微生物实验答案整理

1.在进行高压蒸汽灭菌时，是否只要灭菌锅压力表到达所需的值时锅内就能获

得所需的灭菌温度？为什么？

不是。灭菌温度是通过水和水蒸汽的压力提高锅内温度实现的；当灭菌锅内的空气未排净或仅排出一半时，虽然压力表指示的数值与排尽空气时相同，但不能、满足水蒸汽—温度函数关系，所以锅内温度并未达到所需值。

2.在手提式高压灭菌锅的盖上有哪些部件？它们各起什么作用？

部件：排气阀、安全阀和压力表。

作用：排气阀：点燃煤气灯，在水煮沸后，排出锅内空气以蒸汽代替，及灭菌后，压力降至表头零压后打开排气阀，消除锅体内外压力差。

安全阀：正常情况下，当压力超值时会自动放汽而降压与避险。

压力表：指示压力显示。

3.高压蒸汽灭菌过的操作有哪几个步骤？每一步骤应注意哪些问题？

步骤：加水、装料、加盖、排气、升压、保压、降压、取料和灭菌后处理。

注意：加水：在放入灭菌料桶前，加水至与隔架圈同样高度为止。若锅体

内无水或水量不够均会在灭菌时引起重大事故。

装料：放置装有培养基的器皿时，防止其内液体倾倒或溢出。瓶塞不应贴靠料桶壁，以防锅体降压时产生的冷凝水沾湿棉塞，或

渗透棉塞进入培养基等灭菌物品中。

加盖：采用对角方式同时两两拧紧锅体与锅盖间的螺栓，使六只螺

栓拧紧的锅盖各方受力均衡并使锅体完全密闭。在灭菌锅加

热时应及时开启排气阀。

排气：待空气排尽后，才可关闭排气阀继续加热。

升压：确定锅内空气是否排尽，十分重要。排尽后即可关闭排气阀。

保压：当锅内压力到达所需压力时，控制热源，维持压力至所需时

间。

降压：达到灭菌时间后，立即关闭热源，锅内压力降至表头零压后，在打开排气阀。否则锅内压力突然下降，使瓶装培养基或其

他液体因压力瞬间下降而发生复沸腾，造成事故。

取料：由于取料时，锅内温度及蒸汽很烫，故取料时一定要防止手及其他部位的皮肤烫伤。

灭菌后处理：灭菌完毕，必须倒掉锅内剩余水并擦干，以免日久铝

质装料通被腐蚀。

4.革兰氏染色的原理是什么？

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫

色。

5.在革兰式染色试验中，为什么会出现假阳性和假阴性？如何避免？

革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而误认为是革兰氏阴性菌。如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片之厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌做练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。

6.在微生物学实验中，常用于配制固体培养基的凝固剂是什么？它有哪些特性？如何使用？

琼脂。特性：化学成分单一且无营养价值，不影响培养基的本身的营养物质配比和菌种生长；遇热可融化冷却即呈凝固态，且透明度高黏着力强耐加压灭菌能力强，利于实验操作；分解性罕见，不会影响实验结果；常用浓度1%~2%，经济节约。

使用：在液体培养基中加入适量的琼脂（1%~2%）即可。

7.当物镜由低倍转到油镜时，随着放大倍数的增加，视野的亮度是增加还是减弱？应如何调节？

减弱。可以增加辅助光源的亮度来调整视野亮度。或调节聚光镜。

8.血球计数板计数时，计数室内如有气泡会对结果产生怎样的影响？如何避免产生气泡？

将影响菌悬液的随机分布而使计数产生误差。

吸取菌悬液滴加在盖玻片与计数板的边缘缝隙处，让菌液沿盖玻片与计数板间的缝隙渗入计数室以避免产生气泡。

9.在革兰式染色试验中，不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌？为什么？

可以。因为脱色后G+是紫色的而G-就已经没有颜色了，这时，其实已经可以区分了，但是如果不经复染的话，镜检时看不清G-的细胞形态，但可以区分。

10.简述从环境中分离具有水解淀粉酶活性的芽孢杆菌的主要步骤。

1，样本采集：采集周围有花草的成颗粒状的离地表10cm左右的土壤

2，目的菌种的富集：①取15g土壤加入250ml烧杯中，再加入40ml的无菌水振荡10min制成土壤混悬液，用无菌移液管吸取10ml土壤悬液加入富集培养基中，置于37℃的恒温培养箱中培养24h

②在85~90℃水浴锅中加热10min，杀灭菌体使芽孢得到富集

3，稀释涂布

梯度稀释：取5支加入4ml无菌水的试管，在一号试管中加入上述菌液1ml混匀，此时菌液稀释10 倍；取一号试管中菌液1ml加入二号试管中混匀，此时菌液稀释10^-2倍；其余试管依次类推

涂布平板：用一支新的无菌枪头，由低浓度土壤稀释液中吸取100ml对号较均

匀地倒入已标记好稀释浓度的选择培养基上（在此之前各试管要摇匀），用灼烧冷却后的无菌玻璃棒涂匀。每个浓度做1个平板。在37℃下恒温培养24h

芽孢杆菌的菌落扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶。

4，淀粉水解酶的鉴定

待菌落长出之后，滴加碘液，在菌落周围有透明圈证明芽孢杆菌产淀粉酶。5，革兰氏染色，镜检

芽孢杆菌经革兰氏染色后成紫色

6，复筛：酶活力的测定

用游标卡尺分别测量透明圈和菌落的直径。根据两者比值大小初步确定淀粉酶活性的高低。筛出酶活力最高的菌种。

11.利用加压蒸汽对培养基进行灭菌时，有何不利影响？如何防止？

灭菌可能某些不耐热的物质受到破坏，如使糖类形成氨基糖、焦糖。还可能使磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子结合形成难溶性复合物而生成沉淀。

生产上可以把糖类物质用连消的方法，可以减少有害物质生成。培养基中加入螯合剂，可以减少沉淀的生成。

12.V.P试验的目的和原理分别是什么？

目的：了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法。

原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

13.简述超净工作台在使用时主要的操作步骤。

1，检查超净工作台操作环境如环境温度、空气质量、电源灯，登记使用信息；

2，将实验需要的器材摆在工作台台面上，灭过菌的培养基等放在左侧，工具放在右侧；

3，拉下玻璃挡板，开启紫外灯照射30min进行表面灭菌；

4，30min后关闭紫外灯，打开风机调节至适当风量，打开照明灯；

5，打开玻璃挡板，用75%酒精擦拭双手和台面；

6，点燃酒精灯，操作过程严格遵循无菌操作规范；

7，操作完成后将实验器材清理出无菌操作台，75%酒精擦拭台面，关闭照明、风机和挡板；

8，开启紫外灯照射15min后关闭紫外灯