原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫

原代细胞培养之--培养技术

原代细胞的培养方法

原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。

1、组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下：

(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。

(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

原代细胞培养－2

2.消化培养法

该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。

某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。

3.悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

4.器官培养

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的

生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。

1. 器官培养的特殊的要求

(1)需要特殊的培养条件因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm。

(2)器官内部细胞需要有足够的氧气渗入常采用以下两种方法：

①将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。

提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5% CO2，以维持pH。

2. 器官培养的方法

(1)将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。

(2)将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。

(3)将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2，如为肝、肾不能大于1mm2。

(4)将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%，培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。

(5)上述器官培养1~3周（每隔2~3天换液一次）后可用于实验和检测。

原代细胞的培养与维持

(一)原代细胞培养

1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)

凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%，有条件的应在37℃ 5% CO2的培养箱中培养，在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果（如空斑）更加明显、准确，待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，即倒去旧液，换入新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。

若用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，可有少量的肌样纤维间质细胞或基质细胞开始贴壁生长，为了利于该贴壁细胞充分贴壁和生长，此时换液应将细胞悬液经低速离心后，按半量换液方式弃去旧液加入新液，然后再将细胞悬液放入原瓶中继续培养，经反复几次换液后，贴壁肌样细胞逐渐形成网状，此时换液可将原悬浮细胞和培养基移入另一新瓶，然后分别补加新鲜培养基(也按半量换液方式分别对半加入新液)继续培养，原瓶的贴壁细胞逐渐长成单层，而新瓶中又会出现二次贴壁细胞，经几次换液也会逐渐长成单层，在此类细胞培养时，培养基中往往需加入少量的维生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（浓度要在20%以上），以利细胞贴壁生长。

2、悬浮细胞的培养

凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。若作用于试验的短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行培养，细胞浓度可在5～8×109/L范围内，然后进行分瓶试验。若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢

失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。但千万不能急于传代，一定要待细胞密度较高时才能进行，以防传代失败。

(二)原代细胞的维持

1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）

贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。

2、悬浮细胞

凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。半量换液的方法如下：

将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min 10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。