试验酶活测定方法
1淀粉酶活性测定
原理
淀粉酶从淀粉中分解出还原物质，可以从他们与3，5—二硝基水杨酸的还原反应能力来测定这些还原物质，以一水麦芽糖计算。一个淀粉酶单位相当于在规定条件下释放lmg还原碳水化合物(以一水麦芽糖计算)时所需的酶量。
主要试剂
(1)磷酸盐缓冲液(PH 6.9)；取0.067M的磷酸二氢钾溶液(9.12gKH2PO4溶于蒸馏水中，并定容至1000m1)与0.067M的二水磷酸氢二钠溶液 (11.93gNa2HPO4·2H20溶于蒸馏水中，并定容至1000m1)混合，直至用测得其PH值达到6.9为止。取39mg氯化钠溶于35ml上述溶液内，并用蒸馏水定容至lOOml。
(2)底物溶液：取1.Og可溶性淀粉溶于lOOml上述磷酸盐缓冲液。
(3)指示剂溶液：取1.Og 3,5-二硝基水杨酸(C7H4N207)与少许蒸馏水拌和。添加20ml2N氢氧化钠溶液后此酸便溶解。取30.0g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O)溶于此溶液，并用蒸馏水将此指示剂定容至100ml。
(4)麦芽糖溶液；称取lOOmg一水麦芽糖(C12H22O11·H20)用蒸馏水定容至lOOml。
测定方法
用移液管将1.Oml底物溶液移入一试管，并加热至25℃。加1.Oml酶溶液(同样也已预热至25℃)，摇匀，保温3min后加2ml指示剂溶液，终止反应。将此溶液置于沸水浴中5min后，取出来置于冰水中或进行流水冷却。随后用蒸馏水定容至20ml。用分光光度计于490nm处，以空白值为参比测定其颜色深度。以1ml灭活的酶液作为空白对照。
2脂肪酶活性测定
原理
脂肪酶为一种水解酶，在一定条件下，可以把甘油三酯脂肪逐步水解，最后生成甘油及对应的脂肪酸。用己知浓度的标准溶液对水解液进行滴定，即可定量求出脂肪酸的量，从而求出脂肪酶活性。
1个脂肪酶单位相当于在试验条件下释放出1μmol醋酸所需的量。
主要试剂
(1)0.025 mol·L-1磷酸缓冲液(PH 7.5)：
<2>乙液：称取Na2HPO4·12H2O 44.7g，加水定容到500ml。
<3>取甲液13ml，乙液lOOml混合，即成PH 7.5、0.25 mol·L-1磷酸缓冲液，再稀释10倍即成PH 7.5、0.025 mol·L-1磷酸缓冲液。
(2)聚乙烯醇橄榄油乳化液：
<2>最终乳化液：取上述4％聚乙烯醇溶液150ml，加50ml橄榄油，于高速组织捣碎机中搅动6分钟(分两次进行)，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液。
(3)0.05 mol·L-1氢氧化钠标准溶液：称取40g氢氧化钠加蒸馏水至1000ml，成为约1N的溶液，经标定浓度后准确稀释到0．05N。
(4)1％酚酞指示剂：lg酚酞溶于100m195％乙醇中。
测定方法
加5ml 0．025 mol·L-1(PH 7．5)磷酸缓冲液和4ml聚乙烯醇橄榄油乳化液于三角烧瓶中，置于40℃水浴中预热lOmin。加入酶液lml，40℃保温15min，立即加入15ml 95％的乙醇终止酶的反应。加酚酞指示剂2—3滴后以0.05 mol·L-1氢氧化钠标准溶液滴定到微红色，记下氢氧化钠溶液的消耗体积。
重复二次测定。并以lml灭活酶液代替作为空白对照。
3蛋白酶活性测定
原理
磷钨酸和磷钼酸的混合物(即福林酚试剂)在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钼蓝和钨蓝混合物)。用蛋白酶催化水解血红蛋白(底物)游离出含酚基的氨基酸，与福林酚试剂呈蓝色反应，可从蓝色的深浅测定酶活性的大小。
在37℃,每分钟胃蛋白酶A分解血红蛋白产生的溶于三氯乙酸的物质，与福林酚试剂反应后在660nm的光吸收值相当于lμg分子酪氨酸所给出的光吸收值则为1个单位。
主要试剂
(1)底物溶液(2％血红蛋白)：lg血红蛋白溶于50ml 0.06N盐酸。
(2)1N福林酚试剂。
(3)0.5N氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4g，用蒸馏水定容至200ml。
(4)5％三氯乙酸： 5g三氯乙酸溶于100ml蒸馏水。
(5)0.0lN盐酸：取盐酸0.84 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。
(6)0.06N盐酸：取盐酸5.04 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。
(7)0．2N盐酸：取盐酸16.8 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。
(8)酪氨酸标准液：精密称耿干燥到恒重的酪氨酸0.01812 g，用0，2N盐酸溶解并稀释到100ml，此溶液每ml含酪氨酸1μg分子。
测定方法
在25℃恒温条件下，取3支试管按表8进行测定。
表8蛋白酶活性测定
脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用 一脂肪酶概述、 脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。 酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、 原理以及标准曲线做法 1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是 脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。 2. 所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称830-03- 5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁 酸酯 1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯 1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯 1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯 14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂 全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司 3. 标准曲线绘制： a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。 方法一： b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制： 分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和 (全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
抗氧化实验方法
1还原力的测定 样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。 2 DPPH自由基清除活性的测定 将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为： 空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。 式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值； Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。 DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为: SA(%)=(Ac一AS)/A C×100 式中:Ac一不加样品的吸光度 As一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
脂肪酶活力测定方法及其比较
万方数据
苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法． １．３．３对硝基苯酚法 对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积． ２３种方法的比较 ２．１实验仪器和操作难易程度的比较 平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２?１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。操作简单［２?１８］（表１）． ２．２实验试剂及精确度的比较 平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。１７｜．对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［２．１８］（表１）． ２．３各种方法的适用范围 平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长．因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［１１］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［２］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高。但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［１５］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［１６－１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［２．１８］（表１）． 表Ｉ平板法、滴定法及比色法的比较 ３结论 在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性．在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适ｐＨ、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行。从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信．另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义。给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算?４４?酶活． 致谢本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助． 参考文献： ［１］ＧＵＰＴＡＲ，ＧｕｐｔａＮＲａｔｈｉＰ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｐａｓｅｓ：ａｎｏ’ｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—ｇＹ。２００４，６４（６）：７６３—７８１． 万方数据
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O（分子量 358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH 2PO 4 ·2H 2 O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml，B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μM EDTA-Na 2溶液：取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。 （5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 2、酶活性测定 （1）取10ml试管（要求透明度好）
酶测定、方法
总蛋白酶活性测定用氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物测定。偶氮酪蛋白以20 mg/L的浓度溶于0.15molL /NaCI溶液。取该液0.3mL加人含中肠酶液的0.3mL PH7.2磷酸盐反应缓冲液中反应。在30℃反应2h,加人0.6mL的2 0%(重量/体积)三氯乙酸终止反应。反应混合物在11200 x g、4℃下离心15min后,取上清液,在366nm测光吸收值。反应混合物1个吸收单位的变化定义为1个偶氮酪蛋白单位。 类胰蛋白酶活力测定采用两种专性底物:BAPN A和TAME。BA PNA以2 0mgm /L溶于二甲基亚矾,取40ul 加入含中肠酶液的1.5mL PH7.2的磷酸盐L反应缓冲液中,反应20min后,加人0.5mL30%(体积/体积)乙酸终止反应,在405nm测光吸收值。TAME以2mmol/L 溶于0.15mol/L NaCI溶液中。反应缓冲液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液，其余反应步骤同强碱性类胰蛋白酶活性测定，最后在248 nm测定吸光值. 淀粉酶活性的测定: 主要按照3，5- 二硝基水杨酸法(张桂芬等，2008)进行，具体的操作步骤为: 1) 标准曲线的制作: 配制浓度为1．0 mg/mL 的麦芽糖标准溶液10 mL，测定时分别稀释至0.2，0.4,0.5,0.6, 0.7，0.8 和1.0 mg/mL。依次取上述溶液10 μL 分别移入0．2 mL PCR 管，每管加入10 μL 显色剂(3，5- 二硝基水杨酸试剂)，置沸水浴中煮沸5 min，冰浴冷却后加入蒸馏水80 μL。以微量移液器取混合溶液90 μL 移入酶标板(美国Costor)，立即于490 nm 处读取OD 值，并确定OD值与麦芽糖含量之间的对应关系; 2) 样品酶液的测定: 取5 μL 浓度为1 % 的淀粉溶液移入0．2 mLPCR 管中，加入5 μL 待测样本酶液，混合均匀，于25℃温浴3 min 后加10 μL 显色剂(3，5- 二硝基水杨酸试剂)终止反应。其他操作步骤及OD 值的测定方法同标
脂肪酶活检测原理及实际方法：
脂肪酶活检测原理及实际方法： 一、原理以及标准曲线做法 1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种 底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。 2.所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称 830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂 全部为色谱纯试剂，购于sigma公司 3.标准曲线绘制： a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L): 称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。 方法一： b.标准曲线绘制： 分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。 方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制： 分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）L磷酸缓冲液(PBS，： A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g； B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。 （4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀； （2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min； 同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。 （5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在
测定酶活方法
Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seeding 方法 1测定土壤及植物水状况 （1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。在DAP（开花后的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦化前称重。（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。 （3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。 Notice 1RWC计算：RWC=（W f－W d）／（W t－W d）×100% 2WC计算：WC=（W f－W d）／W f×100% W f：叶片鲜重； W d：叶片干重； W t：叶片吸水饱和时的重量。 2酶粗提液的制备 为了测定CA T，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟15000g，4℃，离心20min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。 为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，离心15min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。 试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。 3酶活性的测定 所有的分光光度分析都使用Hitachi U-2000型分光光度计。 3.1SOD总活性的测定按照Giannopolitis和Ries（1977）的方法略作修改（Chowdhury和Choudhuri，1985；Zhang et al。，1995）。3ml反应混合液中含63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）和20μL酶液。核黄素应最后添加。将盛有反应混合液的试管放置在两盏4000lux荧光灯下，打开荧光灯，反应开始，照光10min，关闭荧光灯，反应终止，马上测定它在560nm处的吸光度。不照光的反应体系在560nm 处的吸光度作为对照，并将之从A560中减去。不加酶液的反应体系颜色最深，说明NTB被还原量最大。NTB的光还原量与SOD的活性呈反比。SOD酶活性采用抑制NBT光还原50%为一个酶活单位。 Notice：不加酶液的反应体系，以缓冲液代替酶液，其560nm处的吸光度作空白。 试剂：63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8） 试剂：NTB，核黄素，蛋氨酸，EDTA，磷酸缓冲液（pH7.8） 3.2CA T与愈创木酚POD活性按照Chance和Machly的方法测定（1955）。对CA T来说，其活性可以根据反应混合液1min内在240nm处的吸光度随着H2O2的分解而降低程度来确定（ε=39.4M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含50mM磷酸缓冲液（pH7.0），15mMH2O2，0.1ml酶液。加入酶液反应即开始。对POD来说，其活性可以通过测定反应混合液在460nm处的吸光度在1min内因愈创木酚的氧化作用而增加来确定（ε=26.6M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含20mM愈创木酚50μl，10mM磷酸缓冲（pH7.0）2.83ml，0.1ml酶液。加入40mMH2O220μl后反应开始。 试剂：H2O2，愈创木酚 3.3AP的活性可以根据反应混合液在290nm处的吸光度在1min内降低程度来确定（ε=2.8mM －1cm－1，Nakano和Aasda，1981）。反应混合液包含0.5mMAsA,0.1mMH2O2,0.1mMEDTA,50mM 磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.15ml酶液。加入H2O2后反应开始。该反应速率可以通过减去未加酶液反应体系的反应速率进行校正。
脂肪酶、淀粉酶测定方法
脂肪酶测定——采用p-NPP法 取0.5g样品，加去离子水10mL，40℃水浴浸泡2h，过滤。取滤液1mL于试管中，加入pH8.0缓冲液3mL和1mmol/L p-NPP溶液0.1mL 于40℃下精确反应3min，迅速置于冰上终止反应。在波长405nm处测定吸光度值。对照管酶液用等体积去离子水代替，其余试剂相同。Npp标准曲线Y=0.287x+0.0861 （y：吸光度x：NPP浓度（umol/L）） 试剂配制： 1mmol/L p-NPP溶液：称取0.0378g pNPP，加入1mL曲拉通-100与5mL异丙醇，用Tris-HCL（pH8.0）定容至100mL。 pH8.0 Tris-HCl：50mL 0.1M tris碱溶液与29.2mL 0.1M HCl溶液混合，加蒸馏水定容至100mL。 淀粉酶测定 称取六神曲0.5g，研细，用20mL去离子水40℃浸泡1h，过滤。取2只250mL的碘瓶，各加入5%的淀粉液25mL，10mL醋酸钠缓冲液（pH4.5），10mL蒸馏水，摇匀，40℃水浴预热5min。A管中加入滤液5mL，准确反应1h，立即加2mol/L HCl 1mL终止反应，B管中先加入HCl，再加滤液5mL。2只碘瓶分别加入0.05mol/L碘液10mL，0.1mol/L氢氧化钠45mL，边滴边振摇，暗处放置20min，加入1mol/L 硫酸2mL，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。每份样品测定3次。记录消耗硫代硫酸钠的体积，计算得淀粉酶活力。
淀粉酶活力是指1g六神曲粉末在一定条件下(T=40℃，pH=5.0)，1h 内催化可溶性淀粉水解生成葡萄糖的毫克数。计算公式: 淀粉酶活力=［c×(vB－vA)·M·N］/2×m·t 式中:c为硫代硫酸钠的浓度(mol/L)，M为葡萄糖的摩尔质量(g/mol)，N为酶液稀释倍数，V A为样品滴定值(mL)，VB为空白滴定液(mL)，m为六神曲的取样量(g)，t为反应时间(h)，淀粉酶活力单位为mg/(g·h) 。 试剂配制 pH4.5醋酸钠缓冲液：18g醋酸钠加9.8mL冰醋酸，定容至1000mL。1mol/L硫酸溶液：量取6mL浓硫酸，倒入适量水中，用水稀释至100mL。 0.1mol/L碘液：取碘13.0g，加碘化钾36g与水50ml溶解后，加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。 蛋白酶活力测定 称取六神曲1g，研细，加蒸馏水20ml，于40℃水浴放置1h，间断搅拌，过滤，滤液以磷酸钠缓冲液稀释1倍。取1mL稀释液置离心管中，于40℃水浴预热5min，加入预热的酪蛋白1mL，保温10min，立即加入0.4 mol / L 三氯醋酸2 ml，终止反应，继续置水浴中保温20 min，使残余蛋白质沉淀后离心滤过。取1 mL滤液，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5 mL，福林试液1 mL，蒸馏水2 mL，摇匀，置水浴锅中，40 ℃保温显色20 min。以试剂溶液为空白，于763 nm 波长处测定吸光度。 在40℃时每1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化物酶（POD）测定方法 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法 （1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。（2）紫外吸收法： 称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，
2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na
最新脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。 1 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂） 1.1 脂肪酶活力定义 为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。 1.2 测定原理 脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。 1.3 仪器设备 恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器 1.4 试剂溶液 95％酒精 4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。 橄榄油(分析纯) 底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。 pH7.5磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH 到7.5±0.05。 0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。使用时稀释10倍。 10g/L酚酞指示液：GB/T603配制。 1.5 待测酶液的制备
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
脂肪酶实验方案
脂肪酶实验方案 富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6. 0 ,7.0 ,8. 0. 种子培养基( %) :葡萄糖2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0. 1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然 产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。 脂肪酶高产菌株的筛选： （1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h； （2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用； （3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。脂肪酶催化对- 棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ- nitrophenol, 在该过程中不断测定其光吸收值的变化。根据单位时间产生ρ- nitrophenol 的量来反应脂肪酶的活力。（本实验采用如下方法：分别向各菌株等量上清液中加入等量过量的对- 棕榈酸硝基苯酯，在反应过程中不断测定其光吸收值的变化，根据吸光值变化幅度确定产酶量大小。） [A液:16.5mmol/L的对硝基苯棕搁酸酯(p一NPP)的异丙醇溶液(冷藏，两周内使用)。B液:含有0.4%Trilonx一100和0.1%阿拉伯树胶的50mmol/L的Tris一HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液1:9混和，取100ul适当浓度的酶液加人900ul的上述混和液中，混匀，37℃反应10min后，用可见分光光度计(410nm)读取A值。在此反应条件下，对硝基苯的消光系数是1.46x105cm3/mol。1个单位的脂肪酶活力定义为每分钟分解p一NPP并释放出1umol对硝基苯所需的酶量。] (ii)平板法：采用三丁酸甘油脂平板鉴定法,鉴定板含2 %的三丁酸甘油脂乳化液和2 %的琼脂粉。取10μl粗酶液加入鉴定板上各小孔(直径0. 20cm) 中,特定温度下放置12h 后,通过水解透明圈的直径大小来测定脂肪酶酶活性大小。 菌株产酶条件的优化 碳源对产酶的影响；分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、糊精、玉米淀粉、大豆油、橄榄油为碳源(均为2 %) 进行发酵,以平板透明圈法测定其产酶情况。