;20—1:320的倍比稀释，将稀释后的血清分别滴加于抗原菌膜上，置湿盒内37℃孵育30分钟，然后用PBS 洗片，并将玻片在PBS中浸洗，换液3次，每次5分钟，吹干。各抗原反应片上滴加工作浓度荧光素标记的羊抗人lgG抗体，置湿盒37℃孵育30分钟，再用PBS按前法洗片，干后用甘油缓冲液封片。

4.荧光显微镜观察：每次实验设阳性、阴性、非特异性血清对照。阴性标准血清无荧光

菌体或偶尔见荧光菌体出现：阳性对照可见多数（高倍视野15条）荧光菌体出现。并以此为参照作出待检标本的判定。

【结果】

1.在镜下可见螺旋体呈亮绿色为阳性。

2.根据亮度的强弱区分阳性结果的强度为（+~ + + + +）。

3.无荧光为阴性。

主要用于确证试验

十一、皮肤组织活检法