WesternBlot的原理和所用试剂汇总

Western Blot的原理和所用试剂汇总

Western免疫印迹（Western

Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western

Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

分类

western显影的方法主要有以下几种：

1.放射自显影

2.底物化学发光ECL

3.底物荧光ECF

4.底物DAB显色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

主要试剂

1、

丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、

分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。

4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L

HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、

TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.

6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS

12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O

32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L

Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。

8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。

9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。

10、脱脂奶粉5%(w/v)。

11、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。

13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

14、过氧化物酶标记的第二抗体。

15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。

18、100mmol/L NaCl。

19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。

Western blot试剂配方

SDS-PAGE相关试剂、缓冲液的配置方法 1.5M Tris-HCl 组分浓度：1.5M 配制量：200ml 配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。 Tris-base 36.33g 2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.调pH=8.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml， 4℃保存 1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M 配制量：200ml 配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。 Tris-base 24.22g 2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.调pH=6.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml， 4℃保存 1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M 配制量：200ml 配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。 Tris-base 24.22g 2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.调pH=7.5(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml， 4℃保存 10%SDS （W/V）组份浓度：10%（W/V）SDS 配置量：200ml 配制方法： 1.称取2g SDS。 2.加入200ml的去离子水后搅拌溶解。注意：溶解定容SDS时不宜剧烈摇晃，避免产生过多的泡沫；10%SDS溶液在低温是易析出晶体，可以置于70℃溶解。 30%（W/V）丙烯酰胺组份浓度：30%（W/V）Acrylamide 配制量：200ml 配制方法：1.称量下列制剂，置于1L烧杯中。丙烯酰胺58g N-N亚甲基双丙烯酰胺2g 2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至200ml，用定性滤纸滤去杂质。 4.于棕色瓶中4℃保存。

(完整版)化工原理概念汇总

化工原理知识绪论 1、单元操作：（Unit Operations）：用来为化学反应过程创造适宜的条件或将反应物分离制成纯净品，在化工生产中共有的过程称为单元操作（12）。单元操作特点： ①所有的单元操作都是物理性操作，不改变化学性质。②单元操作是化工生产过程中共有的操作。③单元操作作用于不同的化工过程时，基本原理相同，所用设备也是通用的。单元操作理论基础：（11、12）质量守恒定律：输入=输出+积存能量守恒定律：对于稳定的过，程输入=输出动量守恒定律：动量的输入=动量的输出+动量的积存 2、研究方法：实验研究方法（经验法）：用量纲分析和相似论为指导，依靠实验来确定过程变量之间的关系，通常用无量纲数群(或称准数)构成的关系来表达。数学模型法（半经验半理论方法）：通过分析，在抓住过程本质的前提下，对过程做出合理的简化，得出能基本反映过程机理的物理模型。（04） 3、因次分析法与数学模型法的区别：（08B）数学模型法（半经验半理论）因次论指导下的实验研究法实验：寻找函数形式，决定参数

第二章：流体输送机械一、概念题 1、离心泵的压头（或扬程）：离心泵的压头（或扬程）：泵向单位重量的液体提供的机械能。以H 表示，单位为m 。 2、离心泵的理论压头：理论压头：离心泵的叶轮叶片无限多，液体完全沿着叶片弯曲的表面流动而无任何其他的流动，液体为粘性等于零的理想流体，泵在这种理想状态下产生的压头称为理论压头。实际压头：离心泵的实际压头与理论压头有较大的差异，原因在于流体在通过泵的过程中存在着压头损失，它主要包括：1）叶片间的环流，2）流体的阻力损失，3）冲击损失。 3、气缚现象及其防止：气缚现象：离心泵开动时如果泵壳内和吸入管内没有充满液体，它便没有抽吸液体的能力，这是因为气体的密度比液体的密度小的多，随叶轮旋转产生的离心力不足以造成吸上液体所需要的真空度。像这种泵壳内因为存在气体而导致吸不上液的现象称为气缚。防止：在吸入管底部装上止逆阀，使启动前泵内充满液体。 4、轴功率、有效功率、效率有效功率：排送到管道的液体从叶轮获得的功率，用Ne 表示。效率：轴功率：电机输入离心泵的功率,用N 表示，单位为J/S,W 或kW 。二、简述题 1、离心泵的工作点的确定及流量调节工作点：管路特性曲线与离心泵的特性曲线的交点，就是将液体送过管路所需的压头与泵对液体所提供的压头正好相对等时的流量，该交点称为泵在管路上的工作点。流量调节： 1）改变出口阀开度——改变管路特性曲线； 2）改变泵的转速——改变泵的特性曲线。 2、离心泵的工作原理、过程：开泵前，先在泵内灌满要输送的液体。开泵后，泵轴带动叶轮一起高速旋转产生离心力。液体在此作用下，从叶轮中心被抛向 g QH N e ρ=η/e N N =η ρ/g QH N =

化工原理公式和重点概念

《化工原理》重要公式第一章流体流动牛顿粘性定律 dy du μτ= 静力学方程 g z p g z p 2211 +=+ρ ρ 机械能守恒式 f e h u g z p h u g z p +++=+++2222222111 ρρ 动量守恒 )(12X X m X u u q F -=∑ 雷诺数 μμρ dG du ==Re 阻力损失 22 u d l h f λ= ????d q d u h V f ∞∞ 层流 Re 64=λ 或 2 32d ul h f ρμ= 局部阻力 2 2 u h f ζ= 当量直径 ∏ =A d e 4 孔板流量计 ρP ?=20 0A C q V ， g R i )(ρρ-=?P 第二章流体输送机械管路特性 242)(8V e q g d d l z g p H πζλ ρ+∑+?+?= 泵的有效功率 e V e H gq P ρ= 泵效率 a e P P =η

最大允许安装高度 100][-∑--=f V g H g p g p H ρρ]5.0)[(+-r NPSH 风机全压换算 ρ ρ''T T p p = 第四章流体通过颗粒层的流动物料衡算：三个去向：滤液V ，滤饼中固体）（饼ε-1V ，滤饼中液体ε饼V 过滤速率基本方程 )(22 e V V KA d dV +=τ ，其中 φμ 012r K S -?=P 恒速过滤 τ22 2 KA VV V e =+ 恒压过滤 τ222KA VV V e =+ 生产能力 τ ∑=V Q 回转真空过滤 e e q q n K q -+=2? 板框压滤机洗涤时间(0=e q ,0=S ) τμμτV V W W W W 8P P ??= 第五章颗粒的沉降和流态化斯托克斯沉降公式 μρρ18)(2 g d u p p t -=， 2R e

化工原理重要概念和公式

《化工原理》重要概念第一章流体流动质点含有大量分子的流体微团，其尺寸远小于设备尺寸，但比起分子自由程却要大得多。连续性假定假定流体是由大量质点组成的、彼此间没有间隙、完全充满所占空间的连续介质。拉格朗日法选定一个流体质点 , 对其跟踪观察，描述其运动参数 ( 如位移、速度等 ) 与时间的关系。欧拉法在固定空间位置上观察流体质点的运动情况，如空间各点的速度、压强、密度等，即直接描述各有关运动参数在空间各点的分布情况和随时间的变化。轨线与流线轨线是同一流体质点在不同时间的位置连线，是拉格朗日法考察的结果。流线是同一瞬间不同质点在速度方向上的连线，是欧拉法考察的结果。系统与控制体系统是采用拉格朗日法考察流体的。控制体是采用欧拉法考察流体的。理想流体与实际流体的区别理想流体粘度为零，而实际流体粘度不为零。粘性的物理本质分子间的引力和分子的热运动。通常液体的粘度随温度增加而减小，因为液体分子间距离较小，以分子间的引力为主。气体的粘度随温度上升而增大，因为气体分子间距离较大，以分子的热运动为主。总势能流体的压强能与位能之和。可压缩流体与不可压缩流体的区别流体的密度是否与压强有关。有关的称为可压缩流体，无关的称为不可压缩流体。伯努利方程的物理意义流体流动中的位能、压强能、动能之和保持不变。平均流速流体的平均流速是以体积流量相同为原则的。动能校正因子实际动能之平均值与平均速度之动能的比值。均匀分布同一横截面上流体速度相同。均匀流段各流线都是平行的直线并与截面垂直 , 在定态流动条件下该截面上的流体没有加速度 , 故沿该截面势能分布应服从静力学原理。

层流与湍流的本质区别是否存在流体速度 u 、压强 p 的脉动性，即是否存在流体质点的脉动性。第二章流体输送机械管路特性方程管路对能量的需求，管路所需压头随流量的增加而增加。输送机械的压头或扬程流体输送机械向单位重量流体所提供的能量 (J/N) 。离心泵主要构件叶轮和蜗壳。离心泵理论压头的影响因素离心泵的压头与流量，转速，叶片形状及直径大小有关。叶片后弯原因使泵的效率高。气缚现象因泵内流体密度小而产生的压差小，无法吸上液体的现象。离心泵特性曲线离心泵的特性曲线指 H ｅ～ q V ，η～ q V ， P ａ～ q V 。离心泵工作点管路特性方程和泵的特性方程的交点。离心泵的调节手段调节出口阀，改变泵的转速。汽蚀现象液体在泵的最低压强处 ( 叶轮入口 ) 汽化形成气泡，又在叶轮中因压强升高而溃灭，造成液体对泵设备的冲击，引起振动和侵蚀的现象。必需汽蚀余量 (NPSH)r 泵入口处液体具有的动能和压强能之和必须超过饱和蒸汽压强能多少离心泵的选型 ( 类型、型号 ) ①根据泵的工作条件，确定泵的类型；②根据管路所需的流量、压头，确定泵的型号。正位移特性流量由泵决定，与管路特性无关。往复泵的调节手段旁路阀、改变泵的转速、冲程。离心泵与往复泵的比较 ( 流量、压头 ) 前者流量均匀，随管路特性而变，后者流量不均匀，不随管路特性而变。前者不易达到高压头，后者可达高压头。前者流量调节用泵出口阀，无自吸作用，启动时关出口阀；后者流量调节用旁路阀，有自吸作用，启动时开足管路阀门。通风机的全压、动风压通风机给每立方米气体加入的能量为全压 (Pa=J/m 3 ) ，其中动能部分为动风压。

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 3.步骤（一）蛋白样品制备培养的细胞（定性） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在 5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反 6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 7.待样品恢复到室温后上样。培养的细胞（定量） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 4.12000g离心，4℃，2min。 5.取少量上清进行定量。 6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。（二）SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样（3）电泳（三）转膜（四）免疫反应（五）化学发光，显影，定影（六）凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

western blot实验步骤

Western bolt 一、实验目的通过实验了解western blot技术的原理和操作。二、实验原理 SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X射线摄影暗匣 8.X射线胶片 9.塑料薄膜四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g

Western blot 常用试剂配制

Western blot 常用试剂配制 1.5 mol/L Tris (PH8.8) 1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。 2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。 3．用浓盐酸调节pH值至8.8。 4．定容至1L. 5．高压灭菌后，室温保存。注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。（参照kara公司Catalog-N1） 1 mol/L Tris (PH6.8) 1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。 2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。 3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。 pH值浓HCl 6.8 7.4 约70 ml 7.6 约60 ml 8.0 约42 ml 4．定容至1L. 5．高压灭菌后，室温保存。注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH

值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。（参照kara公司Catalog-N1） 30％丙稀酰胺（100ml） 1．称量下列试剂置于烧杯中。丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g 双丙烯酰胺(BIS) 1 g 2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。 3．定容至100 ml, 用0.45 μm滤膜滤去杂质。 5．于棕色瓶中4 oC保存。注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924） 30％SDS 1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。 2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。

化工原理基本概念

基本定义理想溶液 ideal solution(s)：溶液中的任一组分在全部浓度范围内都符合拉乌尔定律[1]的溶液称为理想溶液。这是从宏观上对理想溶液的定义。从分子模型上讲，各组分分子的大小及作用力，彼此相似，当一种组分的分子被另一种组分的分子取代时，没有能量的变化或空间结构的变化。换言之，即当各组分混合成溶液时，没有热效应和体积的变化。即这也可以作为理想溶液的定义。除了光学异构体的混合物、同位素化合物的混合物、立体异构体的混合物以及紧邻同系物的混合物等可以(或近似地)算作理想溶液外，一般溶液大都不具有理想溶液的性质。但是因为理想溶液所服从的规律较简单，并且实际上，许多溶液在一定的浓度区间的某些性质常表现得很像理想溶液，所以引入理想溶液的概念，不仅在理论上有价值，而且也有实际意义。以后可以看到，只要对从理想溶液所得到的公式作一些修正，就能用之于实际溶液。各组成物质在全部浓度范围内都服从拉乌尔定律的溶液。[2]对于理想溶液，拉乌尔定律与亨利定律反映的就是同一客观规律。其微观模型是溶液中各物质分子的大小及各种分子间力(如由A、B二物质组成的溶液，即为A-A、B-B及A-B 间的作用力)的大小与性质相同。由此可推断：几种物质经等温等压混合为理想溶液，将无热效应，且混合前后总体积不变。这一结论也可由热力学推导出来。理想溶液在理论上占有重要位臵，有关它的平衡性质与规律是多组分体系热力学的基础。在实际工作中，对稀溶液可用理想溶液的性质与规律作各种近似计算。泡点：液体混合物处于某压力下开始沸腾的温度，称为在这压力下的泡点。若不特别注明压力的大小，则常常表示在0.101325MPa下的泡点。泡点随液体组成而改变。对于纯化合物，泡点也就是在某压力下的沸点。一定组成的液体，在恒压下加热的过程中，出现第一个气泡时的温度，也就是一定组成的液体在一定压力下与蒸气达到汽液平衡时的温度。泡点随液相组成和压力而变。当泡点与液相组成的关系中，出现极小值或极大值时，这极值温度相应称为最低恒沸点或最高恒沸点，这时，汽相与液相组成相同，相应的混合物称为恒沸混合物。汽液平衡时，液相的泡点即为汽相的露点。

WesternBlot原理和操作方法(全)讲解

Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30

western blot 相关试剂及步骤

Western Blot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集（一）器材和试剂准备：镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL离心管、液氮（二）步骤（以心脏为例）: 1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号 2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中 3、组织于-80摄氏度冻存二、组织蛋白的提取：（一）器材和试剂准备： 4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步骤 1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF解冻 2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管 3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。每管研磨的转速和时间保持一致。当出现大量泡沫时即可停止 4、静置于冰盒30分钟 5、12000rpm，4摄氏度，30分钟 6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。前者用于测试，后者备用。-80摄氏度冻存。注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存

化工原理概念汇总

化工原理基本概念和原理

化工原理基本概念和原理蒸馏––––基本概念和基本原理利用各组分挥发度不同将液体混合物部分汽化而使混合物得到分离的单元操作称为蒸馏。这种分离操作是通过液相和气相之间的质量传递过程来实现的。对于均相物系，必须造成一个两相物系才能将均相混合物分离。蒸馏操作采用改变状态参数的办法（如加热和冷却）使混合物系内部产生出第二个物相（气相）；吸收操作中则采用从外界引入另一相物质（吸收剂）的办法形成两相系统。一、两组分溶液的气液平衡 1．拉乌尔定律理想溶液的气液平衡关系遵循拉乌尔定律： p A =p A 0x A p B =p B 0x B =p B 0（1—x A ）根据道尔顿分压定律：p A =Py A 而P=p A +p B 则两组分理想物系的气液相平衡关系： x A =（P—p B 0）/（p A 0—p B 0）———泡点方程 y A =p A 0x A /P———露点方程对于任一理想溶液，利用一定温度下纯组分饱和蒸汽压数据可求得平衡的气液相组成；反之，已知一相组成，可求得与之平衡的另一相组成和温度（试差法）。

2．用相对挥发度表示气液平衡关系溶液中各组分的挥发度v可用它在蒸汽中的分压和与之平衡的液相中的摩尔分率来表示，即v A=p A/x A v B=p B/x B 溶液中易挥发组分的挥发度对难挥发组分的挥发度之比为相对挥发度。其表达式有： α=v A/v B=（p A/x A）/（p B/x B）=y A x B/y B x A 对于理想溶液：α=p A0/p B0 气液平衡方程：y=αx/[1+（α—1）x] Α值的大小可用来判断蒸馏分离的难易程度。α愈大，挥发度差异愈大，分离愈易；α=1时不能用普通精馏方法分离。 3．气液平衡相图（1）温度—组成（t-x-y）图该图由饱和蒸汽线（露点线）、饱和液体线（泡点线）组成，饱和液体线以下区域为液相区，饱和蒸汽线上方区域为过热蒸汽区，两曲线之间区域为气液共存区。气液两相呈平衡状态时，气液两相温度相同，但气相组成大于液相组成；若气液两相组成相同，则气相露点温度大于液相泡点温度。（2）x-y图

Western_blot_试剂配制及操作流程

Western-Blot操作流程试剂配制 1.RIPA裂解液： 10mM Tris（MW121.14，PH7.5） 1%NP40 0.5%TritonX-100 0.2%脱氧胆酸钠 2 mM EDTA 1 mM PMSF 20%甘油调pH值至7.5。混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。制胶用（1-6）： 1. 1.0mol/L Tris〃HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris〃HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3.10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g

（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。 6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。 10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加入去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。 7．5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8．10X转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g

wb原理步骤及总结

实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。主要溶液 10%分离胶水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑴凝胶配置 ①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm 处，停止灌胶。检查是否有气泡，若有用滤纸条吸出。然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封。15~30min后，凝胶和水封层界面清晰，说明胶已经聚合完全，然后用滤纸吸取水封层，滤纸切勿接触到凝胶面。（使蛋白样品分离） ②浓缩胶的配置：将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上，直至短玻璃板的顶端，然后插入样品

常用westernblot试剂配方

Western blot常用试剂配方 1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g 双丙烯酰胺1g 加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。 2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g 蒸馏水9 ml 初始PH约为，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至，定容至10ml。（四甲基乙二胺）（成品） 4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH ）：50ml Tris-base 9.085 g 蒸馏水45 ml 加浓盐酸（约）调PH至后定容至50ml，4℃保存。 5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH ）：50ml Tris-base 6.055 g 蒸馏水44 ml 加浓盐酸调PH至后定容至50ml，4℃保存。 6. 10%过硫酸铵（10% AP）：新鲜配制称取0.05g AP于EP管中，储存于-20℃，用时溶于蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50ml upper buffer ml 甘油（丙三醇）ml 25ml

SDS g 5g DTT 0.0385 g 溴酚蓝加蒸馏水溶解后定容至1ml。取加蒸馏水配成工作液。8. 5 × running buffer：（1000ml） Tris-base 15.1 g 甘氨酸（Glycine）94 g SDS 5 g 加蒸馏水溶解后定容至1000ml。用时加4000 ml蒸馏水。 9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml 冰乙酸10 ml 蒸馏水60 ml 考马斯亮-250 0.05 g 10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml 甲醇（30%）150ml 加蒸馏水定容至500ml。 11. Transbuffer（PH ）：100ml 现用现配 Tris-base 0.3028 g 甘氨酸 1.4872 g 甲醇20 ml 加蒸馏水定容至100ml。 12. 10 x 丽春红染液（储存液）：（可重复利用）（用时用蒸馏水稀释为1 X 的）染色后用纯水脱色

《化工原理》基本概念、主要公式

《化工原理》基本概念、主要公式第一章基本概念：连续性假定质点拉格朗日法欧拉法定态流动轨线与流线系统与控制体粘性的物理本质质量守恒方程静力学方程总势能理想流体与实际流体的区别可压缩流体与不可压缩流体的区别牛顿流体与非牛顿流体的区别伯努利方程的物理意义动量守恒方程平均流速动能校正因子均匀分布均匀流段层流与湍流的本质区别稳定性与定态性边界层边界层分离现象因次雷诺数的物理意义泊谡叶方程因次分析实验研究方法的主要步骤摩擦系数完全湍流粗糙管局部阻力当量长度毕托管驻点压强孔板流量计转子流量计的特点非牛顿流体的特性(塑性、假塑性与涨塑性、触变性与震凝性、粘弹性) 重要公式：牛顿粘性定律dyduμτ= 静力学方程gzpgzp2211+=+ρρ 机械能守恒式fehugzphugzp+++=+++2222222111ρρ 动量守恒)(12XXmXuuqF?=Σ 雷诺数μμρdGdu==Re 阻力损失22udlfλ=h ????dqduhVf∞∞ 层流Re64=λ或232dulhfρμ= 局部阻力22ufζ=h 当量直径Π=Ae4d 孔板流量计ρPΔ=200ACqV ，gRi)(ρρ?=ΔP 第二章基本概念：管路特性方程输送机械的压头或扬程离心泵主要构件离心泵理论压头的影响因素叶片后弯原因气缚现象离心泵特性曲线离心泵工作点离心泵的调节手段汽蚀现象必需汽蚀余量(NPSH)r 离心泵的选型(类型、型号) 正位移特性往复泵的调节手段离心泵与往复泵的比较(流量、压头) 通风机的全压、动风压真空泵的主要性能参数

重要公式：管路特性242)(8VeqgddlzgpHπζλρ+Σ+Δ+Δ= 泵的有效功率eVeHgqPρ=

化工原理知识点总结

一、流体力学及其输送 1.单元操作：物理化学变化的单个操作过程，如过滤、蒸馏、萃取。 2.四个基本概念：物料衡算、能量衡算、平衡关系、过程速率。 3.牛顿粘性定律：F=±τA=±μAdu/dy ，(F ：剪应力；A ：面积；μ：粘度；du/dy ：速度梯度)。 4.两种流动形态：层流和湍流。流动形态的判据雷诺数Re=duρ/μ；层流—2000—过渡—4000—湍流。当流体层流时，其平均速度是最大流速的1/2。 5.连续性方程：A1u1=A2u2；伯努力方程：gz+p/ρ+1/2u2=C 。 6.流体阻力=沿程阻力+局部阻力；范宁公式：沿程压降：Δpf=λlρu2/2d ，沿程阻力：Hf=Δpf/ρg=λl u2/2dg(λ：摩擦系数)；层流时λ=64/Re ，湍流时λ=F(Re ，ε/d)，(ε：管壁粗糙度)；局部阻力hf=ξu2/2g ，(ξ：局部阻力系数，情况不同计算方法不同) 7.流量计：变压头流量计(测速管、孔板流量计、文丘里流量计)；变截面流量计。孔板流量计的特点；结构简单，制造容易，安装方便，得到广泛的使用。其不足之处在于局部阻力较大，孔口边缘容易被流体腐蚀或磨损，因此要定期进行校正，同时流量较小时难以测定。转子流量计的特点——恒压差、变截面。 8.离心泵主要参数：流量、压头、效率（容积效率?v ：考虑流量泄漏所造成的能量损失；水力效率?H ：考虑流动阻力所造成的能量损失；机械效率?m ：考虑轴承、密封填料和轮盘的摩擦损失。）、轴功率；工作点(提供与所需水头一致)；安装高度(气蚀现象，气蚀余量)；泵的型号(泵口直径和扬程)；气体输送机械：通风机、鼓风机、压缩机、真空泵。 9. 常温下水的密度1000kg/m3,标准状态下空气密度1.29 kg/m3 1atm =101325Pa=101.3kPa=0.1013MPa=10.33mH2O=760mmHg （1）被测流体的压力 > 大气压表压 = 绝压－大气压（2）被测流体的压力 < 大气压真空度 = 大气压－绝压= －表压 10. 管路总阻力损失的计算 11. 离心泵的构件: 叶轮、泵壳（蜗壳形）和轴封装置离心泵的叶轮闭式效率最高，适用于输送洁净的液体。半闭式和开式效率较低，常用于输送浆料或悬浮液。气缚现象：贮槽内的液体没有吸入泵内。汽蚀现象：泵的安装位置太高，叶轮中各处压强高于被输送液体的饱和蒸汽压。原因（①安装高度太高②被输送流体的温度太高，液体蒸汽压过高；③吸入管路阻力或压头损失太高）各种泵：耐腐蚀泵:输送酸、碱及浓氨水等腐蚀性液体 12. 往复泵的流量调节（1）正位移泵流量只与泵的几何尺寸和转速有关，与管路特性无关，压头与流量无关，受管路的承压能力所限制，这种特性称为正位移性，这种泵称为正位移泵。往复泵是正位移泵之一。正位移泵不能采用出口阀门来调节流量，否则流量急剧上升，导致示损坏。（2）往复泵的流量调节第一，旁路调节，如图2-28所示，采用旁路阀调节主管流量，但泵的流量是不变的。第二，改变曲柄转速和活塞行程。使用变速电机或变速装置改变曲柄转速，达到调节流量，使用蒸汽机则更为方便。改变活塞行程则不方便。 13.流体输送机械分类 14.离心泵特性曲线： 222'2e 2e 2u d l l u d l l u d l h h h f f f ??? ? ??++=???? ??+=??? ??+=+=∑∑∑∑∑∑ζλλζλ