课程论文—木本植物转基因研究进展
木本植物转基因研究进展
摘要：从木本植物的概况及其转基因的现状、发展历程、研究现状、转化的目的基因、方法、受体系统、选择标记等方面入手，阐述了木本植物转基因研究的相关进展，并对各个环节的最新研究和存在的问题进行了简要的说明，探讨了可能的解决和替代方案，对于木本植物转基因未来的发展趋势进行了展望。
关键词：木本植物；转基因；研究进展
1.前言
木本植物指茎的木质化程度高、木质化细胞多、茎常较坚硬且直立的多年生植物，依形态不同，分乔木、灌木和半灌木三类。自古以来，木本植物在人类社会的各个层面都扮演着极为重要的角色，如建筑、工业、园林、食品等，已经成为人类必不可少的资源之一。此外，木本植物对于生物多样性、地表形态建成、全球气候等也有着决定性作用。
1974年，科恩（Cohen）将金黄色葡萄球菌质粒上的抗青霉素基因转到大肠杆菌体内，揭开了转基因技术应用的序幕[1]。将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。自诞生以来，转基因技术一直
毁誉参半，一方面，转基因技术对于植物性状改良、新品种的研发及生物技术的进步有着莫大的贡献；另一方面，由于转基因技术的不成熟和应用领域的关系，产生了一些负面影响，如遗传漂变、性状退化、致病性等，导致人们对转基因技术产生误解。即便如此，转基因技术的发展还是势不可挡，随着科学技术的不断进步和完善，转基因将有更多的用武之地。
长期以来，木本植物的改良主要是通过杂交育种的方式进行，但木本植物所特有的许多生物学特性，如较长的生长周期和童期、复杂的生殖方式、高度杂合性等，使得应用常规育种方法受到了极大的限制[2]，这就需求一种快速有效的方法来缩短木本植物的研究周期，从而更好地为人类的生产、生活提供帮助。转基因技术的兴起，为木本植物各方面的研究提供了契机，也为经济发展、人们生活水平的提高提供了机遇，现已逐渐成为研究的热点。
木本植物中，又以木本果树的研究较为热门和深入，转基因研究现已经在柠檬（Citrus limon）[3]、苹果（Malus pumila）[4]、柑橘（Citrus reticulata）[5]、葡萄（Vitis vinifera）[6]等植物上成功开展，为品种改良、抗病性、抗逆性方面的研究提供了参考。出于人们对转基因食品安全性的隐忧以及国家和政府对于转基因植物推广的慎重考虑，国内外转基因木本果树进行推广种植的很少，多数为学术研究，其他木本植物进
行转基因研究的品种也不多，难度较大，目前仅有杜鹃花（Rhododendron simsii）[7]、月季（Rosa hybirida）[8, 9]等植物，这二者已经成功实现市场化。月季是目前最成功的转基因花卉，转入F3’5’H基因后，花瓣呈现蓝色表型，性状较为稳定，观赏、经济价值较高，也得到了市场的认可
2.目的基因
植物基因工程的主要目的就是将能满足人们某种需要
的目的基因转入植株中，从而改良物种，表现出人们期望的表型。对于不同植物而言，人们所需要的目标性状也不一样。果树着重于产量、抗病虫害、抗逆性等方面，花卉着重于花色、花型、花香等方面，经济林着重于速生、减少分枝等，因此，要改造不同的植物，满足人们的各种需求，就需要寻找不同的目的基因。
病虫害是多年生植物面临的最大问题，对于木本植物来说，抗病虫害能力是衡量其价值的重要方面之一。一般而言，速生树种较之慢生树种，往往病虫害更多，抗病虫害能力也更差，严重影响其性状的发挥，而慢生树种在长时间的生长中，也会逐渐积累病害和虫害。在抗病方面，通过将各种致病病毒的外壳蛋白转入到木本植物中，如柑橘衰退病毒(CTV)[10]、番木瓜环斑病毒(PRSV)[11]、李痘病病毒(PPV)[12]等，得到了许多抗病的转基因植株，其中，抗PRSV的转基因番木瓜[11]已经开始商业化生产。在抗虫方面，目前已经克
隆得到的抗虫基因有很多种，根据其来源可以分为三大类：第一类是从细菌中分离出来的抗虫基因，主要是苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)杀虫结晶蛋白基因，以及营养杀虫蛋白基因Vip系列等；第二类是从植物组织中分离出来的抗虫基因，主要为蛋白酶抑制剂（Proteinase Inhibitor）基因，简称PI基因、外源凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因等；第三类是从动物体内分离到的毒素基因, 主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。[13]其中，关于Bt毒蛋白基因的研究相对较多，在植物上获得了一些成功的例子，如cry基因，已经在玉米（Zea mays）[14]、陆地棉（Gossypium hirsutum）[15]、康乃馨(Dianthus caryophyllus)[16]等植物上成功进行转基因实验，并有着一定的杀虫和抑制害虫生长发育的作用。自Hilder 等[17]首次将豇豆蛋白酶抑制剂（CpTI）基因转入烟草获得抗虫转基因植株以来，植物来源的抗虫基因越加受到重视，其他来源的基因也有成功获得转基因植株。研究表明，转入多个不同类型的抗虫基因能够提高转基因植物的杀虫能力，同时降低昆虫产生耐受性的可能[18]。双抗虫转基因白杨（Populus alba ×(P .davidiana +P .simonii)×P .tomentosa）[19]、转双价抗虫银腺杨（Populus alba ×P .glandulosa cv .‘4K’）[20]上转入的多种抗虫基因，相较于单基因，效果更好，对于害虫抑制性更强。
抗逆性也是植物重要的性状之一，抗逆性强的植物能适
应更多的环境，免去非必要的人力物力消耗，节约成本等。尤其对于林木而言，抗逆性十分重要，主要的非生物胁迫有干旱、低温、盐渍、重金属、氧化、渗透胁迫等，目前已经分离和鉴定的抗逆基因主要有增强抗盐能力的lmtl基因、mtlD基因和gutD基因，增强抗旱能力的otsBA基因和TPS 基因，降低渗透胁迫的P5CS基因，增强抗盐碱和水分胁迫的Bets基因和BADH基因等[21]。木本植物中，转双价耐盐mtlD基因和gutD基因的杨树[22]和火炬松[23]已经培育成功，且二者的耐盐性均高于普通品种；八棱海棠[24]、棉花[25]分别转入转番茄铁转运蛋白基因(LeI TR 2)和聚合ZmPLCl-betA基因后，在抗缺铁胁迫能力和抗旱性方面均得到了改善。
此外，成花相关因子LFY、FT、SOC1、AP1等，能缩短一些木本植物的童期，如枳橙[26]、苹果（Malus pumila）[27]，或能促进早花，调节花期等，对于木本植物的一些固有缺点能很好地弥补；木质素的生成相关基因4CL、CAD、COMT 等，通过基因沉默抑制其活性，可以减少木质素的生成，提高材性；花色相关基因CHS、ANS、3GT、f3h、3’5’h等，可以极大提高木本花卉的观赏性，创造出新的花色，或者自然界中不存在的花色。花相关基因的研究目前主要集中于草本植物上，如金鱼草（Antirrhinum majus）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、矮牵牛等，但对于木本植物而言，目前仍缺乏一种代表性的模式植物。
3.转化及受体系统
目前，木本植物转基因方法主要是采用农杆菌侵染法，部分植物也采用基因枪法[28]、和电击法[29]、PEG法[30]转化原生质体，方法多样，转化的效率也不相同。由于木本植物几乎都为双子叶植物，农杆菌转化法仍是一个成熟有效的转化方法，迄今为止还没有更有效的方法来替代。
根据植物的不同，转化所使用的转基因方法也不同。就农杆菌而言，目前，用于转化木本植物的农杆菌主要有根癌农杆菌和发根农杆菌两种，绝大多数成功的植物都是使用根癌农杆菌转化，少数为发根农杆菌，如山定子（Malus baccata）[31]、茶树（Camellia sinensis）[32]等，相较于前者，发根农杆菌能更好的介导这些植株的转化，获得更高的转化效率；进行农杆菌转化时，还应注意温度、pH值等环境因子[33]。部分农杆菌无法转化的植物，可以尝试直接转基因的方法，如基因枪等。
据细胞全能性理论，植物所有外植体均可以作为转基因受体。目前，转基因成功的材料包括叶片、叶柄、上胚轴、下胚轴、子叶、胚、胚性愈伤组织、体细胞胚、原生质体、茎段等，其中，以叶片为材料的转化系统较多，较为通用。不同外植体，转化效率差异也很大。在柑橘（Citrus reticulata）[34]中，未成熟外植体转化效率可以达到53%，而成熟外植体最高只能达到23%，虽然前者转化效率较高，但也要相当一
段时间才能开花结实。
4.选择标记
利用转基因方法将外源目的基因导入到植物细胞时，通常只有部分细胞可以成为稳定的转化细胞，因此，一般在转化系统中使用选择标记基因筛选转化细胞，以获得性状表现更明显、更为稳定的转基因植株。在选择压力下，非转化细胞不具备选择抗性而死亡，转化细胞和组织则整合有选择标记基因而表达抗性，从而能够继续成活并分化[35]。
选择标记系统有正向选择系统和负向选择系统两种，在木本植物的基因工程中，应用最为广泛的是负向选择系统，包括抗卡那霉素和潮霉素的抗生素选择标记系统等，如采用抗卡那霉素选择标记系统的番木瓜[11]、八棱海棠[34]等，采用抗潮霉素选择标记系统的柚子[36]等，还有一些植物采用除草剂选择标记系统，如桉树[37]等。然而，选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品，当转基因植株分化形成后，这些选择标记基因一般来说都是多余的。选择标记基因还引起了人们对其安全性方面的担心，同时限制了通过多次转化对转基因作物进行进一步改良[38]。此外，使用抗生素作为选择标记对植物本身也有影响，高浓度的抗生素抗生素会抑制转基因植株的生长发育[24, 39]。除上述负向选择标记外，还有一些正向选择标记系统已经应用到木本植物基因工程中，如采用磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因的甘露糖选择
标记系统、采用木糖异构酶基因(xy lA)的木糖选择标记系统等。研究表明，PMI系统对于植物的伤害更低，在番木瓜[40]等一些植物上，转化效率更高；木糖选择标记系统尚未在木本植物中得到应用，但相信以后会有更多这方面的研究出现[41]。鉴于选择标记系统的一些弊端，近年来，无选择标记转基因植物的培育已成为植物基因工程研究的一个新趋势，采用绿荧光蛋白基因(gfp)等作为报告基因的研究也有进行，可以避免选择压力，但目前还不完善，无法进行推广，仍需要更多的研究。
5.问题与展望
木本植物的转基因研究中还存在诸多问题，遗传转化体系还不够完善。与草本植物转基因相比，木本植物缺乏一种有说服力、有代表性的模式植物，相关的研究大多基于草本模式植物，由于物种差异，难免走弯路，也更难发现木本植物转基因方面的特性。此外，较长的生长周期限制了木本植物转基因技术的发展，导致转基因周期长，研究成果产出较慢，转化较慢，科研投入相对于草本植物也较少，这方面也是木本植物转基因技术需要解决的一个重要的方向；木本植物个体寿命长，世代更替较慢，基因杂合度高，在进化中积累了许多不同的基因型，严重影响了植株的再生和转化的效率，加之目前转基因技术尚不成熟，无法完全消除转基因嵌合体的存在，对于植株的再生也有一定影响，进一步降低了
再生频率。
在木本植物上，转基因的目的基因种类偏少，为达到人们所需要的性状要求，需要更多的研究和精力进行新基因的发现及功能验证；在转化及受体系统上，现有的直接和间接转化系统仍存在不少弊端，需要有一种廉价、高效、快速、通用的转化方法，来克服受体系统存在转化困难问题，而不需要在每种植物上都去摸索转化所需的外植体；在选择标记系统上，可以重点发展正向选择标记系统和无选择标记的转化系统，避免现在对植物生长发育的影响和存在的生物安全性问题。
参考文献
[1] 李志勇. 细胞工程[M]. 北京: 科学出版社, 2003.
[2] 杜景川，何正权，陈发菊，等. 木本植物转基因研究进展[J]. 福建林业科技. 2007(01): 142-148.
[3] Vardi A, Bleichman S, Aviv D. Genetic transformation of Citrus protoplasts and regeneration of transgenic plants.[J]. Plant Science. 1990, 69(90): 199-206.
[4] 赵先炎，赵强，刘鑫，等. 苹果MdDRB1基因在番茄中异位表达与功能研究[J]. 果树学报. 2015(2).
[5] 江学友，陈善春. 柑桔基因工程位点特异性重组系统研究进展[J]. 中国南方果树. 2014, 43(6).
[6] 任芳，董雅凤，张尊平，等. 葡萄抗病毒转基因研究进展[J]. 园艺学报. 2013, 40(9): 1633-1644.
[7] Knapp J, Kausch A, Auer C, et al. Transformation of Rhododendron through microprojectile bombardment[J]. Plant Cell Reports. 2001, 20(8): 749-754.
[8] Yukihisa K, Masako F M, Yuko F, et al. Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin.[J]. Plant & Cell Physiology. 2007, 48(11): 1589-1600.
[9] Chandler S F, Sanchez C. Genetic Modification; The Development Of Transgenic Ornamental Plant Varieties[J]. Plant Biotechnology Journal. 2012, 10(8): 891-903.
[10] Domínguez A, Mendoza A H D, Guerri J, et al. Pathogen-derived resistance to Citrus tristeza virus (CTV) in transgenic mexican lime (Citrus aurantifolia (Christ.) Swing.) plants expressing its p25 coat protein gene[J]. Molecular Breeding. 2002, 10(1-2): 1-10.
[11] Fitch M M, Manshardt R M, Gonsalves D, et al. Virus resistant papaya plants derived from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus[J]. Nature Biotechnology. 1992, 10(11): 1466-1472.
[12] Scorza R, Ravelonandro M, Callahan A M, et al. Transgenic plums (Prunus domestica L.) express the plum pox virus coat protein gene.[J]. Plant Cell Reports. 1994, 14(1): 18-22.
[13] 陈红梅，李昆志，陈丽梅. 植物来源抗虫基因的研究进展[J]. 中国生物工程杂志. 2008(11): 116-121.
[14] 李圣彦. 农杆菌介导转Bt cry1Ah基因抗虫玉米的研究[D]. 东北农业大学, 2011.
[15] Guo X, Huang C, Jin S, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Cry1C, Cry2A and Cry9C genes into Gossypium hirsutum and plant regeneration[J]. Biologia Plantarum. 2007, 51(2): 242-248.
[16] 王继磊. 两种Bt基因（cry1C~*和cry2A~*）抗虫花卉的培育[D]. 昆明理工大学, 2010.
[17] Hilder V A, Barker R F, Samour R A, et al. Protein and cDNA sequences of Bowman-Birk protease inhibitors from the cowpea (Vigna unguiculata Walp.)[J]. Plant Molecular Biology. 1989, 13(6): 701-710.
[18] 朱新生，朱玉贤. 抗虫植物基因工程研究进展[J]. Acta Botanica Sinica. 1997(3): 282-288.
[19] 郑均宝，梁海永，田颖川，等. 转双抗虫基因741毛白杨的选择及抗虫性[J]. 林业科学. 2000, 36(2): 13-19.
[20] 张冰玉，苏晓华，李义良，等. 转双价抗蛀干害虫基因杨树的获得及其抗虫性鉴定[J]. 林业科学研究. 2005, 18(3): 364-368.
[21] 陈哲，孔祥翔，张斐斐，等. 植物抗逆性基因工程研究进展[J]. 安徽农学通报. 2009, 15(7): 77-78.
[22] 樊军锋，韩一凡，李玲，等. mtlD/gutD双价基因转化美洲黑杨×青杨的研究[J]. 林业科学. 2002, 38(6): 30-35.
[23] Tang W. Enhanced tolerance to salt stress in transgenic loblolly pine simultaneously expressing two genes encoding mannitol-1-phosphate dehydrogenase and glucitol-6-phosphate dehydrogenase.[J]. Plant
Physiology & Biochemistry. 2005, 43(2): 139-146.
[24] Sc Q, Xd H, Z Z, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Malus robusta with tomato iron transporter gene.[J]. Acta Photophysiologica Sinica. 2005, 31(3).
[25] 吴伟. 转ZmPLC1-betA基因棉花的耐旱性研究[D]. 山东大学, 2012.
[26] Nobuhiro K, Hiroshi I, Makoto I, et al. Transgenic apple that over-expresses APETAL A1, a floral meristem identity gene of arabidopsis, is early flowering and sets fruit[J]. Hort Science. 2003, 38: 5. [27] Nilsson O, Weigel D. Modulating the timing of flowering[J]. Current opinion in biotechnology. 1997, 8(2): 195-199.
[28] Zhu Y J, Agbayani R, Mccafferty H, et al. Effective selection of transgenic papaya plants with the PMI/Man selection system.[J]. Plant Cell Reports. 2005, 24(7): 426-432.
[29] Vardi A, Bleichman S, Aviv D. Genetic transformation of Citrus protoplasts and regeneration of transgenic plants[J]. Plant Science. 1990, 69(2): 199-206.
[30] Guo W, Duan Y, Olivares-Fuster O, et al. Protoplast transformation and regeneration of transgenic Valencia sweet orange plants containing a juice quality-related pectin methylesterase gene[J]. Plant Cell Reports. 2005, 24(8): 482-486.
[31] 马志梅，王忆，许雪峰，等. 根癌农杆菌介导的山定子遗传转化的研究[J]. 核农学报. 2008, 22(2): 160-164.
[32] 张广辉，梁月荣，陆建良. 发根农杆菌介导的茶树发根高频诱导与遗传转化[J]. 茶叶科学. 2006, 26(1): 1-10.
[33] Changhe Yu, Shu Huang, Chunxian Chen, et al. Factors Affecting Agrobacterium-Mediated Transformation And Regeneration Of Sweet Orange And Citrange[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture. 2002, 71(2): 147-155.
[34] Li D, Shi W, Deng X. Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic calluses of Ponkan mandarin and the regeneration of plants containing the chimeric ribonuclease gene[J]. Plant Cell Reports. 2002, 21(2): 153-156.
[35] Dw D E O. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome.[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991, 88(23): 10558-10562.
[36] 叶霞，黄晓德，陶建敏，等. 农杆菌介导Ferritin基因转化苹果的研究[J]. 果树学报. 2005, 22(4).
[37] Harcourt R L, Kyozuka J, Floyd R B, et al. Insect- and herbicide-resistant transgenic eucalypts*[J]. Molecular Breeding. 2000, 6(3): 307-315.
[38] Yoder J I, Goldsbrough A P, Others. Transformation systems for generating marker-free transgenic plants[J]. Bio/technology. 1994, 12(3): 263-267.
[39] Boscariol R L, Almeida W A B, Derbyshire M T V C, et al. The use of the PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants (Citrus sinensis L. Osbeck).[J]. Plant Cell Reports. 2003, 22(2): 122-128.
[40] Gercheva P, Zimmerman R H, Owens L D, et al. Particle Bombardment of Apple Leaf Explants Influences Adventitious Shoot Formation[J]. Hortscience. 1994, 29(12): 1536-1538.
[41] Haldrup A, Petersen S G, Okkels F T. The xylose isomerase gene from Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent[J]. Plant Molecular Biology. 1998, 37(2): 287-296.