第三章 细胞破碎技术
第二章细胞破碎和分离提取技术
2．1细胞破碎技术
许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如：青霉素酰化酶，碱性磷酸酶等胞内酶，干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质，这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎，使目标产物释放出来，然后进行分离纯化。如图所示：
图胞内产品的分离纯化过程
2．1．1细胞破碎方法及机理
破碎细胞的目的是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大渗透性）或破碎、释放其中的目标产物，主要采用的方法有机械法和非机械法两大类，图1列出了一些主要方法：
破碎方法
固体剪切作用液体剪切作用干燥处理溶胞作用
珠磨法压榨法高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法
撞击法
图1 细胞破碎方法分类
机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，化学破碎则利用化学或生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下，使细胞膜破裂而释放胞内物质，各作用力细胞破碎机理如图2
2.1.2机械方法破碎
机械破碎处理量大，破碎速度较快，时间短，效率较高，是工业规模细胞破碎的重要手段，细胞受到挤压，剪切和撞击作用，易被破碎在许多情况下，细胞内含物全部释放出来，由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施，机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、
撞击破碎法和超声波等方法。
2.1.2.1 珠磨法（Bead milling ）
珠磨法是一种有效的常用的机械破碎方法，珠磨机是珠磨法所采用的设备，其结构示意图3，细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，在珠磨机中，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。
珠磨法破碎细胞可采用间歇式连续操作，研究表明，两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为：
t k l S 11
n ?=-
其中， t 在间歇操作时，为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间，即R V
t =，其中V 为悬浮液体积m 3，Q 为悬浮液流量m 3/S ，S 为破碎率，k 为破碎
速率常数，与许多因素有关。
珠磨法破碎受许多操作参数的影响，总结在表1中：
同一进料速度，细胞浓度越高，则破碎率越高，所需能耗越低；同时我们也能发现，破碎率越高所需能耗越大（同一悬浮液中）即破碎的能耗与破碎率成正比，提高破碎率，需要增加装珠量，或延长破碎时间，或提高转速，这些措施不仅导致电能消耗增加，且产生较多热量，引起浆液温度升高增加制冷量，因而总能量消耗增加。
珠磨法操作简便稳定，破碎率可控制，易放大，在实验室和工业规模上已得到应用，适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别是对于有大量菌丝体的微生物和一些有亚细胞器（质地坚硬）的微生物细胞。
2.1.2.2高压匀浆法（high-pressure homogenization ）
高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，高压匀浆器是该法所采用的设备，它由高压泵和匀浆阀组成，结构简图见图5，它是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然简压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放，高速匀浆破碎的动力学方程为：
()b a 1n P N k l ??= 其中S 为破碎率，且max R R
R =；k 为破碎速度常数，p 为动力，且上述参数s,k,a,b,p 等随微
生物种类和培养条件的不同而有所差异。
影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数，图6是操作压力和循环次数对破碎的影响。由图可知，操作压力对细胞破碎的影响要比匀浆次数的影响大得多。从提高破碎效率的角度应选择尽可能高的压力；而从降低能耗及延长设备寿命的角度应避免很高的压力，因此，工业生产中常采用的压力为55－70Mpa 。
高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好，在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。
2.1.2.3超声波破碎法(Ultrasanication)
超声波法是一种很强列的破碎方法，细胞破碎是利用声频高于15－20KHz的超声波在高强度声能输入下进行的，普遍认为其破碎机理是与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，即空穴作用产生的空穴泡由于又受到超声波的冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击力压力，由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使细胞内液体产生流动而使细胞破碎。
超声波的细胞破碎与细胞种类、浓度、处理时间以及超声波的声频有关。本法在处理少量样品时操作方便，液体损伤量少，破碎率高。但本方法的有效能量利率极低，操作过程中产生大量的热，故操作时需在冰水中进行或通入冷却剂而增加成本，不易放大，它适用于大多数微生物的破碎，不适于大规模操作，主要用于实验室规模的细胞破碎。
机械破碎虽已广泛应用于工业大规模生产，但它仍有许多不足之处，如大量细胞碎片的产生，胞内所有可溶性杂质蛋白的释放，发酵液粘度增加等。这给后处理工艺带来了很大难度，而非机械破碎方法，其条件比较温和，有利于存在细胞膜附近目标产物的高活力释放回收，适用于所有微生物细胞的破碎，包括物理法、化学法和酶溶法。
2.1.3细胞物理破碎方法
2.1.
3.1渗透压冲击法（Osmotic Shock）
渗透压冲击法是各种细胞破碎方法中最为温和的一种。将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而使细胞通透性增大。对细胞进行渗透压冲击与超声波破碎比较Cystain C的释放量比较结果如下表：
高渗压溶液的快速稀释和高盐浓度溶液中细胞的快速重新悬浮，由于细胞壁的结构，对微生物细胞影响比较小，对停滞期的细胞影响更小，渗透压冲击法选择性很高，且释放速度快，工艺简单，易放大，具有很大的工业潜力。本法适用于易破碎的细胞或细胞壁预先受到酶处理的细胞，及合成受抑制而强度减弱的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌，但它同时还存在着高盐浓度对产品污染问题。
2.1.
3.2 冷冻－融化法(Freczing an thawirg)
冷冻－融化法是通过水结晶的形成和随后的融化而进行细胞破碎。冷冻的目的是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性，而且由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。
对E-coli K12在30～90℃温度范围内热溶性的研究显示，在90℃下处理20min会释放出大量蛋白，可以看到，提高蛋白释放可通过短时间高温渗透来获得，而不是低温（30－70℃）长时间处理。这些结果的解释很难用提高温度改变蛋白质的可溶性来解释，在电子显微镜下，90℃下的细胞破碎有大量的细胞碎片，但本法不能定量地测定细胞破碎的程度。
目前小规模工厂工艺过程用于生产生物可降解热熔物质，PHB是通过升高温度和压力相结合破碎A eutrophus获得的，相似的工艺过程是用于食品工业的酵母蛋白的提取生产被报道，操作可以是分批或连续，然而，由于提高温度大多数生物产品失活，使得细胞破碎中热量的应用是很有限的。
本法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效，但由于本法成本高，只能进行小规模应用，且释放速率慢、产量低，另外酶易失活也限制了它的更进一步利用。
2.1.4化学法
2.1.4.1碱处理
蛋白质是两相物质，利用酸碱调节pH值，可提高目标产物溶解度。PH11.5-12.5碱处理20－30min可导致细胞溶解，Wade报道了一改进工艺，通过用最佳PH11.0-12.5碱处理代替机械破碎法从Erwinia中提取L-asparaginase，则L-asparaginase以可溶形式释放出来，再如，破碎Alcaligenes eutrophus回收PHB，在PH10和45℃条件下处理，50％的可利用的可溶蛋白释放出来。
本法的优点是价格便宜，易适于任何规模的操作，但实际上大多数蛋白是不能忍受这种条件的PH11－11.5的碱浓度破坏了许多生物活性，使蛋白酶失活，故本法常伴随着蛋白的变性和降解。
2.1.4.2化学试剂法
化学渗透取决于试剂的类型和细胞壁、细胞膜的结构与形成。下表列出了不同化学试剂对不
EDTA作为螯合剂，可用于处理革兰氏阴性菌如E-coli，对细胞的外层膜有破坏作用。二价阳离子，尤其是Mg2＋对革兰氏阴性军细胞被膜以外层膜的稳定作用是重要的，EDTA的螯合作用导致外层膜不稳定或去除。在EDTA处理时，大肠杆菌有33－50％脂多糖，少量蛋白质和磷脂损失，外层的这些变化也影响细胞质膜。EDTA单独处理可导致Psendomenas aeruginosa广泛的溶解，这性质对Pseadmonads是特有的，对E－coli，EDTA有助于诱导自溶，在其它革兰氏阴性菌，EDTA可提高细胞通透性。
2).有机溶剂法
许多研究者发现，有机溶剂处理细胞，细胞膜表面发生变化，胞内产物可以释放出来，由于有机溶剂没有整体破碎细胞，因而有可能实现选择性释放，如采用异丙醇处理酵母，释放超氧化物歧化酶，处理后，超氧化物歧化酶释放率达90％，纯化因子提高25，即在
3).表面活性剂
通常使用的清洁剂象SDS、CTAB、Triton-X等能够作用细胞质和细胞壁膜，膜结构中的脂蛋白成分被或多或少地溶解，使细胞渗透作用有利于某些蛋白的通过，Helenius等人认为清洁剂溶解膜的作用是蛋白质溶解和蛋白－脂界面的扰乱。E-coli实验研究显示了阴离子清洁剂SDS、Sarkosyl和非离子型清洁剂Triton X-100溶解细胞、细胞外膜、细胞壁和细胞质膜不同的敏感性，无Mg2+条件下，细胞外膜和内膜很容易被SDS和Triton X-100 溶解。Sarkosyl专门作用内膜，Mg2+存在会抑制Triton X-100，仅对内膜溶解的作用阻止了Sarkosyl 脱掉内膜，膜的去除与0.5－2.0％清洁剂浓度无关，内膜和外膜的溶解随着温度从4－37℃增大而升高。
Hectwer和Wang研究了非离子型Trition X-100和变性剂盐的结合作用，盐酸能从膜碎片中溶解蛋白Triton X-100对疏水物质有很高的亲和力，因而对结合和溶解内膜和外膜碎片中的磷脂很有效，在Triton X-100浓度0.5-2.0％，盐酸0.1M条件下，会发生明显的协同效应，两者缺少任何一种情况下，蛋白释放量少于10％，当发生协同作用时，蛋白释放量提高到505，用清洁剂渗透细胞的缺点是易使蛋白质变性，尤其表现在蛋白质复杂的四级结构上。
综上所述，可发现，化学渗透法的优点与机械法相比，可避免大量细胞碎片，核酸留在
胞内，处理后，溶液很容易澄清，简化后处理步骤，且用在搅拌容器中简单的间歇操作代替了机械破碎设备。
缺点是价格昂贵，易污染产物，会导致产物活性和最优产量的不可逆损失。
2.1.5生物法
酶溶法是研究较广的一种方法，是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键而达到破壁的目的，即利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再破坏细胞膜，以提高胞内产物和通透性。
由于酶溶法的生物特异性，温和的操作条件、低能量、低成本且可以避免不利的物理条件，象高剪切力等优点，酶溶法是非常有用的方法。它能确保产物的破坏最小，细菌和酵母细胞壁完全不同的结构决定应用不同的酶。常用的溶酶有溶菌酶(lysoryme)、β－1，3－葡萄糖酶、蛋白酶、糖苷酶、β－1，6－葡聚糖酶等，细胞壁溶解酶(rymdyase)是几种酶的复合物，溶菌酶主要对细菌类有作用，其它酶对酵母作用显著。
目前，溶菌酶是商业上唯一大规模应用的细菌溶酶，溶菌酶攻击肽聚糖多肽链上的β－1，4－糖苷键，革兰氏阳性菌对这种作用非常敏感，革兰氏阴性菌则需要先脱掉外膜或使其外膜不稳定暴露肽聚糖后受攻击，这可以通过除掉二价阳离子（它可维持外膜稳定），或通过象EDTA似的螯合剂，或非离子型清洁剂如Triton X-100作用来实现。通过透射电镜观察细胞壁形态变化，证实了溶菌酶的这一作用，在低渗性环境中，细胞破裂。
Cytophaga sp溶解酶系统既可以溶解革兰氏阳性菌，也可以溶解革兰氏阴性菌，还可以溶解酵母，溶解E-coli需要通过清洁剂处理去除外膜，然而，革兰氏阴性菌Alcaligena eutrophus则不需要这样的预处理就有效地溶解，结果发现，存在高活性，且无重大产物抑制，最优操作条件是PH9.2和45－50℃。
下图为正在溶解的酵母细胞壁结构示意图，酵母细胞主要有两层，即包括蛋白质β－甘露糖层的外层和－葡聚糖的内层，实验发现，在溶酶存在条件下，从整个酵母细胞蛋白质释放速率与酶浓度有线性函数关系，酵母细胞溶解的酶系统通常是几种不同酶的混合物，包括一个或更多的β－1，3－葡聚糖酶、蛋白酶、β－1，6－糖葡聚糖酶、甘露糖酶和壳多糖酶，它门协同作用于细胞壁的溶解，单只有两种酶对整个细胞破碎是必要的，特定的壁溶蛋白酶可降解蛋白质－甘露糖层，溶解β－1，3－葡聚糖酶可降解内层。
自溶作用是酶溶的另一种方式，通过调节温度，PH或添加有机溶剂等激活剂，诱使细胞产生溶剂自身的酶的方法，称为自溶，如酵母细胞在45－50℃下保持12－24小时即可发生自溶，通过渗透失衡或某些微生物的营养局限也能发生自溶。
目前，自溶解酶的成本和它们有限的适用性使它们排除了大规模应用的可能性，革兰氏阴性菌的酶溶更受到了细胞激活和破碎外膜的预处理一般要求的限制，然而，不稳定性产品的保存，低成本投资，小规模cytophaga溶酶产品的开始生产和固定化酶系统的潜在应用，暗示了酶溶法是一种有光明前景的技术。
2.1.6胞内产物的选择性释放
细胞破碎的主要目的是为下一步的分离纯化，即不断的除去杂质。如果细胞完全破碎，自然所有胞内的蛋白质后全部释放出来，会给后面分离纯化带来困难。因此在细胞破碎时，不一定完全破碎细胞，只要目标产物释放出即可，而其他杂质蛋白应该越少越好。
2.1.6.1多种破碎方法结合
化学处理可提高细胞的通透性，引起部分蛋白释放而没有破碎细胞，而机械法需高能量不断产生大量碎片，阻碍了下一步分离，将化学处理如碱处理或清洁剂处理与高压匀浆法结合，结果显示，停滞期的A.eutrophus细胞破碎有显著提高，类似地，用溶解酶zymolase
预处理酵母S.cererisiue引起只有5％溶解；而来进行高压匀浆，结果，细胞碎片由原来未进行酶预处理的低于40％，提高到70％，再如图11所示，酶溶法与珠磨法的结合,结果与条件如图所示，本法节省了能量，降低了酶成本，缩短了处理时间。
2.1.6.2目标产物的选择性释放
2.1.6．2．1 细胞破碎和双水相萃取技术结合
乙醇脱氢酶（ADH）是一种含锌金属酶，一般的破碎方法容易失活。苏志国等采用球磨和双水相萃取技术结合，从酵母中提取ADH，在球磨中加入聚乙二醇（PEG）及硫酸铵对ADH 起一定保护作用，然后加入18%PEG和17%硫酸铵，直接释放的ADH促进入上相。
2.1.6．2．2 利用噬菌体裂解细胞
利用可控噬菌体破碎菌体有两种方法:直接用噬菌体处理细胞；将噬菌体基因表达在工程菌中，一定条件下诱导噬菌体破壁。
第一种方法Park 在1994年报道采用野生的噬菌体感染大肠杆菌，热诱导后，细胞裂解。
第二种方法一般将噬菌体基因（）表达在可产聚羟基丁酸酯的菌种，当加入
利用噬菌体基因方法和其他细胞破碎方法相比具有许多优点：可避免机械法所需的昂贵设备带来的问题；可避免化学试剂带来的污染和回收问题；。而且操作简单可控，可以和发酵过程藕联起来。
2．2 从发酵液直接分离产物
前面的固液分离都只是将发酵液的细胞进行分离，对产物并没有分离。而且在固液分离中还有产物的损失。
对于胞内产品，在细胞破碎后，细胞碎片很小，一般在0.05-0.2 μm，很难用传统的离心或过滤法除去，如采用微滤膜，膜容易发生堵塞。所以细胞碎片的分离时一个难题。
2．2．1 双水相分离技术
双水相萃取时瑞典伦德大学P.Albersson教授实现研究德一种高效分离技术。有关双水相萃取德特点将在后面章节中详细讨论，本章只是讨论有关双水相萃取在细胞或细胞碎片分离中的应用。在双水相体系中，细胞或细胞碎片全部分配在下相中，只要目标产物分配在上相中，利用萃取分配平衡是热力学过程，容易放大的优点，可以很容易地分离出细胞或细胞碎片。
双水相萃取用于细胞碎片地分离的应用例子如表所示，双水相在分离细胞碎片的同时，还纯化了蛋白质2－5倍。所以双水相萃取是一种集成化技术，可同时完成细胞碎片去除和产品纯化二个任务。双水相萃取分离技术在分离细胞和细胞碎片时，和其他技术如转鼓过滤和膜分离的比较如表所示。由比较可知，双水相萃取技术具有设备简单，容易放大的优点。当然双水相萃取也有一些缺点，主要问题是当放大规模很大时，原料成本将是一个关键因素。由于成相组分浓度放大时保持不变，当规模很大时，投入的原料将正比列增加，导致双水相的操作成本很高。但在一些高价值产品的分离纯化上，双水相萃取还是有其竞争优越性的。表双水相萃取用于细胞碎片的分离和蛋白质的纯化
表双水相萃取和其他细胞分离技术的比较
2．2．2 膨胀床分离技术
扩张床是固定床和流化床优点的综合。不用除去细胞，便可以直接从发酵液中提取目标产物，同时完成细胞等颗粒悬浮物的分离。有关膨胀床的特点将在后面章节中讨论。本章只是讨论有有关膨胀床在除去细胞碎片时的应用。
扩张床吸附技术有着广泛的工业应用前景，一些研究者已对此进行放大。一些主要的应用实例列于表。所有的研究都表明，扩张床吸附技术将固液分离、吸附、浓缩集成在一起，大大简化了操作步骤，目标产物的回收率大幅度提高。但是该技术中还有一些问题需要进一步解决。
表7 EBA技术应用举例[7]
尽管目前还存在一些不足，但扩张床吸附技术在简化生物产品纯化过程，特别是从含固体杂质的料液中直接纯化生物产品方面是一个杰出的贡献。
2．2．3 泡载分离技术
2．2．3．1泡载分离技术的原理
泡沫分离(Foam Separation)又称泡沫吸附分离(Foam Adsorbent Separation)技术，早在1915年就开始应用于矿物浮选，但是对离子、分子、胶体及沉淀的泡沫吸附分离是从50年代末才引起了人们的兴趣与重视，并逐渐作为一种单元操作加以研究。首先是从溶液中回收金属离子的课题开始的，前期研究了泡沫分离金属离子的可行性，然后建立了金属离子与表面活性剂离子之间相互作用的扩散—双电层理论。60年代中期采用泡沫分离法，脱除洗涤剂工厂排放的一级污水及二级污水中的表面活性剂——直链烷基磺酸盐和苯磺酸盐获得成功，70年代进行了染料等有机废水泡沫分离的实验研究，1977年也有报导开始用阴离子表面活性剂泡沫分离DNA 、蛋白质及液体卵磷酯等生物活性物质。到目前为止，用泡沫分离方法获得的蛋白质及酶有：溶菌酶，白蛋白，促性腺酶激素，胃蛋白酶，凝乳酶，血红蛋白，过氧化氢酶，卵磷酯，β—淀粉酶，纤维素酶，D —氨基酸氧化酶，苹果脱氢酶等等。随着工业的发展，特别是对环境保护的普遍重视和资源的综合利用的要求，泡沫分离的研究工作将不断扩大范围，工业应用将愈来愈多.
1.泡载分离技术的基本原理
泡载分离的分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性(如表面活性剂)或能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起后(如金属离子，有机化合物、蛋白质和酶等)并在鼓泡塔中被吸附于气泡表面，得以表面富集，藉气泡上升带出溶液主体，达到净化主体液、浓缩待分离物质的目的。可见它的分离作用主要决定于组分在气—液界面上吸附的选择性和程度，其本质是各种物质在溶液中表面活性的差异。
（1）表面活性剂及其界面特性
泡沫分离中所需分离的溶质是表面活性剂。它们的化学结构式由非极
性基团(亲油性)和极性基团(亲水性)两部分组成，溶入溶液后表现出两个基
本性质：(1)在水溶液中的溶解行为是很快地聚集在水面并形成亲水基留在
水中，亲油基伸向气相的定向单分子排列，使空气和水的接触面减少，从
而使表面张力按比例急剧下降。同时，多余的分子则在溶液内部形成分子
状态的聚集体——胶束，并分布在液相主体内。此状态相当于右图曲线的
斜线部分。（2）超过表面活性剂形成胶束的最低浓度后，溶液表面张力不
再降低。但在相界面上，由于上述定向排列的单分子层的作用，具有选择
性的定向吸附作用，相当于曲线中的水平部分。这一特性会显著地改变原溶液的界面的性质，造成各种界面作用，泡沫分离就是充分利用表面活性剂的界面作用而发展起来的一种新型的分离方法。
（2）Gibbs(吉布斯)等温吸附方程
1878年吉布斯用热力学方法推导出描述气—液界面上吸附的一般关系式即等温吸附方程，表达如下式：
d σ＝－RT ∑Γidln a i
当一种非离子型表面活性溶质以非常低的浓度溶解于纯溶剂(如水)中时，可简化成：
Γ＝－RT 1dlnai d
也可以表示成：
Γ/c=-1 d
以上式中Γ为吸附溶质的表面过剩，即单位面积上吸附溶质的摩尔数与主体溶液浓度之差，对于稀溶液即为溶质的表面浓度，mol ／m 2，可通过σ(溶液的表面张力，N ／m)与浓度c(溶质在主体溶液中的平衡浓度，mol ／L)来求得。式中的Γ/c 为吸附分配因子；R 为气体常数，J ／(mol/K)；T 为绝对温度，K 。
如果溶液中含离子型表面活性剂，则应对上式进行如下修正：
Γ＝－nRT 1dlnc d
其中，n 为与离子型表面活性剂的类型有关的常数。液溶中表面活性
剂浓度c 和表面过剩Γ的相互关系可用上图表示。在b 点之前，随着溶液
中表面活性剂浓度c 增加，Γ成直线增加，
Γ＝Kc
b 点后溶液饱和，多余的表面活性剂分子开始在溶液内部形成“胶束”，
b 点的浓度称为临界胶束浓度(CMC)，此值一般为0.001～0.02mol ／L 左
右，分离最好在低于CMC 下进行。对于非离子型表面活性剂，上图曲
线更接近于Langmuir 等温方程：
Γ＝c
K Kc `1 K 和K ’均为常数。在饱和时，K ’c ??l ，Γ＝K ／K ’。所以在溶液中表面活性剂的量超过临胶束浓度后，表面过剩值Γ恒定不变，许多表面活性剂的Γ值在3×10-10mol ／cm 2左右。
（3）泡沫的形成与性质
泡沫是由被极薄的液膜所隔开的许多气泡所组成的，那么气泡是如何形成的呢?它是当体在含活性剂的水溶液中发泡时，气体首先在液体内部形成被包裹的气泡。在此瞬时，溶液中表面活性剂分子立即在气泡表面排成亲油基指向气泡内部，亲水基指向溶液的单分子膜，该气泡会借浮力上升冲击溶液表面的单分子膜。在某种情况下，气泡也可从表面跳出。此时，在该气泡表面的水膜外层上，形成与上述单分子膜的分子排列完全相反的单分子膜。从而构成了较为稳定的双分子层气泡体，在气相空间形成接近于球体的单个气泡。许多气泡聚集成大小不同的球状气泡集合体，更多的集合体集聚在一起形成泡沫。
形成泡沫的气泡集合体包括两个部分：一是泡，两个或两个以上的气泡，二是泡与泡之间以少量液体构成的隔膜(液膜)是泡沫的骨架。典型的三个气泡集合体泡与泡之间间壁为平面，三个泡的共同交界处则形成具有一定曲率半径的小三角柱，如果是四个气泡聚集在一起可能生成十字形结构，但它是不稳定的，在相邻气泡间微小压力差下，膜会滑动，直至转变
成上述的三泡稳定结构。
三维气泡膜情况要复杂一些，最可能形成的情况是侧面为正五边形的十二面体(即由十二个同样大小的正五边形所围成的小泡)，各面之间互成1200的角度。
泡与泡之间的隔膜比双分子层气泡膜厚很多倍，其中所夹带的液体会因重力而向下流动，液膜变得越来越薄，当膜的厚度达到几个微米时，即使粘度不大的液体，膜的中间层的流动也变得十分缓慢，最终液层停止流失。另外，液体流失还与气泡相互挤压有关，这种挤压力是由于界面的曲率不同而产生的。当膜间夹角为1200时，泡沫稳定。
2．2．3．2泡沫分离的操作方式及其影响因素
1、泡沫分离的操作方式
泡沫分离操作由两个基本过程组成: (1)待分离的溶质吸附到气—液界面
上；(2)被泡沫吸附的物质进行收集并用化学或机械的方法破坏泡沫，将溶质
提取出来。因此它的主要设备为泡沫塔和破沫器。
泡沫分离流程可分为间歇式和连续式两类。
A 间歇式泡沫分离过程
气体从塔底连续鼓入，形成底泡沫液从塔顶连续排出，原料液因不断形
成泡沫而减少，可在塔底的下部补充适当表面活性剂，以弥补其在分离过程
中的减少，间歇式操作可用于溶液的净化和有用组分的回收。操作流程如右
图。
B 连续式泡沫分离过程
这种过程料液和表面活性剂连续加入塔内，泡沫液和残液连续从塔内排出。
按照原料液引入塔的位置不同，可将连续泡沫分离分为浓缩塔(或称精馏塔)，提馏塔和两者叠加的复合塔，可分别得到不同的分离效果。（见上图a 、b、c）
(a)浓缩塔：含表面活性剂的料液连续加入塔中的鼓泡区，在塔顶设置回流，将凝集的泡沫液部分引回塔顶，以提高泡沫液的浓度即塔顶产品浓度，故像精馏塔中的精馏段。除了外回流外，上升泡沫中气泡聚集所形成的内回流同样具有提高塔顶产品浓度的作用。但对残液的去污效果不好。
(b) 提取塔：料液从泡沫塔顶加入，相当于提取塔。这样的操作可以达到很高的去污系数。
(c)复合塔：料液和部分表面活性剂由泡沫段中部加入，塔顶也采用部分回流，相当于复合塔。
泡沫分离和其他分离过程一样，也可以把一组单级设备串联起来操作，以提高脱除率。
破沫可采用静止法、离心分离、声波、超声波、振动加热等方法。如果用加入表面活性剂来形成络合物的方法，脱除非表面活性物时，泡沫液中的络合物可通过化学反应使需脱除的非表面活性组分形成不溶解的化合物，然后用过滤将其从溶液中分出，再生的表面活性剂
可循环使用。
2、影响泡沫分离的因素
评价泡沫分离方法的效果，主要看泡沫分离的富集率、分离率和回收率，一般而言影响这三个参数的因素有以下几项：
A 待分离物质的种类
(1)待分离的物质是一种表面活性物质和一种溶剂的二元体系，则可应用Gibbs吸附公式计算表面过剩或分配系数。
(2)待分离物质是非表面活性物质，如金属离子，则可用两种方法分离：(a)加入表面活性剂，使其与待分离离子一起被气泡带到液面予以分离；(b)把溶液调节至适当pH值，使待分离物质形成沉淀，并与表面活性剂一起被气泡带到泡沫层而分离。一般希望采用有机沉淀剂，因为它的选择性好，易于过滤。
B 溶液的pH值
溶液的pH值对分离效果有很大的影响。对于天然表面活性物质，如蛋白质在泡沫分离时，在等电点时效率最高，因为这时表面张力—浓度曲线的斜率最大(吉布斯公式)；对于非表面活性物质，如金属离子，应控制在某pH值下使表面过剩和溶液浓度的比值Γ／C最大。这样可从离子混合物中分离出个别离子。
C 表面活性剂浓度
表面活性剂的浓度不宜超过临界胶束浓度，但也不能太低，使泡沫层不稳定，太高使分离效率下降。
D 温度
温度首先应达到表面活性剂的起泡温度，保持泡沫的稳定性，其次根据吸附平衡的类型来选择温度的高低。也可通过变温泡沫分馏，把不同的表面活性物质分开。
E 气流速度
气流速度上升，泡沫形成的速度上升，则单位时间的去除率也上升，但泡沫中间歇液的含量也上升，因而降低了塔顶泡沫液的浓度。如气速过大，则泡沫中气＼液分离形成乳化气体，对操作会很不利。
F 离子强度
很多泡沫分离体系对离子强度很敏感，离子强度增加，效率很快下降。这是由相同电荷离子的竞争吸附引起的。
此外，泡沫的性质、层高、排沫方式、搅拌等也是影响泡沫分离的因素。2．2．3．3 泡载分离技术的应用
泡沫分离的应用可以分两大类：一类是本身为非表面活性剂，可通过络合或其它方法使其具有表面活性的，这类体系的分离被广泛地用于工业污水中各种金属离子铜、锌、镉、铁、汞、银等的分离回收，以及海水中铀、钼、铜等的富集和原子能工业中含放射性元素锶的废水的处理。另一类是本身具有表面活性物质的分离以及各种天然或合成表面活性剂的分离，如全细胞、蛋白质、酶和胶体分子、合成洗涤剂等，下面着重介绍在生物工程中的应用。
1 细胞分离
（1）大肠杆菌的分离
有报道用月桂酸＼硬脂酰胺或辛胺作表面活性剂，对初始细胞浓度为7.2×106个／cm3大常杆菌进行泡沫分离，结果用1分钟的时间能去除90％的细胞，用10分钟时间就能去除99％细胞。这个方法对于小球藻(Chlorela. SP)和衣藻(Chlomydomonas. SP)也是成功的。
（2）螺旋藻的泡载分离
曾文炉等[2]用泡载分离法分离螺旋藻。首先将待处理藻液一次性倒入分离塔中，再经塔底引入经饱和增湿处理的载气N2，富集得到的浓藻液由塔顶排入贮槽，而经泡载分离得到的稀藻液则自塔底排出。泡载处理前，先向不同浓度藻液(OD560=0.3~2.1)中加入一定量的乙醇和表面活性剂Tween 20，使其浓度分别为Ce＝1％～5％(φ，下同)和C T=50～300mg ／L，并调节藻液的pH为10～12.5，离子强度(以电导率口表示)为0.9～1.9S／m．同时控制载气流率Q g=20～40L/h。结果发现在螺旋藻细胞的泡载分离与采收过程中，泡沫塔构造、起泡剂浓度、载气流率、藻液pH值、乙醇浓度等因素对泡载采收性能具有重要影响：
①斜臂泡沫塔有助于泡沫间隙液的排放、提高泡沫相中细胞浓度及改善泡载采收性能。在30min内，斜臂泡沫塔分离因子和浓缩倍数分别达到5.03和2.82，而垂直泡沫塔则仅分别为2.05和1.52。
②当Tween 20浓度为100mg／L、载气流率为30L/h,乙醇浓度为2％(φ)时，泡载采收过程分离因子和浓缩倍数较高．在斜臂泡沫塔30min实验过程中，可分别达到5.04~6.52和
2.74~4.31。
③pH对泡载分离性能有重要影响。pH为11左右可获得较高的采收效果，其分离因子和浓缩倍数分别为5.24和4.51。
（3）酵母细胞的分离
酿成的啤酒，一般含有20～40g／L酵母，含水率达75％，进行酵母的分离，对于酵母浆的脱水，可使用许多方法：浮选，分离，蒸发和干燥。
分离和浓缩酵母细胞的浮选法值得特别注意。但并不是所有的微生物培养物都具有足够的浮选能力，它在很大的程度上取决于酵母细胞的生理状态，为了获得浮选分离好的效果。必须有大的相接触表面(酵母细胞—空气)，要求空气的分散作用很小。浮选方法分离酵母较其它分离方法具有一系列的优点,比如可相当大地减少分离塔的数目,减少总投资,经济等。酵母的浮选能力受酵母的种属、细胞大小、杂质的存在影响，单枝细胞的浮选要比枝密酵母困难。
微生物工业使用的浮选设备可分为卧式与立式两种，也可以有一级操作和二级操作。最简单的结构是单级浮选塔。
单级浮选装置
1－壳体；2－固定槽；3－隔离室；4－充气器；5，8－机械消沫器；6－酵母悬浮体导入管；
7－泵
设备由平面桶底的外部壳体1和泡沫槽2的内桶构成，泡沫槽与壳体之间的环形空间用隔板分成几段(Ι～V），在Ⅱ～V段中都装有充气器4，用机械的方法消泡5，处理过的发酵液从最后段经过用作水封的室排出，原始酵母悬浮体由发酵罐经连接管6进入浮选塔工段，在那里酵母被抽出达80％，然后酵母悬浮液通过隔板下部到达底部，在这些段中，酵母相应地被抽出10.5％～2％，这时生成泡沫并进入内泡沫槽，浓缩液由泡沫槽用离心泵送去分离。
2 蛋白质和酶的分离浓缩
蛋白质的泡沫分离[28]目前还只能说是处于一个初级阶段，真正要成功地将这一技术应用到生产还需要构建合适的研究模型，这就需要选取合适的蛋白质来研究。目前常用的研究模型蛋白质是血清白蛋白、酪蛋白和溶菌酶等，下表列出了一些研究过的用泡沫分离进行分离的物质。
（1）几种蛋白的泡载分离
泡沫分离可应用于多种蛋白质和酶的浓缩或分离。其最初是用于胆酸和胆酸钠混合物中分离胆酸。泡沫中胆酸的浓度为料液的3—6倍，活度增加65％。泡沫分离还可应用于从非纯制剂中分离磷酸酶，从链球菌培养液中分离链激酶；从粗的人体胎盘匀浆中分离蛋白酶。也有报导用泡沫分离法使溶液中的牛血清白蛋白浓缩，或从它与DNA的混合物中把它分离出来。类似地，从胃蛋白酶和血管紧张肽原酶混合物中分离胃蛋白酶，从尿素酶和过氧化氢酶混合物中分离尿素酶，从过氧化氢酶和淀粉酶中分离过氧化氢酶等均可用泡沫分离。通过除去泡沫中的杂质从经预处理的马血清残余液中浓缩胆碱酯酶，发现其活力比料液高8～16倍。也有报道从苹果组织中回收蛋白质络合物。
另外，利用泡载分离蛋白和酶，可以大大降低蛋白和酶的失活。从猪肾中分离纤维素酶、D—氨基酸氧化酶，从发面酵母中分离三肽合成酶，或从热带假丝酵母菌中分离酮—烯醇互变异构酶都几乎没有活力的损失。用泡沫分离法从鸡心中提取苹果酸脱氢酶时的总活力损失为25％。用5级泡沫分离过程处理人体脱氢酶，只有5％～20％的总活力损失。
刘志红等[16]用环流泡沫分离塔，采用分批操作的方法对BSA（牛血清清蛋白）和HBB 的混合物进行了分离，并考察了pH对BSA和HBB水溶液对溶液泡沫分离的影响，发现在pH=3.9时取得最优的分离效果。通过调节pH可控制蛋白质的表面活性，使目标蛋白在气－液界面产生优势吸附，从而为采用泡沫分离技术分离蛋白质混合物提供了分离基础。这一过
程不使用表面活性剂简化了后续的操作，同时使得泡沫分离过程变成环境友好型。
谢继宏等[20]在一连续的泡沫精溜塔中考察了各种条件对大豆蛋白质溶液泡沫分离过程的影响，包括进料浓度、进气流量、pH值、回流比等条件。用流动法测定了大豆蛋白质在气液界面上的表面过剩浓度并回归了线性吸附方程。表明在溶液浓度较稀时，表面过剩浓度与溶液浓度呈线性关系。他们还详细分析了塔中泡沫在上升过程中的排液和聚并，对液膜和Plateau边界中的液含量及蛋白质含量进行了衡算，成功建立了分离过程的数学模型。
（2）泡沫分离糖-蛋白质混合体系
在泡沫分离过程中,表面活性强的物质优先吸附和浓集在气液界面处,被泡沫带出连续相,从而实现浓缩和分离的目的。由于蛋白质具有极性和非极性基团,属于生物表面活性剂,
异,采用泡沫分离的方法分离糖和蛋白质。殷钢等[3]人在环流泡沫
塔中分别采用多种糖-蛋白质混合物模拟体系,对糖、蛋白质的分离
进行了可行性研究,并考察了pH值对溶液表面张力和分离行为的
影响规律。泡沫分离实验设备和流程如图所示，采用分批操作，
气体分布器采用金属膜分布器。
糖与蛋白质的分离在pH为4.0时达到最优,以多糖(葡聚糖)
为例,采用环流泡沫分离能够实现蛋白质去除率为92%,糖的损失
率为20%,分离因子为55。
影响糖与蛋白质泡沫分离最重要的因素是pH值,此研究结果
只是针对特定的混合模拟体系,对于不发生缔和的糖与蛋白质混
合体系,其泡沫分离的最佳条件即为蛋白质单一体系泡沫分离的
最佳条件。但对于发生了缔和或有复合多糖如糖蛋白存在时,情况
则比较复杂,需作进一步研究。对比单糖、二糖和多糖与蛋白质的
分离结果,多糖与蛋白质混合体系的分离效果优于二糖和单糖体
系,这表明随着分子量增加,糖类被泡沫夹带的量会随之降低。实际
应用中由于要提取的生物糖类往往是多糖,因而采用泡沫分离技术一般可以得到满意的结果。他们采用泡沫分离技术在螺旋藻多糖与藻胆蛋白的初步分离过程得到较好地应用. 与Seveg溶剂萃取方法相比,该法操作简单,处理量大,不需外加任何有机溶剂。因而从植物和微生物中提取糖时,采用泡沫分离技术可以满足初步去除蛋白质的需要,大大降低后续纯化工作的负荷,实验结果预示着泡沫分离技术在生物多糖的分离提纯中有广阔的应用前景。
3 泡沫分离法分离天然产物
的圆柱形容器中进行人参皂苷的分离，采用空气在室温下鼓泡操作。
料液pH为5.7。
他们认为通气量，料液浓度，pH，通气类型以及进料量等均对
泡沫分离的结果有显著影响。在其它操作条件相同的情况下泡沫分
离所得的总皂苷浓缩倍数随通气量的增大，料液浓度及体积的增加
而降低，收率则随之上升。在中性条件下人参皂苷的泡沫分离所得
收率最高，在酸性条件下所得的浓缩倍数最高而收率最低。同时鼓
泡对不同的皂苷单体作用不同：对皂苷Rb1，Rb2，Rd有显著的浓
缩效果，而Re和Rg1的浓度则没有变。
4 泡沫分离的其它应用
（1）稀溶液中微量组分的分离[24]
随着科学技术的发展,
电子工业等部门需要纯度较高的原料;另一方面有时则需要在稀溶液中将有价值的微量组分提取出来(欲分离出去和提取出来的组分的含量均为10-6级)。因而近些年来超临界萃取、膜分离技术、泡沫吸附分离技术等新型分离方法领域十分活跃,相继取得了新的进展,为微量组分的分离提供了新的方法和手段,对于确定物系选择何种分离方法是人们十分关心的问题, 超临界萃取、膜分离、泡沫分离3种分离过程均可分离溶液中微量组分,对于一个确定物系,究竟选择哪一种分离方法比较合适,则是令人关心的问题。如果混合物中各组分表面活性差异较大,则泡沫分离技术具有优先被选择的条件;如果混合物中各组分通过特定膜的扩散速率存在差异,则膜分离技术是较为合适的分离方法;如果混合物中各组分在超临界流体中的溶解度不同,则超临界萃取是应该选择的分离方法。当然这只是技术上的考虑,技术上可行后经济上的考虑也不容忽视,获得要远大于消耗,这应该是工业经济的基本法则。
邓华陵[25]等考察了关键独立变数对氯代十六烷基吡啶（CPC）和十二烷基苯磺酸钠(SDBS)分批泡沫分离行为的影响，确定了最佳泡沫分离条件。并对水样中微量的CPC和SDBS及它们的缔合物进行了分离富集，对短柱中体积样品合长柱中大体积样品的分离效果进行了比较和评价，提供了可供工业的污水处理和回收微量物质参考。
王娟等[26]采用泡沫分离塔装置测定了BF4－的去除率，并研究了表面活性剂浓度，溶液浓度等的影响。当在溶液中加入添加剂时，BF4－的去除率明显提高。
纪志玲等[27]用环流泡沫分离塔处理合成洗涤剂废水中的十二烷基苯磺酸钠，并给出了适宜的操作条件。泡沫分离技术除了在选矿工业上得到重要应用外,在工业废水处理上也已开始从实验室研究走向工业化。由于它具有投资少,耗能少,冷态下操作等特点,可用于民用污水处理,除可脱除污染物外,还可向水中充氧,并脱除污水中的油,这对进一步生物降解很有帮助。
（2）泡沫分离法在表面活性剂提纯中的应用[23，29]
不同物质有不同的表面吸附能力,是泡沫分离的根据。所以,应用此法可以分离不同表面活性剂的混合物。表面活性强的首先出现于泡沫中,以后随着吸附能力减小依次出现。这与液体的分馏很相似,称之为泡沫分馏。表面活性剂水溶液之所以出现表面张力的最低值,是由于有表面活性较高的“杂质”存在或是由于“杂质”与表面活性剂形成了表面活性较高的“复合物”。纯净、单一的表面活性剂不会出现表面张力最低值。测定化学纯十二烷基硫酸钠的表面张力-浓度曲线,如上图曲线2所示,表面张力明显有最低值,达到23达因/厘米。这显然与Gibbs公式相矛盾。将该表面活性剂配成10-3～10-2mol/L的溶液,用上述装置鼓入空气进行分馏,收集泡沫质,直到泡沫质中不含十二醇。分别测定分离出的泡沫和残留液的表面张力-浓度曲线,如上图所示。经过泡沫分离提纯后,表面张力的最低值现象消失,表面张力最低值约为38达因/厘米(曲线1)。而泡沫分离法分离出的泡沫质,其表面张力曲线如图,最低值更低,达到21达因/厘米(曲线3)。由于十二醇具有在表面竞争吸附的特性,与十二烷基硫酸钠形成的混合膜将表面张力降到更低的水平。一旦浓度达到CMC,表面上的十二醇进入胶束,体系的表面张力恢复到正常水平,因此在表面张力-浓度曲线上便出现最低谷点。实验证明,泡沫分离法可以成功脱除在表面竞争吸附能力强的十二醇,使十二烷基硫酸钠得到纯化。
十二烷基苯磺酸钠溶液的浓缩
泡沫分馏塔直径为100mm,柱长Ｌ1000mm,采用无回流式消泡器。配制3Ｌ10ppm的十二烷基苯磺酸钠溶液,倒入泡沫分馏塔中。在室温下通入空气鼓泡,空气气速约30Ｌ/min。待消泡器中泡沫质体积达到30ｍＬ时,停止向泡沫分馏塔内鼓气。用两相滴定法测得泡沫质中十二烷基苯磺酸钠的含量Xf为750ppm,由此可以计算得到浓缩比Ｒ为300,分离效率Ｅ为0.75上述结果表明原始溶液中的十二烷基苯磺酸钠已有75%得到回收。回收液中十二烷基苯磺酸钠的浓度比原始溶液中提高了约75倍,比废弃液中提高了约300倍。以上结果充分证明了吸附气泡分离法分离低浓度溶液的强分离能力。
2．2．3．4 泡沫分离技术的展望
泡沫分离相对于常规的分离方法有以下优点：（1）特别适合于对低浓度的产品进行分离，如低浓度的酶溶液，用常规的方法进行沉淀时行不通的，如果使用泡沫法对产品先进行浓缩，就可以用沉淀法进行提取。（2）分辨率高，由于它是根据被分离物的表面活性而对产品进行的分离的，有可能在待处理液体中的多种成分中，某种待分离成分的表面活性与其它成分的表面活性有明显差异，这时，该方法就可以高选择性地浓缩某种成分。（3）富集率高。（4）运行成本低，由于此过程不使用无机盐或有机溶剂，仅仅有一些动力消耗，它的运行成本一般比其它方法低。（5）操作简便。若与层析、超滤等方法联用，可从许多体系中(例如生物废液,发酵液,动物组织、器官匀浆,植物萃取液、果汁等)分离或浓缩蛋白质和酶。
泡沫分离的主要缺点是表面活性剂大多是高分子化合物，消耗量较大，有时也难以回收，泡沫分离塔中的返混严重影响分离的效率，能维持稳定泡沫层的表面活性剂较少，并且难以控制其在溶液中的浓度，但泡沫分离不失为一种很有发展前途的新颖分离技术。
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细胞破碎方法综述
细胞破碎方法综述 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法 1前言 目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。 自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。 2细胞破碎技术 2．1高压匀浆破碎法（homogenization） 高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 2．2振荡珠击破碎法 (Skaking Bead) 将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振汤机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便. 2．3高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机。 2．4超声波破碎法（ultrasonication）
细胞破碎技术—超声波破碎
细胞破碎技术——超声波破碎法 摘要： 细胞破碎技术的基本概念及其基本方法，重点介绍了从超声波破碎仪及超声波破碎常见的问题与解决方法上介绍了超声波破碎法。 关键词：细胞破碎方法超声波破碎仪常见问题 正文： 一、细胞破碎阻力 细菌——几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个胺基酸组成，如L-丙氨醯-D-谷氨醯-L-赖氨醯-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-胺基酸与二氨基庚二酸存在。破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 酵母菌——酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 真菌——霉菌的细胞壁主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷键连接，某些以β-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层主要是蛋白质，最内层主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 植物细胞——对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型，依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网路，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网路系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网路之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 二、细胞破碎各类方法 目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破
细胞破碎法——高压匀浆法
细胞破碎法——高压匀浆法 摘要：细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质的基础。目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可归纳为机械法和非机械法两大类。机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超生波等方法。本次综述主要介绍高压匀浆法，高压匀浆法的应用以及高压匀浆机的介绍和使用。 关键词：细胞破碎高压匀浆法高压匀浆器应用 正文： 一、高压匀浆法破碎细胞的原理 高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，作用机理是液体剪切作用，利用高压是细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 二、高压匀浆器 高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 三、高压匀浆器性能特点 凡与物料相接触的零部件材料都具有极高的耐磨性和良好的耐腐蚀性、对物料不会产生不良的影响，高压均质机与其他均质设备相比，具有占地面积小、效率高、能量大、反应时间快、运转费用低等优点。高压均质机品种、规格齐全，完全能满
细胞破碎技术
四、细胞破碎 某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。 (一)机械破碎法 机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。 1．高压匀浆破碎法 Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20％左右。团状和丝状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。使用高压匀浆法时应注意，高压匀浆器的操作温度上升约2～3℃／10MPa，为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。多级破碎操作中，为有效防止温度上升，保护产物活性，需要在级间设置冷却装置。 影响高压匀浆器破碎的主要因素包括压力、温度和通过均浆器阀的次数。升高压力有利
细胞破碎技术与方法
细胞破碎技术与方法 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 由于细菌、酵母、真菌、植物都有细胞壁，但成分不同，且同类细胞结成的网状结构不同，因此其细胞壁的坚固程度不同，总体呈现递增态势。动物细胞虽没有细胞壁，但具有细胞膜，也需要一定的细胞破碎方法来破膜，达到提取产物的目的。 细胞破碎的方法主要分为化学法和机械法两大类。具体如下： 化学法 渗透冲击破碎法 ? 方法：渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 反复冻融法 ? 方法：将细胞放在低温下冷冻(约-15℃)，然后在室温中融化，反覆多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 酶溶破碎发法
? 方法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。 ? 特点： a) 此法适用多种微生物 b) 具有作用条件温和 c) 内含物成分不易受到破坏 d) 细胞壁损坏的程度可以控制 ? 存在的问题： a) 易造成产物抑制作用 b) 溶酶价格高 c) 酶溶法通用性差 化学试剂法 ? 方法：某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。SDS(十二烷基磺酸钠)是典型的阴离子表面活性剂 ? 特点：提取核酸时，常用此法破碎细胞。 ? 存在的问题： a) 时间长，效率低; b) 化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用 通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 方法技术原理效果成本应用 化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜 动物组织均质物或细胞 悬液 酶消化法 细胞壁被消化，使细 胞破碎 温和昂贵细菌或酵母
第四章 细胞的破碎与分离
第四章细胞的破碎与分离 教学基本要求： 1. 掌握细胞破碎的概念。 2. 熟悉和掌握细胞破碎的各种方法。 时间安排：3学时。 教学形式：本章以讲授为主，中间部分进行部分提问，采用PPT课件讲课。 教学内容： 由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取。细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。 破碎率及其测定方法： 破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比。 测定方法：直接测定法和间接测定法。 细胞破碎方法分类 1) 机械破碎法（高速珠磨法、高压匀浆法、超声波法等） 2) 非机械破碎法（化学法、酶解法、渗透压法、冻融法、干燥法等） 机械破碎法： 一、固体剪切方法（珠磨）： 1、定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程 2、工作原理：固－固剪切力、液－固剪切力等。 3、影响因素： 转盘外缘速度：速度增加，破碎率增加，但功率-，温度- 珠粒添量和大小：要适度 温度：但研磨产热，功率-，温度-。如产物热不稳定，必须控温。 细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞重量的能耗-。 流量Q：破碎为一级反应。Q-, E-，Rˉ；Qˉ，Eˉ，R-。 二、高压匀浆法（液体剪切方法） 1、定义—利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程 2、工作原理：液－液剪切力、压力差等
3、影响因素： 通过匀浆机的次数 温度：高温使破碎率增加但高温使产物变性 压力：高压使破碎率增加但高压使能耗增加，且会使机器破损。 在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; 二者均具有适用对象广，工业化、实验室中应用，细胞完全破碎等优点。高压匀浆机最适合于酵母和细菌;珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适。 三、超声波法 1、定义—利用超频率声波（15-25kHz）在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程 2、工作原理：空穴现象，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。 3、特点： 优点：适合于多种细胞的破碎 缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、珠粒体积和直径、被处理悬浮液的体积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低； D、产热大，需控温； E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。 非机械破碎法 一、化学（脂溶）法： 1、定义——采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性，使内含物有选择性地释放出来的过程。 2、原理： 酸碱：改变溶液pH值，从而改变两性产物蛋白质等的电荷性质 有机溶剂：如甲苯，被细胞壁脂质层吸收后，导致细胞壁膨胀，细胞壁破裂。 表面活性剂： 二、酶解法 1、定义—利用酶促反应分解细胞壁上的化学键而达到细胞破碎的过程 2、原理 外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、β –1,6）、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等。 内源性酶解（自溶）——温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等。
表面活性剂在细胞破碎的应用
学校代码：__11059__学号：1302021035 Hefei University 下游处理技术 XIAYOUC HULIJIS HUZONGS HU 论文题目：表面活性剂在细胞破碎的应用 学位类别：本科 学科专业：生物技术 作者姓名：刘壮 导师姓名：于宙 完成时间：2016.4.29
表面活性剂在细胞破碎的应用 摘要 表面活性剂的结构中有一个亲水基团，通常是离子；一个疏水基团，通常是烃基。表面活性剂的结构特性赋予了其既能和水也能和脂类作用的特性。表面活性剂是一类具有表面活性的物质，溶于溶液后，能显著降低液体表面张力，并能改变溶液的增溶能力。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，同时也含有蛋白质和脂质。用表面活性剂处理后可增大细胞壁的通透性[1]，这就是表面活性剂在细胞壁的破碎的原理。而细胞破碎是提取胞内产物的必由之路。本文将重点讲述表面活性剂在细胞破碎的应用。 关键词：表面活性剂；cmc；原理 沿革 在工业生产中有些目标产物不再发酵液中，而在生物体中，尤其是基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分分泌到发酵液中，而是在细胞内乘积。脂类物质和一些抗生素也是包含在细菌体中。这时就需要进行细胞破碎。 细胞破碎的方法很多，但是他们适用的范围和破碎效率不同。许多方法仅适合与实验室和小规模破碎。目前工业上生产应用最广泛的是高压匀浆法和珠磨法，由于他们处理量大，速度非常快而备受青睐。但是由于消耗机械能而产生大量的热量，使料液温度升高，容易造成生物活性的丧失容易造成活性物质的破坏[2]。化学方法如增溶法，通过添加表面活性剂，溶解细胞壁的脂，造成细胞壁通透性的改变，从而达到细胞破碎的目的。通过添加表面活性剂要比上述两种方法相对温和。表面活性剂处理制成细胞悬液后可用离心分离除去细胞碎片，在用其他方法如吸附柱或萃取剂分离制得产品。
细胞破碎技术的研究与进展
合肥学院Hefei University 生物分离工程课程综述 题目: 细胞破碎技术的研究与进展 系别: 专业: 学号: 姓名: 2013年4月1日
细胞破碎技术的研究与进展 摘要：本文主要概述细胞破碎方法中的高压匀浆法和珠磨法, 讨论了两种方法的特点及存在的问题, 并对它们进行了比较, 最后概括了细胞破碎技术的发展方向。 关键词：细胞破碎技术；高压匀浆法；珠磨法；发展方向 1引言： 自年代初重组技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃, 生物产品的数量越来越多，许多具有重大应用价值的产品应运而生，如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一等, 它们的基因分别在宿主细胞如（大肠杆菌或酵母细胞）内克隆表达成为基因工程产物，从而提高了产量，降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质如上述药物经克隆表达后都属胞内物质，分离提取这类产物时，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤，破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。 2 细胞破碎技术的概述： 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。细胞的机械破碎主要有高压匀浆法、珠磨法、撞击破碎法和超声波破碎法等方法，本文主要介绍高压匀浆法和珠磨法。 3 高压匀浆法： 高压匀浆法]1[是大规模破碎细胞的常用方法，高压匀浆器是该法所采用的设备，它由高 压泵和匀浆阀组成。它是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然简压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。 3.1破碎机理 同所有的机械破碎方式一样，高压匀浆法破碎细胞实质上是将细胞壁和膜撕裂，靠胞内的渗透压使其内含物全部释放出来。破碎的难易程度无疑由细胞壁的机械强度决定，而细胞壁的机械强度则由微生物的形态和生理状态决定。因此细胞的培养条件, 包括培养基限制型或
第4章 微生物细胞破碎 作业答案
第4章微生物细胞破碎作业参考答案 一名词解释 细胞破碎技术：是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。 化学渗透法：某些化学试剂，如表面活性剂、有机溶剂、金属螯合剂等可以改变细胞壁或细胞膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。 二填空题 1 （肽聚糖）是细菌细胞壁的主要化学成分；酵母细胞壁的主要成分是（葡聚糖）；霉菌细胞壁主要由多糖组成，其中大多数的多糖壁是由（几丁质）和葡聚糖构成的。 2 细胞破碎的目的是释放出细胞内目的产物，方法很多。按其是否使用外加作用力可分为（机械法）和（非机械法）两大类。 3 机械法主要有（珠磨法）、（高压匀浆法）、（超声破碎法）和X-press法等。在机械破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用（冷却）措施，以防止生物产品受热破坏。 4 非机械法有（酶溶法）、（化学渗透法）、物理法和干燥法等。 5 细胞破碎率测定方法主要有（直接测定法）、（目的产物测定法）和（导电测定法）三种。 三判断题 1 细胞壁破碎的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键（√）。 2 革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌细胞壁要薄。（X ） 四简答题 1 细菌、酵母、霉菌细胞壁的主要成分。 答：细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的。1）细菌细胞壁主要化学成分：肽聚糖；主要阻力—肽聚糖的网状结构。 2）酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖(30％一34％)、甘露聚糖(30％)、蛋白质(6％一8％)和脂类；主要阻力—壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 3）霉菌细胞壁主要化学成分：几丁质和葡聚糖；主要阻力—几丁质或纤维素的纤维状结构。 2 影响细胞壁破碎难易程度的主要因素。 答：微生物细胞壁的形状和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。破碎细胞要克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。 在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎程度的重要因素。细胞壁结构与细胞破碎关系：细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。 在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞壁的组成显得特别重要，特别是细胞壁的结构。 五论述题 1 论述细胞壁破碎常用的五种方法。 答：细胞壁破碎常用的五种方法有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、酶溶法和化学渗透法。1）珠磨法：利用进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述 摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。 关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术 1.脂肪酶概述 脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。 1.1脂肪酶的结构与性质 在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶
中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。 与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。 1.2产脂肪酶微生物 微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有许多优点:(一)微生物脂肪酶种类多、来源广、生长周期短；(二)具有比动植物脂肪酶更广的pH和作用温度适应范围以及更广的底物适应类型；(三)微生物脂肪酶便于进行工业化生产，同时容易制取高纯度制剂。 目前，工业生产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉以及假单胞菌等。
第三章 细胞破碎技术
第二章细胞破碎和分离提取技术 2．1细胞破碎技术 许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如：青霉素酰化酶，碱性磷酸酶等胞内酶，干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质，这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎，使目标产物释放出来，然后进行分离纯化。如图所示： 图胞内产品的分离纯化过程 2．1．1细胞破碎方法及机理 破碎细胞的目的是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大渗透性）或破碎、释放其中的目标产物，主要采用的方法有机械法和非机械法两大类，图1列出了一些主要方法： 破碎方法 固体剪切作用液体剪切作用干燥处理溶胞作用 珠磨法压榨法高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法 撞击法 图1 细胞破碎方法分类 机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，化学破碎则利用化学或生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下，使细胞膜破裂而释放胞内物质，各作用力细胞破碎机理如图2 2.1.2机械方法破碎 机械破碎处理量大，破碎速度较快，时间短，效率较高，是工业规模细胞破碎的重要手段，细胞受到挤压，剪切和撞击作用，易被破碎在许多情况下，细胞内含物全部释放出来，由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施，机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、
撞击破碎法和超声波等方法。 2.1.2.1 珠磨法（Bead milling ） 珠磨法是一种有效的常用的机械破碎方法，珠磨机是珠磨法所采用的设备，其结构示意图3，细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，在珠磨机中，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。 珠磨法破碎细胞可采用间歇式连续操作，研究表明，两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为： t k l S 11 n ?=- 其中， t 在间歇操作时，为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间，即R V t =，其中V 为悬浮液体积m 3，Q 为悬浮液流量m 3/S ，S 为破碎率，k 为破碎 速率常数，与许多因素有关。 珠磨法破碎受许多操作参数的影响，总结在表1中： 同一进料速度，细胞浓度越高，则破碎率越高，所需能耗越低；同时我们也能发现，破碎率越高所需能耗越大（同一悬浮液中）即破碎的能耗与破碎率成正比，提高破碎率，需要增加装珠量，或延长破碎时间，或提高转速，这些措施不仅导致电能消耗增加，且产生较多热量，引起浆液温度升高增加制冷量，因而总能量消耗增加。 珠磨法操作简便稳定，破碎率可控制，易放大，在实验室和工业规模上已得到应用，适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别是对于有大量菌丝体的微生物和一些有亚细胞器（质地坚硬）的微生物细胞。 2.1.2.2高压匀浆法（high-pressure homogenization ） 高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，高压匀浆器是该法所采用的设备，它由高压泵和匀浆阀组成，结构简图见图5，它是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然简压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放，高速匀浆破碎的动力学方程为： ()b a 1n P N k l ??= 其中S 为破碎率，且max R R R =；k 为破碎速度常数，p 为动力，且上述参数s,k,a,b,p 等随微 生物种类和培养条件的不同而有所差异。 影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数，图6是操作压力和循环次数对破碎的影响。由图可知，操作压力对细胞破碎的影响要比匀浆次数的影响大得多。从提高破碎效率的角度应选择尽可能高的压力；而从降低能耗及延长设备寿命的角度应避免很高的压力，因此，工业生产中常采用的压力为55－70Mpa 。 高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好，在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。
细菌DNA提取方法综述
细菌DNA提取方法综述 姓名：刘燕 学号：1430170088 班级:周二班 摘要：高效稳定的细菌基因组DNA提取方法对后续分子生物学的研究有着重要的意义。不同的方法提取的DNA产量和纯度等方面有差异，会对后续步骤产生很大影响。本文综述了目前广泛使用的DNA 提取方法。 关键词：细菌、基因组DNA、提取方法 现代分子生物学技术如DNA 重组技术(又称基因工程)、分子克隆技术、PCR技术等，为进一步认识生命活动的本质，更好地利用其规律为人类服务提供了重要手段(马尧等, 2005)。但是，DNA 分离是成功利用这些技术的第一步，也是非常重要的一步，可以说DNA 质量的好坏直接决定了后续实验的成败。 [1] 基因组DNA提取方法不同，对细菌DNA降解程度的影响也不同，因此，从细菌中提取基因组DNA的潜在困难较大。目前国内外很多学者都在积极探索并研究各种高效的细菌基因组DNA提取方法，本文就近10年来国内外有关细菌基因组DNA的提取方法进行综述。[2] 1 DNA细菌提取方法 综合国内外文献，大致将细菌基因组DNA取提方法分为3大类：机械法、化学法和酶法。机械法包括冻融法、超声波法和玻璃珠法等; 化学法包括加入SDS 和苯酚等; 酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K和溶解酶等。[3] 1.1机械法 液氮冷冻研磨破碎细胞壁的方法通常用于植物总基因组DNA的提取破碎细胞的物理方法。对于不同的样品，需要根据具体的实际情况对超声条件进行优化。超声波法常与其他方法结合使用，如与复合螯合剂( 脱氧胆酸钠+PEG +Chelex 100) 等结合使用。微珠振荡法也是常被研究者们采用的一种DNA 提取方法。赵文怡等[10]比较不同方法破除金黄色葡萄球菌细胞壁时，发现玻璃微珠法可以
浅谈常用细胞破碎方法
浅谈常用细胞破碎方法 随着生物技术的逐渐发展，生物所产生的各种代谢产物也逐渐被人们发现其有用的一面，但是在获得目的产物过程中，往往因为不同产物所处的生物个体不同，造成了个体差异性，所以为了获得大量，不被破坏的产物，往往针对不同生物个体选用不同的细胞破碎技术来做预处理。现将几年来一直常用的细胞破碎技术介绍一下： 关键词：细胞破碎机械法酶法 （一）细胞破碎的定义 1.细胞破碎（cell rupture）技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 2.破碎各种细胞的主要阻力： 2.1破碎细菌细胞的主要阻力：肽聚糖网状结构的致密程度和强度，取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度; 2.2 破碎酵母细胞的阻力:葡聚糖交联的紧密程度和它的厚度; 2.3 破碎霉菌细胞的阻力:葡聚糖网状结构的交联度,几丁质或纤维素的纤维状结构。 (二) 细胞破碎的方法 1.机械法 1.1高压匀浆破碎法（homogenization） 高压匀浆器（High pressure homogenizer） 操作原理：在高压下迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。 操作方式：单次或多次循环 出口温度：20℃左右 压力：55－70Mpa 适用范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度：20%左右。☆团状和丝状菌，不宜使用。 注意事项： （1）操作温度：↑２－３℃/10MPa （2）对料液作冷却处理。 （3）多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。（4）较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，
细胞破碎方法
机械法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。 1.组织捣碎机 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。 由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。 2.匀浆器 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。制作匀浆器的材料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。 3.研钵 多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。 4.细菌磨 是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。 物理法 主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。在生化制备中常用的方法有： 1.反复冻溶法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液 的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。 2.急热骤冷法 将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。 3.超声波处理 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进
生物技术综合大实验
2013-2014学年生命科学综合大实验 。 GFP分离与纯化 >
1.文献综述 $ 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu
Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger （钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。 * ~
细胞破碎方法简述
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细胞破碎方法简述 2010-04-26 09:27:19|?分类：电泳资料 |标签： |字号大中小订阅 本文引用自啸月天狼《细胞破碎方法简述》 更多相关资料请查看 分离膜是指能以特定形式限制和传递流体物质的分隔两相或两部分的界面。膜的形式可以是固态的，也可以是液态的。被膜分割的流体物质可以是液态的，也可以是气态的。膜至少具有两个界面，膜通过这两个界面与被分割的两侧流体接触并进行传递。分离膜对流体可以是完全透过性的，也可以是半透过性的，但不能是完全不透过性的。膜在生产和研究中的使用技术被称为膜技术。随着科学技术的迅猛发展和人类对物质利用广度的开拓，物质的分离已成为重要的研究课题。分离的类型包括同种物质按不同大小尺寸的分离；异种物质的分离；不同物质状态的分离等。 在化工单元操作中，常见的分离方法有筛分、过滤、蒸馏、蒸发、重结晶、萃取、离心分离等。然而，对于高层次的分离，如分子尺寸的分离、生物体组分的分离等，采用常规的分离方法是难以实现的，或达不到精度，或需要损耗极大的能源而无实用价值。 具有选择分离功能的高分子材料的出现，使上述的分离问题迎刃而解。膜分离过程的主要特点是以具有选择透过性的膜作为分离的手段，实现物质分子尺寸的分离和混合物组分的分离。膜分离过程的推动力有浓度差、压力差和电位差等。膜分离过程可概述为以下三种形式： ①渗析式膜分离料液中的某些溶质或离子在浓度差、电位差的推动下，透过膜进入接受液中，从而被分离出去。属于渗析式膜分离的有渗析和电渗析等； ②过滤式膜分离利用组分分子的大小和性质差别所表现出透过膜的速率差别，达到组分的分离。属于过滤式膜分离的有超滤、微滤、反渗透和气体渗透等； ③液膜分离液膜与料液和接受液互不混溶，液液两相通过液膜实现渗透，类似于萃取和反萃取的组合。溶质从料液进入液膜相当于萃取，溶质再从液膜进入接受液相当于反萃取。 膜分离技术是利用膜对混合物中各组分的选择渗透性能的差异来实现分离、提纯和浓缩的新型分离技术。膜分离过程的共同优点是成本低、能耗少、效率高、无污染并可回收有用物质，特别适合于性质相似组分、同分异构体组分、热敏性组分、生物物质组分等混合物的分离，因而在某些应用中能代替蒸馏、萃取、蒸发、吸附等化工单元操作。实践证明，当不能经济地用常规的分离方法得到较好的分离时，膜分离作为一种分离技术往往是非常有用的。并且膜技术还可以和常规的分离方法结合起来使用，使技术投资更为经济。 膜分离过程没有相的变化(渗透蒸发膜除外)，常温下即可操作；由于避免了高温操作，所浓缩和富集物质的性质不容易发生变化，因此在膜分离过程食品、医药等行业使用具有独特的优点；膜分离装置简单、操作容易，对无机物、有机物及生物制品均可适用，并且不产生二次污染。由于上述优点，近二三十年来，膜科学和膜技术发展极为迅速，目前已成为工农业生产、国防、科技和人民日常生活中不可缺少的分离方法，越来越广泛地应用于化工、环保、食品、医药、电子、电力、冶金、轻纺、海水淡化等领域 细胞破碎方法简述随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃．很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当
细胞破碎方法
细胞破碎（clasmatosis）的方法 2010-02-20 21:00:42 来源：易生物实验浏览次数：615 网友评论0 条 不同的细胞器分离的方法是不同的，因此随之而然的破碎细胞的方法也是有差异的。 关键词：细胞细胞破碎clasmatosis 不同的细胞器分离的方法是不同的，因此随之而然的破碎细胞的方法也是有差异的。具体如下： 一、细胞器的分离：制备某种生物大分子时，往往需要采用细胞中某一部分为材料；或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，通常破碎细胞后，先分离各组分，以防干扰，这对制备—些高难度和高纯度的生物大分子是必要的，细胞器的分离，一般采用差速离心法，此法是利用细胞各组分质量大小不同，在离心管不同区域沉降的原理，分离出所需组分，分离得到的细胞器，其纯度可采用电子显微镜法、免疫学法或测定标志酶活力法进行鉴定。 二、细胞器的分离有时需要将组织细胞破碎，然后根据待分离的细胞器的理化特性，选择适当的分离方法。一般采用差速离心或密度梯度离心的方法达到分离细胞器的目的。 三、破碎方法： (1)杆状玻璃匀浆器法：该匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管 组成。使用时，先用锋利的刀片把组织块切碎，然后把碎块加入套管中，用力使玻杆移动使组织细胞破碎。 (2)高速组织捣碎机法：使用时将4℃预冷的组织碎块或细胞悬液加入捣碎机的梅花玻璃杯中，至杯体积的1/3即可盖好玻璃杯盖，固定好带杆叶片刀，缓慢调整旋转速度，一般开机数十秒后，组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。但不宜时间过长，以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解，用冷却水降温更好。 (3)超声波处理法：超声波发生器能产生高强度的超声信号，经换能器传送至与之接触的溶 液中，由声波形成冲击和振动而产生剪力，致使细胞破碎，动物组织肝、肾、胸腺、淋巴结、腹水细胞、红细胞、体外培养的细胞均可在短时间内破碎，因超声时可产热，应注意冰浴冷却，生物大分子如核酸和酶对超声敏感，一般不宜采用。 (4)化学裂介法：在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧胆酸钠均可使细胞裂解，往往仍需机械去辅助，方可在短时间内使细胞完全裂解，裂解后应清除化学裂解剂，以防止干扰分析。 (5)反复冻融法：组织细胞浓液在-70℃或液氢中冷冻后，于37℃融化，经3-4次冻融周期，可使细胞破碎。 另外，部分细胞器的分离一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。
三种微藻细胞破碎方法的比较
[7]梅景良,马燕梅,张红星.夏、冬两季黑鲷消化酶活力的比较[J ].中国海洋大学学报,2005,35(6):1001-1004. [8]黎军胜,李建林,吴婷婷.样品处理对罗非鱼和银鲫肠道消化酶活性测定的影响[J ].水产学报,2004,28(6):738-740. [9]M C Hidalg o ,E Urea ,A Sanz.C om parative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habits.Proteolytic and amylase activities [J ].Aqu aculture ,1999,170:267-283. [10]白东清,乔秀亭,乔之怡.pH 对丁 仔鱼和稚鱼肠及肝胰脏蛋白酶活性的影响[J ].水利渔业,2006,26(1):3-4. [11]王晓梅,戴伟,许童.丁 肠道及肝胰脏组织学研究[J ].水产科学,2005,24(3):13-15.[12]M Fur é,M C Hidalg o ,A l ópez ,M G arcia -G alleg o.Digestive enzyme ac 2tivities in Activities sturgeon Acipenser naccaii and rainbow trout Oncorhynchus myliss .A com parative study[J ].Aqu aculture ,2005,250:391-398.[13]Fevzi ,Y ilmaze.Reproductive biology of the tench T inca T inca (L.,1758)inhabiting P orsuk Dam Lake (K utahya ,Turkey )[J ].Fisheries R esearch ,2002,(55):313-317. [14]关胜军,吴锐全,谢骏.大口黑鲈主要消化器官淀粉酶活力的研究[J ].浙江海洋学院学报,2006,25(4):381-383. [15]倪寿文,桂远明,刘焕亮.草鱼、鲤、鲢、鳙和尼罗罗非鱼肝胰脏和肠道蛋白酶活性的初步探讨[J ].动物学报,1993,39(2):160-168. [16]Dhage K P.S tudies of the digestive enzymes in the there species of major Carps of India[J ].Biol .Sci .,1968,11:63-74. [17]周景祥,陈勇,黄权.鱼类消化酶的活性及环境条件的影响[J ].北华大学学报,2001,2(1):70-73. [18]田宏杰,庄平,章龙珍.水温对施氏鲟幼鱼消化酶活力的影响[J ].中国水产科学,2007,14(1):128-131. [19]梅景良,马燕梅.温度pH 对黑鲷消化酶主要消化酶活力的比较[J ].集美大学学报,2004,9(3):226-229.[20]黄耀桐,刘永坚.草鱼肠道、肝胰脏蛋白酶活性初步研究[J ].水生生物学报,1988,12(4):328-333. [21]吴众望,潘鲁青,董双林.9种金属离子对缢蛏消化酶活力的影响[J ].中国水产科学,2003,10(4):297-300. [22]Hai -ying W ang ,Y ue -Jun W ang ,Qing -Y in W ang.Purification and characterization of stomach protease from the turbot (Scophthalmus maximus .L )[J ].Physiol Biochem ,2006,6(10):263-274. [23]杨蕙萍,童圣英,王子臣.皱纹盘鲍淀粉酶和褐藻酸酶的研究[J ].水产学报,1998,22(4):345-351. 三种微藻细胞破碎方法的比较 陈伟平,陈必链3 ,张艳燕 (福建师范大学生命科学学院,福建福州350108) 摘要:目的:获得最佳的微藻藻胆蛋白提取方法。方法:采用溶胀法、反复冻融法、低浓度氯化钙溶液提取法和玻璃珠处理法等四种方法分别对紫球藻、蔷薇藻和念珠藻三种藻细胞进行破碎,通过测定藻红蛋白的纯度和浓度对四种细胞破碎方法效果进行比较。结果:当细胞密度为1.000g ΠL 时,采用反复冻融法处理紫球藻和蔷薇藻时能够获得最高的藻红蛋白纯度(OD 545ΠOD 280),分别为1.250和1.669,藻红蛋白的浓度分别为29.788mg ΠL 和36.026mg ΠL ,细胞密度对藻红蛋白纯度影响较小;低浓度氯化钙溶液提取法能使念珠藻藻红蛋白的纯度(OD 545ΠOD 280)达到0.477。结论:紫球藻和蔷薇藻经反复冻融法破碎细胞,藻红蛋白纯度高,提取效果好;而对念珠藻藻红蛋白提纯采用低浓度氯化钙溶液提取法效果好。 关键词:藻红蛋白;提取;细胞破碎;微藻 中图分类号:Q814.1;Q936;Q949.29 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)01-0055-04 Evaluation of Different Cell Disruption Processes on Microalgae CHE N Wei -ping ,CHE N Bi -lian 3 ,ZH ANG Y an -yan (C ollege of Life Sciences ,Fujian N ormal University ,Fuzhou 350108,China ) Abstract :Objective :In order to get the best extraction process of B -phycoerythrin from microalgae.Methods :F our kinds of cell disruption pro 2cesses (diss olving -bulging ,freezing and thawing ,low concentration of calcium chloride extraction and beading treated )were used to disrupt three microalge (Porphyridium cruentum ,Rhodella reticulata and Nostoc punctiforme ).The purity and concentration of B -phycoerythrin (B -PE )were used in the assay.R esults :By using freezing and thawing ,the highest purity of B -PE for Porphyridium cruenum and Rhodella reticu 2lata were obtained when cell density reached 1.000g ΠL.The purity and concentration of B -PE for Porphyridium cruentum were 1.250and 29.788mg ΠL ,for Rhodella reticulata were 1.669and 36.026mg ΠL ,respectively.Nostos punctiforme cells ,which was treated with low concentration of calcium chloride extraction ,reached the highest purity of B -PE (OD 545ΠOD 280=0.477)when cell concentration was 1.000g ΠL.Conclusion :By using freezing and thawing ,the highest purity of B -PE and the higher extract yield for Porphyridium cruenum and Rhodella reticulata were ob 2tained.Low concentration of calcium chloride extraction can be used for obtainning higher purity of B -PE from Nostos punctiforme .K ey w ords :B -phycoerythrin ;extraction ;cell disruption ;microalgae 收稿日期:2007-09-24;修回日期:2007-10-29 基金项目:福建省发展和改革委员会项目资助(闽计投资[2003]203)作者简介:陈伟平(1982-),男,福建漳州人,硕士生,从事海洋微藻研究,E -mail :cw p045@https://www.360docs.net/doc/627220500.html, ;3通讯作者:陈必链,E -mail :chenbil @https://www.360docs.net/doc/627220500.html, 。 藻胆蛋白是红藻和蓝藻所特有的、通过线性四吡咯发色团和脱辅蛋白相互结合的捕光色素蛋白。根据色素蛋白不同的吸收光谱特性,藻胆蛋白可以分成藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等三种。除了别藻蓝蛋白外,其他两种均有B -、b -、R -等类别,C -藻红蛋白、C -藻蓝蛋白和R -藻蓝蛋白在结构上存在相当明显的差异,因而光谱也存在一定的区别[1]。藻胆蛋白是一种从藻类中提取的天然蛋白质,是一种安全无毒的蛋白产品。目前已在许多领域得到应用,如功能食品、天 然色素、肿瘤治疗和荧光探针等[2-4] ,还作为光敏剂用于光动 力治疗癌等方面[5] 。高纯度的藻胆蛋白的零售价约为每毫克 50美元[6] 。 藻胆蛋白属于胞内可溶性蛋白,要提取分离藻胆蛋白,必须破碎藻细胞,使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来,获得藻胆蛋白粗提液,并保持其活性。藻胆蛋白粗提液中杂蛋白含量较高,还需进一步纯化。因此分离破碎藻细胞,获得藻胆蛋白粗提液是藻红蛋白分离纯化的第一步工作也是关键的一步工作。反复冻融法是非机械破碎的方法,具有方便,对热敏性物质没有损害,不受外源性杂质污染等优势特性,因而应用广泛。而对于蔷薇藻的细胞破碎方法文献报道较少。因此本论文采用溶胀法、反复冻融法、低浓度氯化钙溶液提取法、玻璃珠处理法等多种方法对不同浓度的紫球藻、蔷薇藻、念珠藻三种微藻进行破碎提取,通过不同方法结果比较,选择制备藻胆蛋白粗提液的最佳破碎方法,增加细胞破碎的藻红蛋白得率,为藻红蛋白工业化提纯奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 实验材料 紫球藻(Porphyridium cruentum )、蔷薇藻(Rhodella reticula 2ta )、念珠藻(Nostoc punctiforme )藻种购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。