siRNA 载体的构建

实验题目：pLL3.7-Mcl-1-siRNA 载体的构建

实验日期：2010年12月6日

实验记录者：孙向东实验参加者：孙向东

实验目的：

将退火后的shRNA片段克隆至慢病毒载体pLL3.7慢病毒载体中，构建成pLL3.7-Mcl-1-siRNA载体。实验材料：

pLL3.7慢病毒质粒

Sh-mcl-1-f：5'- AAC GCAGTCCTCTAGTGTTTCA TTCAAGAGA TGAAACACTAGAGGACTGC TTTTTT C-3'

Sh-mcl-1-r：5'-TCGAG AAAAAA GCAGTCCTCTAGTGTTTCA TCTCTTGAA TGAAACACTAGAGGACTGC GTT -3' Sh-GAPDH-f：5’- AAC GTA TGACAACAGCCTCAAG TTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATAC TTTTTT C -3’

Sh-GAPDH-r：5’- TCGAG AAAAAA GTATGACAACAGCCTCAAG TCTCTTGAA CTTGAGGCTGTTGTCA TAC GTT -3’

实验方法：

1. shRNA单链退火形成shRNA双链（实验方法参考Invitrogen公司Protocol：Generating the Double-Stranded Oligo (ds oligo)）

2．稀释shRNA 修改原因

3．酶切：

pLL3.7：20ul

Buffer B: 4 ul

BSA: 4 ul

dH2O: 8 ul

HpaI: 2 ul

XhoI: 2 ul

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37度4h（13：40～17：40）

4. 电泳胶回收：

5. 连接:

pLL3.7(XhoI/HpaI)： 2 ul

McL-1 siRNA： 4 ul

10×T4 DNA ligase Buffer: 1ul

dH2O: 2.5 ul

ligase 0.5ul

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16度4h，或者4度过夜（13：40～17：40）

6. 转化

7. 鉴定

实验结果：

实验结论/分析讨论：