微生物限度检查概述及方法
微生物限度检查概述及方法
第一部分药品微生物限度检查原理；
一微生物学基本原理
（一）、微生物的概念和类别；
所谓微生物（microorgamisms）是一群个体微小结构简单肉眼不能直接看到，必须借助显微镜以及其它手段才能辨别微小生物。
1、结构类型
按微生物细胞结构和组成不同可分
原核细胞型微生物：代表（细菌）真核细胞型微生物：代表（真菌）非细胞型微生物：代表（病毒）
2、营养类型
根据微生物的不同营养要求，可分为自养型和异养型两类，又以所利用能源的来源不同，分为化能营养型和光能营养型。
药品中所污染的微生物，从营养型角度看，他大多数异养型，且以腐生性和兼性寄生性化能异养型为主，容易用人工培养繁殖，是药品进行无菌及限度检查的最基本原理。
3、影响微生物生长繁殖的因素
1）物理因素：温度、湿度、渗逶压、辐射
2）化学因素：营养物质、酸碱度、氧、有毒物质：
其影响微生物生长的机制主要有
a 使菌体蛋白变性或沉淀
b 干扰微生物酶系统各的影响其代谢
c 损伤微生物细胞膜，使内容物逸出。
3）生物因素。
在微生物之间，微生物与寄主动植物之间均存在着各种互相作用的关系，主要为寄生、共生、拮抗关系等。噬菌体与寄主菌、细菌素对某些细菌的抗菌作用，就是生物因素的具体表现。四、微生物代谢及其在生长检定中的意义
微生物生化鉴定试验，所使用的基本原理，就是利用微生物所物有的代谢反应，其中大部分波及到酶的反应
1）微生物主要代谢内容
A、呼吸作用-根据微生物呼吸作用最终电子受体性质分为呼吸作用，无氧呼吸作用及发酵作用三种，无本质区别，都是物质被氧化，同时另一物质被还原只是物质被氧化分解程度和释放水平不同。
相关的生化鉴反应
如过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，氰化钾试验等。
B、糖的分解
有关的生化鉴定反应
如糖（醇、苷）类发酵试验，葡萄糖的氧化/发酵试验，甲基试验，甲基红试验，VP试验
C、蛋白质和氨基酸的分解
相关生化鉴定试验
如吲哚试验、明胶液化试验、硫化氢试验等。
（2）、微生物酶
酶是由细胞产生的特殊蛋白质或特殊蛋白质复合物，并能催化各种生物化学反应的有机催化剂，与一般无机催化剂相比，酶能在常温压下进行催化，有催化效率高和高度专一性的特点。
有关的生化鉴定反应
如糖代谢试验中的B-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）蛋白质和氨基酸的代谢中的氨基酸试验等。
二、药品中常见几种微生物的介绍
1、细菌一般知识
细菌形态多样，个体较小，一般的1~10UM
细菌细胞结构：粘液层和夹膜-血清学分理
细胞壁-革兰氏染色
细胞膜-生化鉴别（蛋白质分解）
细胞质
核质-DNA
附属器官（鞭毛、菌毛、芽孢）--识别、签定细菌种类重要特征
细菌生长变化过程：1、诱导期2、对数生长期3、稳定期4、死亡期
细菌的群体形态：1、菌落2、菌苔3、液体培养物质形态
细菌在液体培养基内的生长现象，基本上分为混浊、菌膜、沉淀三种。以药品中检验的细菌为例，大肠埃希氏杆菌、沙门菌、志贺菌均为混浊生长；铜绿假单胞菌为专性需氧菌，在培养基表面可形成菌膜，膜下混浊，越往下菌越少；金黄色葡萄球菌也为均匀混浊生长，但有部分细菌可沉淀于管认底。
细菌菌种的鉴定方法：1、菌种纯化2、鉴定的基本肉容
2、霉菌的一般知识
1、霉菌属于直菌，示指专营腐生或寄生生活的一群微小的丝状真菌，属真菌的一部分大多数霉菌属于无子实体的丝状真菌，具分枝的菌丝交织或菌丝体。一部分菌丝可产生孢子进行繁殖产生子孙，一部分则吸取营养称营养菌丝。霉菌菌落不是群体，一般为个体，由一个孢子萌发，生长而形成的菌丝支织而成为菌丝体
2、药品常见的霉菌属1）根霉属2）毛霉属3）犁头霉属4）基他
3、酵母菌一般知识
1、酵母菌多数为单细胞，一般呈卯圆形、圆形或圆柱形，常有芽体相连为真核细胞、有完整的细胞结构，具细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核及细胞器
2、常见的酵母菌属有1、酵母菌属，一般在液体培养时不产生菌酵，在长期培养后有的能生成菌酵2、裂殖酵母菌层，但薄而光滑，发酵产物主要为乙醇二氧化碳
3、基它（汉逊氏酵母属，德巴利氏酵母属等）
4、在玫瑰红钠琼脂平板上的形态特征；多为圆形微凸，边缘整齐，表面光滑显润，内层生长为圆形，铁饼形，纺锤形或三角形，有酒香味，它与霉菌极易区别，但若出现粘质如油香味，它与霉菌极易区别，但若出现粘质如油状细菌菌落时，两者较难区别，最可靠鉴别方法是显微镜检查，酵母菌个体比细菌大，绝大多数为出芽繁殖。
第二部微生物限度检查法
1989年下发药品卫生标准补充规定和说明。中国药典1995年收载微生物限度检查法（标准仅为少数剂型）
一、前言及一般规定；
1、主要增修订内容
1）对微生物限度检查的实验环境进行了详细的规定，并指出了环境验证的依据。
2）调整了霉菌的培养温度，修改后温度和无菌检查法中真菌的培养温底一致，均为23~28摄氏度
3）对检验量的规定进行了调整，取消了口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g的规定，明确指出沙门菌检验用量应单独增加为10g或10ml。
2、实验环境
中国药典（2005年版）微生物限度检查法规定："微生物限度检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气中进行
其全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，单向流空气区域、工作台面及环境应定期按（（医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法））的现行国家标准进行洁净度验证。
3、洁净室（无菌室）；
设计要按国安标准-2001（（洁净厂房设计规范））、国家药品监督管理局颁发的（（药品检验所实验室质量管理规范（试行）））中第十八条规定执行。微生物实验室洁净室的施工、安装、验收应按国家行业标准JGJ71-1990（（洁净室的施工及验收规范））执行
4、洁净室（无菌室）的使用管理要做到以下工作：1、要符合规范要求2、建立使用登记制度及使用标准操作规范（SOP）并严格管理。包括温湿度观察要求、消毒要求及其它要求等。1）消毒要求；常用消毒剂，5~20倍稀释的碘伏水溶液，0.1%新洁尔灭溶液，1：50
5、定期进行洁净度再验证定期（每季度、半年、1年）或当洁净室设施发生重大改变时，要按国家标准GB/T16292-16294-1996（（医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的
6、定期更换紫外灯管及净化系统的初中高效头，定期至少每年一次更换紫外灯管，以确保紫外灯管灭菌持续有效。一般每2年1次初中效头。
7、定期监控超净工作台。
2、 1、2菌种处理和微生物鉴别、验证、局部100级控制室（阳性室）
应培备一台净化工作台（最好是生物安全柜）
二、供试液的制备
1、药品微生物检验的特殊性
2、增修订内容
1）明确规定了供试液制备时使用水浴加热的温度和加热时间（温度为不大于45摄氏度。
2）明确规定了供试液从制备完毕到加入培养基的时间应不超过1小时
3）对非水溶性供试品，增订了使用十四烷酸异丙酯溶解供试液方法。
4）删除了2000版收载的所有稀释剂，增订了其他四种，分别为PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液和PH6.8无菌磷酸盐缓冲液以及PH7.6无菌磷酸盐缓冲盐
3、非水溶性供试品制备方法
十四烷酸异丙酯法
适用范围：用于一法不能溶解，可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品
十四烷酸异丙酯的用量同方法验证试验（无菌十四烷酸异丙酯的制备采用薄膜过滤法过滤除菌，选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜，在140度干热灭菌2小时）：无菌十四烷酸异丙酯，将购买的十四烷酸异丙酯用0.22
取供试品10g，加至含20ml 无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45度PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液100ml，振摇5~10min，萃取，静置使油水明显分层，取其水层为1：10的供试液
3、抑菌活性的供试品的拱试液制备方法。
1）、药物的抑（抗）菌作用
2）抑菌性药品检查的理由A、可逆性B、抗菌谱C、细菌的耐药性
3）抑菌药物判定：A、已知B、验证
5）制备方法
A、培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养机中使各单位体积内的供试品含量减少
至不含抑菌作用减少，由于化学抑菌剂的抑菌效果与其浓度呈相关，即浓度越高，抑菌作用越强。常用稀释法中和检品的抑菌性。不同抑菌性的浓度与其抑菌效力间的相关性不同，但对某一特定的抑菌剂来说，这种相关性是恒定不变的，二者呈指数关系，可用下式表示：
Gt=k
式中，C表示抑菌剂的浓度；t 表示杀灭标准试验菌所需要的时间；k是一个常数；浓度指数η，是lgt与lgC做图做得直线的斜率。抑菌剂的η值越高，其抑菌作用越易。通过稀释而被中和掉，抑菌剂的η值越低则越难通过稀释法来中和消除其抑菌力。
本法适用抑菌作用不强的各类中西药制剂。
方法：取同稀释级的供试液2ml，每1ml等量分注5个平皿，倾注培养基混匀，培养计数，分别计算5个平皿的平均菌落数，计算每1ml供试品的平均菌落数，按计数规则报告菌数。
B、离心沉淀集菌法
1 ）原理；利用质量和比量的不同
2）溶液剂及可溶于水的固体供试品：3000转/分离心20分，弃上留底液2ml。
3）难容于水的固体供试品：500转/分离心5分，弃上留底。
6）抑菌作用弱的固体供试品；也可一次低速离心取上层液直接入培养基
c 中和法（灭活法）
介绍几种常见抑菌药物的中和灭活方法
①磺胺类药物：
于供试液中加入适量的对氨基苯甲酸，以保护菌体内二氢叶酸合成酶受磺胺的
作用，继续合成二氢叶酸、核酸等必需物质，使待检细菌生长繁殖而得以检出
例1：单一成分磺胺制剂（磺胺嘧啶片等）：加1%对氨基苯甲酸
具体方法：按常规制备供试液，静置5min，取上层液10ml加入含1%对氨基苯甲酸0.5ml的100ml胆眼盐乳糖增菌培养基中，就能正常的检出大肠埃希氏杆菌
例2：复方磺胺制剂（SMZ等）：加1%对氨基苯甲酸及联合其他方法
具体方法：按常规方法制备1：10供试液，静置5min ，取上层液10ml置薄膜过滤器中减压过滤，以50ml灭菌胜利盐水冲洗滤膜三次，将滤膜置含有1%对氨基苯甲酸2ml的100ml增菌培养基中，可有效的检出大肠埃希氏杆菌
②含重金属药物制剂：
重金属离子可使细菌体内许多含巯基活性基团的酶失去活性，从而生长繁殖受到抑制，但在培养基中加入巯基化合物，如硫乙醇酸盐半胱氨酸，则可与重金属离子络合而失去其抑菌作用，从而保护了菌体内喊巯基活性基团的酶类，使抑菌得以生长繁殖而被检出
例：含重金属离子（如汞）的药物：一般是按常法制备供试液，吸取10ml供试液，加入100ml硫乙醇酸钠——半胱氨酸培养基内（培养基28），依法培养检查即可
②洗必泰制剂：
洗必泰有较强的脂溶性，当遇到聚山梨醇80时，往往被表面活性剂的胶团吸引而被包围，从而降低其抑菌效力
本法适用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴灵栓及其类似药物的检验。
D 薄膜过滤法
E 其他方法（吸附法、沉降法等）
三、细、霉菌及酵母菌计数
1、增修订内容
①增订方法的验证
②计数方法：修订平皿法、增订薄膜过滤法
2、平皿法的特殊性
①受特定培养基和培养条件限制
②有繁殖能力的菌细胞才能认定“活菌”
③325sop
该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（嗜中温，需氧和兼性厌氧
菌），霉菌。酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、PH等有特殊要求的细菌。
3、平皿菌落计数法增修订内容
1）规定在必要时可延长培养时间至5~7天，指出了营养琼脂培养基和玫瑰红钠培养基上生长霉菌和细菌的处理方法
2）明确规定了计数用培养基的计数范围
3）规定若某稀释级的平板菌落数不低于15时，该稀释级两个平板的菌落数不应相差1倍或以上
4）对有两个稀释级的平均平板菌落数在规定范围内的比值判断限度进行了修订，增加了当两者的比值大于5时，实验结果不可信，应重新进行验证实验
5）对个稀释级平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级平皿有菌落生长，但平均菌落数小于1时，修改了最终的菌数报告规则，修改后以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数
4、薄膜过滤法——首次在菌数计数中收载的方法
原理：利用微孔滤膜阻截细菌
1）应用范围：菌落计数（包括纯水及注射用水）、无菌检查及抑菌性供试液处理等2）滤膜选择：根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质，如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜，滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌，使用时保证滤膜的完整性，水溶性供试品先用少量冲洗液湿润滤膜，油类供试品滤膜和滤器在使用前应充分干燥，过滤时保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面，每张滤膜每次冲洗量为100ml
3）冲洗量及方法：同验证
4）孔径不大于0.45μm,直径不大于50μm(采用水流量法,气泡点法或细菌过滤法) 5）滤膜的材料及适用范围：
亲水性与疏水性滤膜之分，硝酸纤维素膜用于水溶性的、油性及低浓度乙醇的过滤，醋酸纤维素膜用于浓乙醇液的过滤，混合纤维素（国产）多为酯酸纤维和硝酸纤维制成，适用于药品的水溶液在PH值3~9范围内，适用后较好，PH>10,则膜易水解破裂,对含10%~20%乙醇、2%苯甲醇、50%甘油、30%~50%丙二醇等供试品使用无影响，不适用于酮类、酯类、强酸、强碱及含50%以上的乙醇、聚乙二醇、丙二醇的供试品，也不适用于2%以上的聚山梨醇这些情况下，需要尼龙膜、聚四氟乙烯膜或其他适宜的膜
6）计数范围：每片小于100CFU
7）操作方法：
8）报告规则
四、控制菌检查
1、增修订内容
1）增加了控制菌检查的方法验证（包括验证菌株方法及判断原理）
2）在验证基础上仍保留阳性对照
3）增订了大肠菌群及梭菌检查法（采用含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基进行培养并采用过氧化氢酶试验排除其他芽孢杆菌的干扰）
4）修订了其他检查法：
大肠杆菌取消生化反应，仅规定在确证大肠杆菌时可采用适宜的生化反应，沙门菌供试量增加为10g或10 ml，供试液制备方法修改为在200ml营养肉汤中制备，删除所有生化反应；
铜绿甲单胞菌检查仅保留氧化酶和绿脓菌素实验，取消其他生化反应2、大肠埃希菌检查
1）检查原理：
利用目标菌限定作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应，作为指示系统来鉴定目标
2）MUG、靛基结合原因：提高检出率
3）检验程序：（手写）
4）注意事项：
1）配MUG时，务必校正PH 值，灭菌后PH 不得过7.4,否则PH值偏高,MUG 也易分解,本身显荧光
2）培养时间一般5h及24h,如果荧光弱可延长至48h
3）MUG法不必从混合菌中分离单个菌落,除大肠埃希菌外,还有部分志贺氏菌属,沙门菌数的菌株,积极少数G+球菌,杆菌,芽孢菌,其MUG也为阳性,因此在MUG培养基中增加了去氧胆酸钠的量,可排除G+的干扰,至于志贺菌,沙门菌在BL液中很难生长,即使有生长,本法能检出,也判为不合格
3、大肠菌群检查
是指37度生长时能发酵乳糖，24h内产酸、产气的G-无芽孢杆菌，它包括了正常人畜肠道内的全部需氧的G-杆菌，
1)检查意义：方法更简便，范围更广，检出率更高
2）检查方法：
一、大肠菌群平板分离法，用琼脂平板分离，挑取菌落
复发酵试验，确定供试品是否染有大肠菌群，这是
定性检查
二、大肠菌群MPN测定法（多管发酵法），对发酵管\
乳糖复发酵，确定污染程度，这是定量检查法；
三、大肠菌群薄膜过滤法
3）操作步骤：（手写）
微生物限度检查方法及其验证报告(修改)
文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告
目录1 样品相关信息 1.1 基本信息 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的 4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备 5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证 5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论 6 供试品微生物限度检查结果
1 样品相关信息 1.1 基本信息（三批） 2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基
2.2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种
3 试验环境 《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。 本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室 无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台 超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 超净工作台沉降菌检测记录 2015.11.15 3.3生物安全柜 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 2015.11.15 4 试验方案 按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)
微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将
无菌检验室、微生物限度检验室、阳性对照室验证方案
无菌检验室微生物限度检验室 阳性对照检验室黑曲霉对照检验室 验证方案 上善医疗器械 2011年月 目录 １.验证的目的 ２.验证小组成员 ３.验证小组分工 ４.验证依据 ５.标准容 ６.检验室的自净器和超净台安装确认 7.自净器和超净台的运行确认 8.洁净度的测定 9.验证结果及评价： 10.责任 1．验证的目的 1.1检查并确认检验室的自净器和超净台的安装符合设计要求。 1.2检测并确认检验室的自净器和超净台的运行性能应能达到检验要求及验证标准。 1.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。
3验证小组分工： 3.1组长：负责审核验证方案是否可行。 3.2副组长：负责组织实施验证、审核测试结果、评价及结论，负责验证报告的会签与批准。 3.3组员：负责无菌检验室、微生物检验室、阳性对照检验室、黑曲霉对照检验室的验证过程；提供监测结果。 3.4组员：负责无菌室正常管理。 4.验证依据： GB—T16294—1996 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法 YY0033-2000 无菌医疗器具生产管理规 6．检验室的自净器和超净台安装确认 6.1部件安装确认
6.2高效过滤器的检漏测试 采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试，采样头离过滤器距离约2cm，沿过滤器出风侧及边框来回扫描。 检漏测试结果记录在自净器和超净台运行确认记录上。 7．自净器和超净台的运行确认 7.1风速测定 采用风速仪贴近高效过滤器出风口测定，一般测定4个点，求出平均风速。 超净台测定8个点，求平均风速。 7.2压差测定 采用微压表测定 7.3温度、相对湿度测定 采用温湿度记录仪测定 7.4结果记录如下：
微生物限度检查记录 版
表：微生物限度检查记录（通用） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）
微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：） 三、控制菌检查（30-35℃）
表： 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
表： （含药材原粉的片剂） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、麦康凯液体培养基（配制批号： ）麦康凯琼脂培养基（配制批号： ） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号： ）、三糖铁琼脂（配制批号： ） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号： ），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号： ）
表：微生物限度检查记录（蛇胆川贝液） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）
微生物限度检查办法验证方法
精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4
4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝ 结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试 菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：
微生物限度检查室沉降菌检查标准操作程序
微生物限度检查室沉降菌检查标准操作程序 一、目的：为规定微生物限度检查室沉降菌测试方法和要求，特制定本操作规程。 二、适用范围：适用于公司微生物限度检查室沉降菌测试。 三、责任者：质量监督员、质量检验人员。 四、正文： 2 仪器和设备： a、高压消毒锅 b、恒温培养箱 c、培养皿（φ90mm×15mm） d、培养基（营养琼脂培养基） 3 测试方法： 3.1 将已制备好的培养皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露 0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。 3.2 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中 30~35℃培养 48h。 3.3 每批培养基可选定 3 只培养皿作对照试验，检验培养基本身是否污 染。 3.4 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用 5~10 放大镜 检查，有否遗漏，若培养皿上有 2 个或 2 个以上的菌落重叠，可分 辨时，仍以 2 个或 2 个以上菌落计数。 3.5 注意事项： 3.5.1 测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。 3.5.2 采取一切措施防止人为对样品的污染。 3.5.3 对培养基培养条件及其他参数作详细的记录。 3.5.4 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的 应剔除。 4测试规则： 4.1 测试状态： 4.1.1 沉降菌测试前，微生物限度检查室的温湿度须达到规定的要求；换
气次数，空气流速必须控制在规定值内。 4.1.2 测试前，微生物限度检查室应已经消毒过。 4.1.3 测试状态为静态测试，并在报告中注明测试状态。 4.2 测试人员： 4.2.1 测试人员必须穿戴符合洁净室级别的工作服。 4.2.2 静态测试时，室内测试人员不得多于二人。 4.3 测试时间：对单向流，如 100 级净化工作台，测试应在净化空调系 统正常运行不少于10min 后开始。 采样点布置见“质检微生物限度检查室悬浮粒子测试操作规程”。 4.4.1 采样点的布置： 采样点的位置可以同悬浮粒子测试点。 4.4.1.1 工作区采样点的位置离地 0.8m~1.5m 左右（略高于工作面）。 4.4.1.2 可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。 4.5 记录： 测试报告中应记录房间温度、相对湿度及测试状态。 4.6 结果计算： 4.6.1 用计算方法得出各个培养皿的菌落数。 4.6.2 平均菌落数的计算 平均菌落数M= M1+M2+ +Mn N 式中：M：平均菌落数； M1：1 号培养皿菌落数； M2：2 号培养皿菌落数； Mn：n 号培养皿菌落数； N：培养皿总数 5 结果评定： 用平均菌落数判断微生物限度检查空气中的微生物。 5.1 微生物限度检查室内的菌落数必须低于所选定的评定标准。 5.2 若某区域的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域进行消毒，然后采样两次，测试结果均须合格。
制药企业微生物限度控制菌检查培养基适用性检查记录表式样
控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备（需要的菌种在□内划“√”）： □（1）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（2）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（3）乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（4）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（5）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基（细菌类别计数选用该培养基）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃～28℃。细菌类别培养3天，霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果：需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌。 检验标准：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 结论： □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论： □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌。 检验标准：试验菌应不得生长。 结论： □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准：被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论： 结论： 检验人：复核人：
微生物限度检查法应用指导原则
微生物限度检查法应用指导原则 为更好应用微生物限度检查法（附录ⅪJ），特制定本指导原则。 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。 2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 3. 微生物限度检查法（附录ⅪJ）收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试液，规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收，易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适应性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。 5. 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1：10-3。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎 好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制 说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭 菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照 相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、
无菌检查室微生物限度检查室的管理规定
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1. 明确无菌检查室、微生物限度检查室的要求和规定，确保检验结果的准确性。 2.范围： 适用于本厂质监科无菌检查室、微生物限度检查室的操作。 3.责任： 质监科化验室有关人员。 4.内容：
4.1本厂无菌检查室为1万级、局部（净化操作台）100级的洁净室；微生物限度检查室为1 万级的洁净室。 4.2室内严禁放置杂物，无关人员严禁入内。 4.3室内应保持整洁，定期用甲醛熏蒸消毒（每月一次）；使用前用0.1%新洁尔灭溶液擦拭消 毒净化工作台。 4.4在操作前，对菌检室、缓冲间及净化工作台进行紫外线消毒30分钟，并打 开净化工作台的层流净化装置。操作完毕及时清理，擦净台面,再开紫外灯 照射30分钟。 4.5化验员进入无菌室，必须按规定程序进行更衣、戴帽、换鞋等；操作前用0.1%新洁尔灭或 75%酒精进行手消毒。 4.6吸取菌液时，切勿直接用口接触吸管。吸完菌液的吸管放入5%石炭酸消毒液中。 4.7接种针在每次使用前后，必须通过火焰烧红灭菌，冷却后方可接种培养物。 4.8所有带菌的实验用品，须经有效的消毒灭菌方法处理后，再洗刷，严禁污染下水道。 第2页/共2页 4.9如有菌液污染桌面或地面，应立即用消毒水彻底消毒后，再作处理。
4.10无菌室每月检查杂菌数（在室内打开营养琼脂培养皿30分钟，经37℃培养48小时），10000 级平均菌数不得过3个/皿，100级平均菌落数不得过 1个/皿，如超过应进行清洁消毒。 4.11无菌检查室和微生物限度检查室的清洁卫生均按“1万级洁净区的清洁卫生操作规程”进 行。 欢迎下载阅读！
无菌检查和微生物限度检查操作规范
无菌检查和微生物限度检查操作规范 （中国药品生物制品检定所） 一、无菌室的要求： 无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。 无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。 无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。 无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。 用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。 二、培养基的准备 1、培养基的制备： 配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。 2、培养基灵敏度试验： 培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。 培养基灵敏度试验操作如下：取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液，分别10倍递增稀释，制成每ml 含10-100个菌，并作菌落记数。将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。至规定温度培养5天，每株菌接种的培养基不少于2管生长，则改培养基的灵敏度试验合格。 3、培养基用前的检查： （1）无菌检查：各种培养基在规定温度培养3天，应无菌生长。 （2）新鲜程度检查：需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5，否则，不能使用。应煮沸去氧，只限加热一次。 4、培养基的保存时限： 配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。 三、菌种复苏和保藏 1、菌种复苏： 先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕，在刻痕处过火焰数次，用无菌湿棉球炸裂后打开，然后，加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部，将菌种稀释、混匀，并吸出菌液，接种于适宜的培养基。培养时间和温度根据不同的菌种而定。仔细检查菌种的有关特性，如无发现异常，即可传代、使用。 2、药品微生物用的菌种传代方法： 取复苏好的菌种一支，接种于规定的培养基数管，培养后，置冰箱中保藏。取出使用的菌种，经一段时间后即可废弃。 为防止微生物突变，菌种应尽量避免不必要的接种和传代。
微生物限度检查室管理规程 (2)
目的:规范微生物实验室管理,确保微生物检验结果的准确性。 范围:适用于微生物实验室。 职责:微生物检测人员及检验室负责人对此规程执行负责。 内容: 1.微生物实验室包括微生物限度检查室、阳性菌接种室及抗生素微生物检定室。１、1 微生物实验室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮,地面应光滑,并应有缓冲间,设双层传递窗传递物件。 1、2 室内温度1８～26℃,相对湿度为45～65%,室内必须保持整洁。 2、微生物实验室洁净度要求: 2、1微生物实验室洁净度应符合相应的医药洁净室设计规范与验收要求。 2、1、1 操作室洁净度应符合洁净度C级要求。 2、1、2 操作台洁净度应符合洁净度A级要求。 3.微生物实验室的使用: 3.１微生物实验室由微生物检验员管理及使用,其她人员须经主管人员批准后方可进入与使用。 3、2 微生物实验室的人员需经过相关的岗位培训,必要时定期进行再培训。 ３、３微生物实验室操作人员应严格遵守洁净工作区域净化控制规定。 3.3、1 保持个人卫生,不得佩带饰物,不得涂抹化妆品。 3、3、2 室内应穿戴专用衣帽、口罩及鞋子。 3、3、3 手部应进行２次消毒,宜带无菌手套。 3、3.4 在操作中,操作台面应垫上消毒布巾,以防操作中有滴落液污染台面。３、3、5 人员进入微生物限度检查室、阳性对照室或抗生素微生物检定室前,在一更脱外衣、换鞋后,进入一更缓冲间洗手,并消毒后,进入二更自上而下依次换上洁净帽、口罩、洁净服、洁净鞋后,进入二更缓冲间,手经再次用消毒液消毒后方可进入微生物限度检查室或阳性对照室,实验操作前须带上无菌手套。 ３、４微生物实验室使用前应确保操作室的洁净程度。 3、4.１微生物实验室的清洁分为一般清洁及彻底清洁,其具体的清洁部位、方式方法、频率见下表所示:
2010年版药典微生物限度检查法
附录Ⅺ J 微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品 方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。 方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅩⅢB 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。 (2)膜剂供试品 取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1∶10的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml，置
微生物限度检查操作流程
微生物限度检查工作流程 实验前： 1.对实验器皿的准备：对玻璃器皿进行清洗，将洗净干燥的平皿、乳钵、刻度吸管等用牛皮纸包裹，放入鼓风干燥箱中于160℃干热灭菌2小时或放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。 2.对实验用培养基及稀释液的准备：按规定比例配制实验所需的各种培养基及稀释液，包好，放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。 3.洁净服的准备：将当天实验所用洁净服放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。 实验中： 1.将实验所需器皿、培养基、洁净服、样品、稀释液放入相应的传递窗中，打开紫外灯，照射30分钟。 2.打开洁净室的通风设备1小时以上，观察洁净室各个规定区域的压差是否符合相应规定范围，若不符合，则因通知设备部门及时进行调整。 3.进入洁净室，换上工作鞋，用洗手液洗手，烘干，换上洁净服，戴上口罩、手套，并与喷手器下用75%乙醇或0.1%新洁尔灭对双手进行消毒。 4.进入万级洁净走廊，观察各个规定房间的温度、湿度、压差是否符合规定，并与传递窗中将经紫外灯照射后的样品、器皿稀释液及培养基，放入相应的实验室（如微生物限度检查室或无菌检查室）。并将培养基的温度控制在45℃以下（若培养基出现凝固现象时，因微波炉加热融化；若温度太高时，则因用纯化水降温至不烫手背宜。 5.打开超净工作台的紫外灯，照射30分钟，然后再打开超净工作台的通风设备。用75%乙醇或0.1%新洁尔灭对实验所用工作台面进行擦拭消毒（消毒时应遵循由里到外，由上到下，由洁净要求高到洁净要求低的原则）。 6.按照适宜的次序于超净工作台内摆放好稀释液、天平、消毒液、集菌仪、剪刀、镊子等物品，用75%酒精棉球进行消毒，将样品内包装表面用碘酒棉球以及75%酒精棉球依次进行消毒。将营养琼脂平板与超净工作台的做、中、右各置一个（平板需经下预培养48小时且无菌生长），开盖暴露30min，测定的沉降菌每平板不得超过1cfu，则符合百级超净工作台的沉降菌标准（注：在洁净工作台进行操作时，为防止污染，应用酒精棉球对双手反复消毒）。 7.样品处理（以采用离心薄膜过滤法为例）：用天平称取规定量的样品，置于乳钵中，碾碎，少量几次加入规定量（用灭好菌的两头高量取）的稀释液，研磨均匀，以制备供试液。8.细菌的检查：用灭菌吸管吸取规定量的供试液于离心管中，500转/秒，离心3分钟。离心后用注射器吸取规定量的上清液于集菌仪中（集菌仪中的滤膜应事先用少量的蛋白胨溶液进行润洗），再用规定量的蛋白胨溶液进行反复冲洗（每次冲洗量不得超过100ml，每张滤膜的总的冲洗量不得超过1000ml，且冲洗过程中应该保持滤膜的完整性）。并用等量的蛋白胨溶液制备阴性对照的滤膜。 8.打开集菌仪，用镊子夹取滤膜于在30~35℃预培养48小时且无菌生长的营养琼脂平板上，切忌滤膜与琼脂间有气泡。并且制备2个只加入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂的平板作空白对照。 9.霉菌及酵母菌的检查:取相应稀释级的供试液1ml，加入五个无菌平板中，每个0.2ml，注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀。
微生物限度检查法验证方案模板
文件编号：SVP YF-0-01-00
验证文件
******微生物限度 检查法验证方案
********有限责任公司
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验 证 文 件
目 录
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适用范围 目的 概述 验证所需要的仪器设备及文件 可接受的限度范围标准 测试方法 异常情况处理 测试结果 结论
10 再验证周期 11 附表
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验 证 文 件
1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。 2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的 完整性，保证检验结果的可靠性。 3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。 3.2 验证时间：************批平行三次试验。 4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备 器具名称 电热恒温培养箱 多用生化培养箱 蒸汽灭菌器 规格型号 HG101-3 SP-80 ZDX-35B 检定日期 检定单位 有效期
4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称 《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准 项目 细菌总数 霉菌、酵母菌 标准规定 ≤1000 个/g ≤100 个/g 存放地点
微生物限度检查室管理规程
目的：规范微生物实验室管理，确保微生物检验结果的准确性。 范围：适用于微生物实验室。 职责：微生物检测人员及检验室负责人对此规程执行负责。 内容： 1.微生物实验室包括微生物限度检查室、阳性菌接种室及抗生素微生物检定室。 微生物实验室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮，地面应光滑，并应有缓冲间，设双层传递窗传递物件。 室内温度18～26℃，相对湿度为45～65%，室内必须保持整洁。 2.微生物实验室洁净度要求： 微生物实验室洁净度应符合相应的医药洁净室设计规范和验收要求。 操作室洁净度应符合洁净度C级要求。 操作台洁净度应符合洁净度A级要求。 3.微生物实验室的使用： 微生物实验室由微生物检验员管理及使用,其他人员须经主管人员批准后方可进入和使用。 微生物实验室的人员需经过相关的岗位培训，必要时定期进行再培训。 微生物实验室操作人员应严格遵守洁净工作区域净化控制规定。 保持个人卫生，不得佩带饰物，不得涂抹化妆品。 室内应穿戴专用衣帽、口罩及鞋子。 手部应进行2次消毒，宜带无菌手套。 在操作中，操作台面应垫上消毒布巾，以防操作中有滴落液污染台面。 人员进入微生物限度检查室、阳性对照室或抗生素微生物检定室前，在一更脱外衣、换鞋后，进入一更缓冲间洗手，并消毒后，进入二更自上而下依次换上洁净帽、口罩、洁净服、洁净鞋后，进入二更缓冲间，手经再次用消毒液消毒后方可进入微生物限度检查室或阳性对照室，实验操作前须带上无菌手套。 微生物实验室使用前应确保操作室的洁净程度。 微生物实验室的清洁分为一般清洁及彻底清洁，其具体的清洁部位、方式方法、
频率见下表所示： 微生物实验室常用消毒剂及其配制 使用前30分钟应先开启操作台及操作室的净化和消毒系统，关闭消毒系统后10～15分钟再进入操作室；操作结束后，开启消毒系统30分钟后再关闭消毒系统和净化系统。 试验开始前应做好相关试验的准备工作，确保在试验过程中不离开操作室。 进入操作室的任何东西外包装均需消毒处理。 物料进入微生物实验室以前，脱去外包装或者用酒精棉球擦拭后，放置于传递窗中。
微生物限度检查办法验证方法
微生物限度检查方法验证方案 1. 目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件： 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭 菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法， 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3
微生物限度检查室管理规程
目得：规范微生物实验室管理,确保微生物检验结果得准确性。 范围:适用于微生物实验室. 职责：微生物检测人员及检验室负责人对此规程执行负责. 内容: 1.微生物实验室包括微生物限度检查室、阳性菌接种室及抗生素微生物检定室. 1、１微生物实验室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮,地面应光滑,并应有缓冲间，设双层传递窗传递物件。 1、２室内温度1８~2６℃,相对湿度为４5~6５%,室内必须保持整洁。 2、微生物实验室洁净度要求: 2、１微生物实验室洁净度应符合相应得医药洁净室设计规范与验收要求。 2、1、1 操作室洁净度应符合洁净度C级要求。 2、１、2 操作台洁净度应符合洁净度A级要求. 3.微生物实验室得使用: ３、1 微生物实验室由微生物检验员管理及使用，其她人员须经主管人员批准后方可进入与使用。 ３、2 微生物实验室得人员需经过相关得岗位培训,必要时定期进行再培训. 3、３微生物实验室操作人员应严格遵守洁净工作区域净化控制规定. 3、3、1 保持个人卫生，不得佩带饰物,不得涂抹化妆品。 3、３、2 室内应穿戴专用衣帽、口罩及鞋子. 3、3、3 手部应进行2次消毒,宜带无菌手套。 3、3、４在操作中，操作台面应垫上消毒布巾，以防操作中有滴落液污染台面. 3、3、５人员进入微生物限度检查室、阳性对照室或抗生素微生物检定室前,在一更脱外衣、换鞋后，进入一更缓冲间洗手，并消毒后，进入二更自上而下依次换上洁净帽、口罩、洁净服、洁净鞋后，进入二更缓冲间,手经再次用消毒液消毒后方可进入微生物限度检查室或阳性对照室,实验操作前须带上无菌手套。 ３、4 微生物实验室使用前应确保操作室得洁净程度。 3、4、1 微生物实验室得清洁分为一般清洁及彻底清洁，其具体得清洁部位、方式方法、频率见下表所示：
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证的方案.doc
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表