高产蛋白酶的芽孢杆菌菌株选育

高产蛋白酶的芽孢杆菌菌株选育

学校河北农业大学

专业生命科学学院

姓名xxx

学号x

指导老师x

同组人员x

二〇一三年十二月二十五日

（河北农业大学生命科学学院，河北保定，071000）

摘要：目的：通过筛选诱变选育高产蛋白酶，为食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业提供材料基础。方法: 通过在富含蛋白质的场所的针对性采集土样，菌落平板筛选结合紫外线诱变育种，选育高产蛋白酶的芽孢杆菌，通过一系列鉴别性培养基鉴

定其生理生化特性，查找其种属。结果：通过筛选得到一诱变菌种，通过伯杰氏手册鉴定其为枯草芽孢杆菌属。诱变90s后，其蛋白酶活性提高最大。

关键词：高产蛋白酶芽孢杆菌诱变鉴定

引言：蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。本实验以树林土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，筛选得到高产蛋白酶菌株。

High protease of Bacillus Strain Breeding

Abstract:Objective: by screening the mutation breeding of high yield protease, food, pharmaceutical, cosmetics, detergent, spinning, fur softening provides basic material industry. Methods: the protein rich places for collecting soil samples, colony plate screening combined with ultraviolet mutagenesis breeding, breeding of high yield protease of Bacillus, cultivate their physiological and biochemical characteristics based identification through a series of differential, find the species. Results: by screening a mutagenic strain, through Berger's manual was identified as Bacillus subtilis. Mutation in 90s, the protease activity increased.

Keywords: high yield protease from Bacillus mutagenesis and identification

目录

1材料和方法 (3)

1.1 试验材料 (3)

1.1.1 供试材料及菌株 (3)

1.1.2 供试试剂 (4)

1.1.3 供试培养基、营养液的配备 (4)

1.1.4 主要仪器和设备 (4)

1.2方法 (4)

1.2.1菌株的分离筛选 (4)

1.2.2 菌株的纯化 (4)

1.2.3 紫外诱变 (5)

1.2.5 生理生化鉴定 (5)

2结果分析 (7)

2.1菌落分离筛选结果 (7)

2.2诱变后菌落观察结果 (7)

2.3生理生化鉴定结果 (8)

3讨论 (9)

1材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料及菌株

地表下10~15cm的土壤（取自河北农大西校区E座旁的小树林）及筛选获得的蛋白酶产生菌株

1.1.2 供试试剂

吲哚试剂，40%氢氧化钾，α—萘酚，香柏油，碘液，结晶紫染液，蒸馏水等

1.1.3 供试培养基、营养液的配备

改良牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉20g，加水定容至1L,调pH至7.4 用前加入适量牛奶，

硝酸盐还原试验培养基：硝酸钾0.2g ，蛋白胨5g，加入1000ml蒸馏水中溶解，调pH至7.4，

硝酸盐还原试验A液：对氨基苯硫酸0.5g，冰醋酸（10%左右）150ml，

硝酸盐还原试验B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20ml，冰醋酸（10%左右）150ml，

石蕊牛奶培养基：2.5%石蕊4ml，脱脂牛奶100ml（10g奶粉溶于1000ml水中），

VP试验培养基：磷酸氢二钾5g，多价胨7g，葡萄糖5g，溶于1000ml蒸馏水中，调pH至7.8

葡萄糖发酵培养基：磷酸氢二铵1g，酵母膏0.2g，氯化钾0.2g，葡萄糖10g，七水和硫酸镁0.2g，溴甲酚紫0.04%20ml，溶于1000ml水中，加入琼脂5-6g，加热煮沸，

淀粉培养基：1g淀粉，10ml冷水和100ml营养琼脂，加热煮沸混合，

柠檬酸盐培养基：氯化钠5g，七水和硫酸镁0.2g，磷酸氢二铵1g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸5g，溴麝香草酚蓝溶液4ml，酚红试剂适量，校正pH6.8，加入琼脂2g熔化（试管斜面），

吲哚试验培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。调pH至7.6。

以上各种培养基在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。

1.1.4 主要仪器和设备

恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴锅，磁力搅拌器，显微镜，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环（针），酒精灯，载玻片，吸水纸、显微镜等。

1.2方法

1.2.1菌株的分离筛选

制备平板:融化牛肉膏蛋白胨培养基，每瓶加入20ml无菌牛奶，混合后倒平板6个，贴上标签，

制菌悬液:称5g土壤溶于45ml无菌水中，震荡，80℃水浴10分钟，静置后取上清1ml 加入9ml无菌水于灭菌试管中混匀，，分别配成10-1、10-2、10-3、10-4的梯度稀释液，并编号。

涂布:取10-2、10-3、10-4的稀释液1ml，均匀涂布于牛奶平板上，每种浓度倒两个板。

培养:37℃倒置培养。

1.2.2 菌株的纯化

挑取具有蛋白水解圈的菌落于另一个平板上划线纯化，经斜面培养后于4℃冰箱中保