吡格列酮对非肥胖糖尿病小鼠脾细胞分化的调节机制

中国肥胖及2 型糖尿病外科治疗指南(2019 版)

中国肥胖及2型糖尿病外科治疗指南 （2019版） 郴州市第一人民胃肠外科 汇报人：赵玉国

c o n t e n t s 目录手术适应证及禁忌证 手术方式的选择 术后随访监测术后并发症及处理 围手术期管理

PART 01手术适应证及禁忌证

BMI BMI≥37.5，建议积极手术； 32.5≤BMI＜37.5，推荐手术； 27.5≤BMI ＜32.5，经改变生活方式和内科治疗难以控制，且至少符合2项代谢综合征组分，或存在合并症，综合评估后可考虑手术。 腰围 男性腰围≥90cm 、女性腰围≥85cm ，参考影像学检查提示中心型肥胖，经多学科综合治疗协作组（MDT ）广泛征询意见后可酌情提高手术推荐等级 年龄 Surgical indications and contraindication 建议手术年龄为16～65岁。 单纯肥胖病人手术适应证

1 2 3 4 对于年龄<16岁的病人，须经营养科及发育儿科等MDT 讨论，综合评估可行性及风险，充分告知及知情同意后谨慎开展，不建议广泛推广； 对于年龄>65岁病人应积极考虑其健康状况、合并疾病及治疗情况，行MDT 讨论，充分评估心肺功能及手术耐受能力，知情同意后谨慎实施手术。 T2DM 病人仍存有一定的胰岛素分泌功能。 BMI≥32.5，建议积极手术；27.5≤BMI ＜32.5，推荐手术；25≤BMI＜27.5，经改变生活方式和药物治疗难以控制血糖，且至少符合2项代谢综合征组分，或存在合并症，慎重开展手术。 对于25≤BMI＜27.5的病人，男性腰围≥90cm 、女性腰围≥85cm 及参考影像学检查提示中心型肥胖，经MDT 广泛征询意见后可酌情提高手术推荐等级。 建议手术年龄为 16～65 岁。 T2DM 病人手术适应证 Surgical indications and contraindication

小鼠脾细胞培养实验

山东大学实验报告2011年3月30日 姓名张行润系年级 2009级生科4班学号同组者张少华 科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105 一、实验目的 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。 二、实验原理 (一)细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二)细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。 三、实验器材

细胞生物学实验三 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数(山东大学)

实验三小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-04-06 同组者：吕赞洪俊蔡正琦 一、实验目的 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养。 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用。 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法。 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数。 二、实验原理 1.细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下，把动植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 2.细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存以下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作 用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触

糖尿病动物模型简介

糖尿病动物模型 转载请注明来自丁香园 发布日期: 2006-07-10 19:22 文章来源: 丁香园 关键词: 糖尿病糖尿病动物模型 2.7 db/db小鼠 db/db小鼠糖尿病发病系瘦素受体突变所致，呈常染色体隐性遗传。该鼠在10～14日龄时就出现多食、高胰岛素血症，但4周龄时血糖仍维持正常，随后该鼠体重逐渐增加，出现高血糖。2～3月龄时尽管胰岛素水平为正常时的6～10倍，但血糖水平可达22～33mmol/L；约3～6月龄时胰岛素水平逐渐下降至低于正常水平，该期小鼠体重明显下降，并出现酮症，组织学显示显著的β细胞坏死，如缺乏胰岛素治疗，该小鼠存活不超过10月。db/db小鼠另一个特点为：其血清胰高糖素的水平较正常对照升高2倍以上[22.23]。db/db小鼠是适用于研究2型糖尿病发病机制的动物模型。 2.8 ob/ob小鼠 ob/ob小鼠为2型糖尿病动物模型,属常染色体隐性遗传。ob/ob小鼠糖尿病发病是由于ob基因突变，造成其编码的蛋白leptin缺乏,引起肝脂肪生成和肝糖原异生显著增加，高血糖又刺激胰岛素分泌，引起胰岛素抵抗，刺激脂肪的形成，ob/ob小鼠体重可达90克之多。ob/ob小鼠症状的轻重取决于遗传背景，纯合体动物表现为肥胖，明显的高血糖及高胰岛素血症，而ob/ob/6J小鼠胰岛素水平可达正常小鼠的10～50倍，但其血糖常只有轻度的升高。组织学显示ob/ob小鼠胰岛β细胞显著增生、肥大，而胰岛A细胞、D细胞及PP细胞数量明显减少[24.25]。 2.9 KK鼠 KK小鼠是日本学者培育的一种轻度肥胖型2型糖尿病动物，后与C57BL/6J小鼠杂交，并进行近亲繁殖，得到Toronto－KK（T－KK）小鼠。将黄色肥胖基因(即Ay)转至KK小鼠，得KKAy鼠，与KK小鼠相比，KKAy鼠有明显的肥胖和糖尿病症状。KK小鼠有明显的多食，从5周龄起,血糖、血胰岛素水平逐步升高，至5月龄时体重可达50克，非空腹血糖常低于17mmol/L，非空腹血胰岛素可达1200ug/mL，1岁龄时，多食、高血糖、高胰岛素血症、肥胖及肝脏对胰岛素的敏感性可自发恢复正常，但糖尿病KK小鼠生命常明显缩短。此外，KK小鼠空腹胰高糖素水平升高，且不受葡萄糖抑制。组织学显示B细胞有脱颗粒和糖原浸润,随后出现胰岛肥大和肝脂肪化和脂肪组织增多[26.27]。 【其他DM动物模型】 1.激素性DM动物模型：注射垂体前叶提取物、生长素、肾上腺皮质激素、甲状腺素或胰高血糖素均可直接或间接产生DM。 2.病毒性DM动物模型：利用脑-心肌炎病毒（EMC－M病毒）和柯萨基病毒等使某些种属的小鼠胰岛β细胞脱颗粒、坏死，导致胰岛β细胞破坏，产生类似的1型DM。 3.免疫性DM动物模型：静脉注射抗胰岛素抗体或用同种或异种胰岛素的弗氏佐剂复合物及抗血清免疫;或用同种或异种胰腺+弗氏佐剂免疫动物均可在数小时后产生一过性高血糖。其机制是内源性胰岛素与输入的抗体结合导致内源性胰岛素降低而致DM。 4.下丘脑性DM动物模型：用电凝法或注射硫代葡萄糖金损伤丘脑下部腹内侧核（VMH）饱中枢，可使成熟动物产生过度摄食、肥胖，直至产生DM。

复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数 实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。 外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各 类免疫细胞。 免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。 红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。 2实验材料： 1）健康小鼠 2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板 3）70汇醇 4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK 5）0.2%台盼蓝 6）细胞计数板、计数器 7）离心机 8）显微镜 3实验方法： 3.1取小鼠脾脏 将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。 用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。 3.2制备单个核细胞悬液

将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用 针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。 弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。3.3 计算细胞浓度 稀释十倍，随机选取一个大方格计数 细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml 3.4 计算细胞活力 在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为： 324- 16/324 X 100%=95.1% 在理论范围之内 4 实验结果 4.1 研磨脾脏得到细胞悬液 本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。 研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。 4.2 白细胞计数

小鼠免疫组织及免疫细胞的观察

小鼠免疫组织及免疫细胞的观察 【实验原理】 免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。 【试剂和器材】 小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛 【操作方法】 1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。 2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。 3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜下观察染色脾细胞。 【结果观察】 小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察 【注意事项】 1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。 2.脾脏分离完整，清研轻柔。 3.染色时间不宜过长或过短。. 【讨论】 脾脏具有多种重要的生理功能, 参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转, 绝非可有可无;脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色,有时甚至完全相反, 即具有双向性、时向性的特点。 1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后 OPSI 的发生率约为 1 %～

2.4 %。虽然 OPSI的发生率不是很高,但脾脏切除后,在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中, 50 %患者的病情迅速进展, 并最终导致死亡。脾脏为全身最大的淋巴器官, 血循环相当丰富, 且脾脏具有延缓微循环的作用, 有利于清除和吞噬多种抗原, 减轻机体感染的发生。同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子, 如 T 细胞、B 细胞、K 细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK 细胞)、树突状细胞。免疫因子包括 tufstin 因子、备解素即P因子、纤维结合蛋白免疫核糖核酸环磷酸鸟苷内源性细胞毒因子、调理素和补体等。而脾切除后,脾脏所产生的免疫因子及免疫细胞消失,血浆中免疫球蛋白IgM、IgG下降,巨噬细胞活性下降,补体旁路活性下降及自身抗体活性增强, 使免疫系统失衡,导致机体易感性增加,甚发生OPSI 。 2.关于tufstin是主要由脾脏产生的促吞噬激素, N ajjar 于 1970 年首先发现。是IgG分子Fc段的一种四肽(T hrLy s -P ro -A rg), 通过激活中性粒细胞发挥吞噬功能。需要在白细胞激肽酶及内羧基肽酶的共同作用下释放。脾切除、镰状红细胞贫血、特发性血小板减少性紫癜、A IDS 及一些腹部疾病可使其水平下降, 脾移植后可使 tufstin 的水平升高。虽然已发现其在免疫系统中的重要作用, 但具体机制仍不十分明了。理论上讲上述情况 tufstin 活性减低的原因包括低γ球蛋白血症、脾脏内中性粒细胞释放减少、白细胞激肽酶活性改变及 tufstin 分子异常。 3.脾脏的抗肿瘤功能机体发生肿瘤的主要原因为免疫系统监控失调, 而脾脏作为人体免疫系统的重要组成部分, 无疑与肿瘤的发生密切相关。临床观察发现, 脾脏不仅自身很少发生原发恶性肿瘤且少有转移瘤出现, 这也表明脾脏具有抗肿瘤的作用。目前大家较公认的观点为脾脏在肿瘤免疫中具有双向性、时向性的特点。表现为在肿瘤早期脾脏具有抗肿瘤作用, 而在晚期则表现为免疫抑制, 促进肿瘤生长。其抗肿瘤作用主要表现在:①可增强巨噬细胞的吞噬功能。②可增强巨噬细胞溶解瘤细胞及其过氧化酶作用。③通过增强 NK 细胞活性发挥抗肿瘤作用。④Chu 认为, tufstin 的抗肿瘤机制不仅通过增加巨噬细胞的肿瘤趋向性、吞噬能力和分泌能力, 更重要的是增加巨噬细胞产生氧自由基—超氧阴离子的能力, 对杀伤肿瘤细胞具有重要意义。关于脾脏边缘带淋巴瘤的研究表明, 肿瘤的发生也与脾脏免疫功能的下降有关。

中国肥胖及2型糖尿病外科治疗指南(2019版)

中国肥胖及2型糖尿病外科治疗指南(2019版) 中国医师协会外科医师分会肥胖和糖尿病外科医师委员会 (Chinese Society for Metabolic & Bariatric Surgery，CSMBS)于2014年组织国内减重代谢外科及内分泌科专家共同制定了我国首个减重代谢外科指南——《中国肥胖和2型糖尿病外科治疗指南(2014)》[1]。在该指南的指导和规范下，尤其在中华医学会外科学分会甲状腺及代谢外科学组成立后，我国的减重代谢外科取到了长足的发展，特别是全国各地区相继建立了临床研究中心，并开展了多中心合作，不断积累详实的多中心临床数据。我国减重代谢手术已经由2014年的4000例增长到1万例以上，术式方面也与欧美等发达国家没有明显差异[2-3]。2017年，美国和欧洲肥胖代谢外科指南进行了相应更新，包括胃束带手术(AGB)等治疗方式基本退出历史舞台[4-5]。鉴于此，中华医学会外科学分会甲状腺及代谢外科学组联合CSMBS组织专家对2014年版指南进行修订和更新，参考西方国家指南及立场声明更新，并采纳我国近5年的临床数据及相关文献，在适应证和禁忌证、手术方式的合理选择、术前评估与准备、术后并发症以及围手术期管理等方面进行阐述说明，以更好地适应减重代谢外科的发展，规范疾病的治疗，共同推进学科健康快速发展。 1 手术适应证及禁忌证 1.1 手术适应证 单纯肥胖病人手术适应证：(1)BMI≥37.5，建议积极手术；32.5≤BMI＜37.5，推荐手术；27.5≤BMI＜32.5，经改变生活方式和内科治疗难以控制，且至少符合2项代谢综合征组分，或存在合并症，综合评估后可考虑手术[6-7]。(2)男性腰围≥90cm、女性腰围≥85cm，参考影像学检查提示中心型肥胖，经多学科综合治疗协作组(MDT)广泛征询意见后可酌情提高手术推荐等级[8]。(3)建议手术年龄为16～65岁。 注：(1)代谢综合征组分(国际糖尿病联盟定义)包括：高三酰甘油(TG，空腹≥ 1.70mmol/L)、低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-ch，男性空腹＜1.03mmol/L，女性空腹＜1.29mmol/L)、高血压(动脉收缩压≥130mmHg或动脉舒张压≥85mmHg， 1mmHg=0.133kPa)。(2)合并症包括糖代谢异常及胰岛素抵抗，阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、内分泌功能异常、高尿酸血症、男性性功能异常、多囊卵巢综合征、变形性关节炎、肾功能异常等，尤其是具有心血管风险因素或2型糖尿病(T2DM)等慢性并发症。(3)对BMI为27.5～＜32.5的病人有一定疗效，但国内外缺少长期疗效的充分证据支持，建议慎重开展。(4)如双能X线吸收法测量Android脂肪含量与腹部脂肪及内脏脂肪分部相关，如Android脂肪含量显著升高提示中心型肥胖。或MRI对腹部内脏脂肪含量进行评估

小鼠糖尿病模型建立的实验设计

发育生物学课程设计 北方民族大学 小鼠糖尿病模型实验设计方案 姓名：徐飞 学号：20103465 生物技术102班

小鼠糖尿病模型实验设计方案 徐飞 （北方民族大学生物科学与技术学院，生物技术，20103465） 【摘要】糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的,近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第三位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病。【关键词】糖尿病；动物模型；实验设计 【Abstract】Diabetes mellitus is a common genetic glucose metabolic and endocrinal disturbance caused by insulindeficiency absolutely or relatively. In the last half century, diabetes has the increasing rates of morbidity and mortality, and has become the third common, frequently occurring and chronic noninfectious disease after cardiovascular disease and cancer. 【key words】Diabetes; Models, animal; Experimental design 引言 糖尿病(diabetesmellitus,DM)属中医学“消渴”范畴,是以多饮、多食、多尿、身体消瘦,或尿浊、尿有甜味为特征的疾病。现代医学认为,糖尿病是一种由多种病因引起的慢性代谢性疾病,是由于体内胰岛素缺乏,或拮抗胰岛素的激素增高,或胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用而引起葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征。为探清糖尿病病因,建立理想的DM动物模型是十分必要的,动物模型也可以筛选降糖药物,可以为中医药治疗糖尿病提供实验依据。 动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（包括新药筛选）研究。人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便，更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。 糖尿病模型的建立方法很多,如手术法、药物法、自发性DM、转基因动物法等。国外多

小鼠脾细胞的体外培养及形态观察

小鼠脾细胞的体外培养及形态观察 黄殿玲,李核,何文琴,李霞,杨佩,王纯 摘要：用组织块法和冷消化法对小鼠脾细胞在含血清培养液中进行原代培养,并对正常细胞形态进行观察。结果表明组织块法和消化法培养可获得比较均一、稳定的细胞群,细胞呈典型的成纤维形态。 关键字：脾细胞原代培养形态 多细胞生物的细胞可以分离出来，在适宜的培养液以及培养箱中存活，并在一定的时间内，保持其形态、生理、生化特性，经过一定时间还可以观察到一定量的细胞。直接从身故体内分离的细胞，如小鼠的脾细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。 在生物体内或体外，正常的细胞只能分裂一定的次数，然后停止分裂，最终死亡。这一过程称为衰老，此为正常的现象。只有细胞被转化后，细胞可以无限增殖，就称为细胞系/株。细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。这就要为细胞的培养创造适宜的环境，使细胞更容易存活或生长。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。 超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。在细胞原代培养的操作过程中，这个设备是必要的，细胞本来就比较易感染，不易存活，在空气中，以及人体表面存在许多易感染细菌，所以为了提高细胞的存活率，一定要保持操作过程干净，无污染。细胞培养是细胞生物学研究的中心技术。通过细胞培养可以观察研究细胞的某些生理特性，同时在体外进行细胞培养，也打破了以往的细胞只能在生物体内增殖、分裂。其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。 1 材料与方法 1.1 实验材料 取出生一周的小鼠，采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。取一只小鼠置于解剖盘中，抓住小鼠的尾巴，确保小鼠的前爪在解剖盘中，慢慢的安抚使小鼠安静下来；用剪刀或手术钳紧紧的按住小鼠的颈的后部，用力向后拉小鼠的尾巴；切记不要

2型糖尿病动物模型研究概况

2型糖尿病动物模型研究概况高秀娟马会霞江春花 (华北煤炭医学院中医学系河北唐山063000) [关键词]2型糖尿病动物模型研究进展 [中图分类号]R25[文献标识码]A [文章编号]1008-6633(2009)06-783-03 糖尿病是一种慢性代谢紊乱疾病,世界范围内约有1.7亿患者,其中2型糖尿病(T2D M)占整体糖尿病的90%以上,可靠的动物模型是研究T2D M发生机制及新的干预措施的重要手段。目前制备T2D M模型应用的动物种类多种多样,动物种属的选择非常重要,其中鼠科动物由于具有体积小,生殖周期短,容易通过饲料、药物处理或遗传方法诱导疾病等优势,被广泛的应用于T2D M模型的制备中,它是人类研究T2D M的强有力的工具。下面就应用鼠科动物制备T2D M模型的研究进展作一综述,仅供参考。 1自发性动物模型 1.1自发性2型糖尿病大鼠主要包括G/K大鼠(Goto-K ak2 izaki R at)、OLETF大鼠(O tsuka Long Evans To kushi ba F atty R at)、Z DF大鼠(Zuke r d i abe ti c fatty R a t)等,这类动物多数肥胖,有明显的高胰岛素血症,类似人类2型糖尿病的发病特征,国外研发口服抗糖尿病及并发症的新药多选用这类动物[1]。 1.1.1G/K大鼠。G/K大鼠是日本的一大鼠品系,是一种常用的自发性非肥胖型T2D M实验动物模型,其特点是高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗出现早[2]。其发病机制可能是骨骼的糖元合成酶不能有效地将多余的葡萄糖转化为糖元贮存起来,从而使动物出现高血糖。G/K大鼠的特征有,葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损,B细胞数目减少,肝脏对胰岛素的敏感程度降低导致肝糖生成过多等,此外具有与人类T2D M微血管并发症相似的改变。骨组织形态学和生物力学分析显示,非肥胖的2型糖尿病G/K大鼠有明显的骨代谢紊乱,骨强度明显降低[3]。近来的研究表明G/K大鼠子一代的胰岛及胰腺血流量的增加有赖于迷走神经[4]。G/K大鼠子一代轻度高血糖、葡萄糖耐受受损伤。在病理性的腹腔葡萄糖耐量出现后一周测其胰岛及整个胰腺的血流量,发现其血流量增加、胰岛所占胰腺血流量增加,切断腹腔双侧迷走神经,胰岛及胰腺血流量降低。 Pa rt haB认为G/K是研究糖尿病最好的动物模型,但是其发病过程中B细胞数目降低后有一个增殖的过程,这与人类发病情况有很大不同,也是限制G/K大鼠应用的关键[5]。 1.1.2OL ETF大鼠。OLETF大鼠是最近常用的T2D M动物模型。其特点是:轻度肥胖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症。史红莉等[6]研究发现14周的OL ETF大鼠已存在胰岛素抵抗,体重和腹内脂肪重量增加,同时存在三酰甘油和胆固醇的增高。大鼠在24周龄时发病率为100%。组织学研究发现此种大鼠胰腺呈进行性纤维化,并可出现肾脏并发症,其与T2D M患者的病理变化极为相似。 1.1.3Z DF大鼠。Z DF肥胖T2D M大鼠是良好的肥胖型T2D M 的动物模型。该动物易发展为肾微血管病变。此种大鼠由于瘦素受体突变导致多食、肥胖,同时伴有高血糖、高胰岛素血症、高脂血症、中度高血压,较接近于人的胰岛素抵抗同时伴有高血压的患者,可作为胰岛素抵抗的动物模型。一般8~10周出现糖尿病,有糖尿病的典型症状如多饮、多尿、体重增加缓慢等,并可出现神经病变[7]。对fa/fa ZDF的胰岛分离,测其磷酸肌酐(P I)水解及胰岛素分泌反应,结果磷酸脂酶C调节的胰岛P I水解和高血糖刺激的胰岛素释放增加,这二者的增加能先于糖尿病被检测出来。因此P I水解的变化可能是Z DF大鼠胰岛素抵抗的原因[8]。 1.1.4肥胖。W istar糖尿病大鼠(o beseW i star fa tty rats)该品系动物T2D M实验动物模型的特征为甘油三酯生成过量,但机体对其分解的能力却受到了损伤,这种损伤是因低密度脂蛋白不易移去甘油三酯和机体不易移去低密度脂蛋白-甘油三酯,另外果糖能够进一步增加肝甘油三酯产生,导致高甘油三酯恶化[9]。 1.2自发性T2D M小鼠主要包括D i abetes(DB)小鼠、Obese (OB)小鼠、Toronto-KK(T-KK)小鼠、Nagoya Shi bata Yasuda (NS Y)小鼠等。 1.2.1db小鼠。db小鼠是l epti n受体基因缺陷导致的先天肥胖性T2D M小鼠,其发病过程与人T2D M非常相似,是国际上广为采用的研究T2D M的动物模型[10]。其瘦素受体基因失去功能,在出生后2周内就发生高胰岛素血症,3~4周发展为肥胖,4 ~8周后就发展为非常严重的高血糖症,其间有胰岛素抵抗发生,B细胞功能衰竭,一般在10个月内死亡,可发生明显的肾病。 1.2.2ob小鼠模型。o b小鼠模型是一种瘦素受体与瘦素基因均发生变异的模型,属常染色体隐性遗传,表现为饮食过量,3~ 4周发展为高胰岛素血症伴发胰岛素抵抗,最后发展为非常严重的糖尿病。 1.2.3KK糖尿病小鼠。1941年K#Ko ndo用日本商人的小鼠原种(Kansukabe群)培育而成的,该动物对胰岛素不敏感,对葡萄糖耐量小,糖尿病发病率高,以具有轻度肥胖、高胰岛素抵抗和高血糖症的特征。KK小鼠对胰岛素有轻度抗性,易于出现类似糖尿病肾病的肾脏损害[11]。 1.2.4NSY小鼠(Nagoya-sh i bata-yas uda)。NS Y小鼠发展为糖尿病的速度相对较为缓慢,具有年龄依赖性,年龄在糖尿病的发展过程中占有重要作用,12周龄后,胰岛素抵抗也不是很明显,其与人类疾病情况相似,减肥食谱的摄入能减轻其疾病状态,高脂食品能够加速疾病的发生过程,并且会出现胰岛素分泌不足及胰岛素作用受损现象[12]。胰岛素含量36周龄后显著增加,NS Y小鼠将有助于人们对T2D M遗传学倾向及病理发生的进一步研究。 2诱发性动物模型 2.1高脂饲料喂养近年来实验研究发现高脂膳食可诱发T2D M,为深入研究T2D M的发病机制,阐明营养因素与糖尿病的关系提供了重要线索及实验依据,也为广泛开展T2D M的实验研究提供了良好的动物模型。高脂饮食可诱发糖尿病的报道

小鼠脾细胞培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 崔文强201300140012 2015.4.7 【实验目的】 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养； 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 【实验原理】 1.细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义 具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 2.细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。 ②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色

糖尿病行为学异常及STZ糖尿病小鼠模型

Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2020, 10(7), 1348-1352 Published Online July 2020 in Hans. https://www.360docs.net/doc/6417892260.html,/journal/acm https://https://www.360docs.net/doc/6417892260.html,/10.12677/acm.2020.107203 Behavioral Abnormalities of Diabetes Mellitus and Streptozotocin-Induced Diabetic Mouse Model Yilong Gao1, Lingling Yuan2* 1Clinical Class 6, Grade 2018, Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou Henan 2Department of Endocrinology, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei Received: Jul. 1st, 2020; accepted: Jul. 14th, 2020; published: Jul. 21st, 2020 Abstract Diabetes Mellitus and related morbidity and mortality are increasing at an alarming rate, and di-abetic patients can show abnormalities, they include behavioral abnormalities and psychological abnormalities. Both behavioral and psychological abnormalities can reduce the quality of life of diabetic patients and increase medical costs. Early identification of diabetic abnormalities can help patients improve their quality of life and reduce medical costs. Diabetic animal models main-ly include type 1 and type 2, among which streptozotocin-induced diabetic mouse model is the most widely used. Keywords Diabetes Mellitus, Behavior, Model, Streptozotocin 糖尿病行为学异常及STZ糖尿病 小鼠模型 高逸龙1，袁玲玲2* 1郑州大学医学院2018级临床6班，河南郑州 2河北医科大学第二医院内分泌科，河北石家庄 收稿日期：2020年7月1日；录用日期：2020年7月14日；发布日期：2020年7月21日 *通讯作者。

小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 陈素君 200900140007 实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制 及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。 实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。 要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。 细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。 实验用品： 一、器材 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好 倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板 二、试剂 PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝 三、小白鼠 实验方法： 1. 细胞的原代培养 1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。 1.2在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿 开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。 1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针 头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。 1.4将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。

自发性糖尿病模式动物

自发性糖尿病模式动物 一、NOD（non-obese diabetes）鼠 模式动物发现的由来 由日本盐野义制药公司从ICR小鼠中发现到白内障易发型模式动物中培养出来的，他们依照下列几个步骤加以筛选：(1)先嫔O血糖值的高低；(2)血糖值低的族群以多尿（频尿），尿糖强阳性；(3)外观症状为消瘦型，造就出胰岛素依存性糖尿病模式NOD。病状的特征为频尿、多饮、高血糖、尿酸强阳性，高胆固醇血症，毛色为白色带有微微乳白的色调，由白内障易发型模式动物中选出血糖值高的小鼠。临床症状 以胰岛炎的发生为主，且发病者以雌性为主，雌雄之比例大约为9：1，可以很清楚了解与性贺尔蒙有关。约4周龄左右时雌鼠即有显着的频尿及消瘦，母鼠会将哺乳中幼鼠吃掉或有哺育困难等现象发生。一只NOD大鼠每天可喝水达250mL（正常大鼠约30-50mL/只/天），又在一个月后可以看到从肛门流出血来或在饲育盒中频繁的走来走去，最后消瘦致死。 疾病模式动物 被用来作为研究人类年轻消瘦型糖尿病模式，其评价很高，小鼠（mouse）的主要组织适合抗原（Major Histocompatibility Complex；MHC）为class I-III，NOD的class I为H-2k是d haplo type，而H-2D是6 haplo type。class II在小鼠是I-A，I-E等2种，NOD的特征是没有被发现有I-E但I-A的αchain特异的突变。最近NOD特定遗传基因的转植成功之动物被成功做出，在不久将来糖尿病的发生机制将可被进一步了解。目前这种疾病模式动物可以向日本Cler社（东京）买得到，还有一种人类年轻消瘦型糖尿病，胰岛素依存糖尿病（IDDM）模式动物：B.B.大鼠（B.B. Rat）亦被开发出。 二、糖尿病OLETF大鼠（OLETF Rat） 糖尿病是1985年由WHO依照胰岛素依存性糖尿病（IDDM）和胰岛素非依存性糖尿病（NIDDM）分成两类。 OLETF（Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty）大鼠是大冢制药德岛研究所开发出来，以后又开发出LETO （Long-Evans Tokushima Otsuka)大鼠，即完全不发病的当作对照组，OLETF大鼠是长期持续高血糖及糖尿病性合并症，特别是人类糖尿病性肾病的特征丝球体结节性病变（Kimmelstiel-Wilson lesion）可以被发现。 疾病模式动物的由来 大冢制药德岛研究所于1982年向加拿大的Charles River购入Close colony的Long-Evans的大鼠，在饲养中不见有体重急剧减少，而是肥胖且尿糖阳性的大鼠被发现。从此以后经由肥胖、尿糖阳性与口服葡萄糖的负荷试验（Oral glucose tolerance test；OGTT）不耐受性等人择育种，发展出OLETF系统。 临床特征及病理组织 临床上其糖尿病是以雄性为多，以OGTT型不耐受性之糖尿病大鼠经育种后，在25周龄发病率约87.7%，耐糖障碍7.2%，正常型的4.8%。OLETF大鼠是离乳后开始肥胖，随年龄增加更加明显，在发病后尿糖的排泄是徐徐的增加，体重是显着的减少。在组织病理上：(1)5周龄即可被H&E染色观察到轻微胰岛炎；(2)25周龄用AZAN染色观察到有结缔组织增生且胰岛有如岛状分割相；(3)25周龄胰岛素染色，可见胰岛有肥大现象；(4)85周龄可见胰脏内充满脂肪。又55周龄以后肾脏丝球体内有结节状出现。即人类所谓的糖尿病性肾病的特征。 OLETF大鼠是可以看到如OGTT不耐受性结果的糖尿病，经长期间以后会徐徐恶化且最后表现出IDDM 样的症状，但此时的肾脏病变很像人类的NIDDM病患之。若有需要OLETF大鼠时可以向日本大冢制药德岛研究所申请购买。 三、WBN/kob大鼠（WBN/kob Rat） WBN/kob大鼠是瑞士巴士德老人病研究所及德国波恩大学病理学研究所利用了50年的时间从Wistar 系的WBN大鼠作近亲交配得来，后来，波恩大学选了数对给日本东大医科学研究所，在1980年日本国立卫生试验所对WBN/kob大鼠长期观察中，发现到此品系的大鼠在年龄的增加时会有尿糖阳性，低体重，白内障、高血糖等症状出现，因而发展此新的自然发病之糖尿病样式动物。 目前被报告使用的糖尿病模式动物有B.B.大鼠、NOD小鼠，两者皆属于I型糖尿病模式。而KK小鼠、db/db小鼠则为II型糖尿病模式，两型皆有明显不同的病征。例如WBN/kob的胰岛素分泌不全，对于外因性胰岛素有高感受性，低体重等与BB大鼠、NOD小鼠很类似，然和NOD小鼠的性别差异则相反，WBN/kob的发病年龄很晚，发病经过很缓慢，此和B.B.大鼠，NOD小鼠有明显的不同，又WBN/kob