SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验目的:测定蛋白质亚基的分子量及纯度
实验原理：在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以
被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率
与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。
基本过程：制胶、电泳、检测
试剂：（储液由专业人员配置）30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇
器材：灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪
实验操作程序：
1．安装灌胶模具，依照说明书进行
2．按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml），过硫酸铵和TEMED在用前加入。
3．分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇（或水饱和的异丙醇、水），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。
4．室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，用浓缩胶缓冲液淋洗胶面，然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。
5．静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。
6．制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1：1混合，与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考
染上样量30ug）
7．加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。
8．连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶，
9．溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶，做好标记，准备染色。10．染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。
11．扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。
注意事项
1．在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气，防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。
2．过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。
3．分离胶聚合后最好在4℃放置12小时后再使用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。
4．为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。
5．如果带着梳子过夜可能会影响分辨率，所以浓缩胶最好在使用前再灌制。6．如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近的带扩展。
7．对样品浓度不确定的情况下，加样时使用梯度加样法，能大致估计出样品的浓度。
参考文献：
1．《蛋白质电泳实验技术》郭尧君编著
固相pH梯度-SDS双向凝胶电泳实验操作程序
实验目的：分离蛋白质混合物，将样品进行电泳后，为了不同目的在它的直角方向再进行一次电泳。常说的双向电泳是根据蛋白质所带的电荷和分子大小对蛋白质混合物进行分离。
实验原理：第一向等电聚焦的基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。第二向运用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量大小对蛋白质进行分离。
基本过程：等电聚焦、平衡及转移到二向、SDS-PAGE
试剂或储液：IPG buffer、矿物油、DTT、碘代乙酰胺、过硫酸铵、TEMED、1M DTT、rehydration buffer、平衡液储液、30%丙烯酰胺单体储液、1.5M Tris-HCl、10% SDS、10X Tris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、0.5%琼脂糖、水饱和正丁醇、占位液
实验操作程序：
等点聚焦部分
1．根据选用的胶条的长度计算上样体积（见附1），加1M DTT到终浓度50mM 需要的体积，补加IPG buffer到终浓度0.2%或者0.5%的体积，加rehydration buffer到该胶条的上样体积。
2．把各种溶液按计算的体积加入到eppendorf管中，充分混匀，（或者超声5-10min）14000rpm,10℃离心5min。
3．取出胶条室温放置10min，平衡胶条的温度。
4．沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。
5．当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG
胶条上的保护层。
6．分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+，安玛西亚胶条为尖端）对应于聚焦盘的正极（安玛西亚为尖端）。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
7．在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发析出尿素。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。8．对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序（见附2）。
9．聚焦结束的胶条立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条吸干矿物油置于平衡管中，-80℃冰箱保存。
注意事项：
参见“双向电泳培训班讲义（定稿）”中等电聚焦注意事项部分。
附1：
胶条长度、上样量、上样体积、等点聚焦的伏小时数的设置及说明
说明：
1．pH3-10NL, pH4-7, pH6-11的上样量与pH 3-10相比增加1.5-2倍，聚焦伏小时数延长约10000VHr
2．按照推荐量上预实验，根据预实验结果调整上样量，样品中蛋白质分布均匀按推荐量使用，如果有高丰度的蛋白质适当降低上样量，如果显得少则适当加大上样量。聚焦的伏小时数可以根据聚焦的情况进行调整。
附2：
等电聚焦程序的设置及说明
rehydration at 20℃4-8Hr
S1 50V 8-4Hr 快速
S2 500V 1Hr 快速
S3 1000V 1Hr 快速
S4 8000V 1-2Hr 线性
S5 8000V 见附1 快速
说明:
1．一般无电压泡胀与低电压50V泡胀的时间加起来为12Hrs，无电压泡胀能够使小分子蛋白进入胶内，低电压泡胀能够使大分子量蛋白容易进入胶内。依据感兴趣的蛋白质的分子量范围进行调节。
2．样品含盐量高时，最好把S4设置的时间再延长一些，或者在电极上加湿润滤纸条搭盐桥，避免烧胶。
3．7cm的胶使用最高电压4000V来进行等电聚焦，如果某些样品达不到设置的8000V/Hr，总伏小时数能够达到设置值也表明等电聚焦已经完成。
4．如果等电聚焦完成与转二向之间有几个小时的间隔，可以设置500V的电压来保持蛋白在胶里保持溶解状态。
平衡及SDS-PAGE
1．安装灌胶模具，配置SDS凝胶。具体操作见SDS-PAGE、ETTAN DALT II System 以及ETTAN DALT SIX 操作规程。
2．拿出适量平衡液融化平分到平衡管中，一半加入1% DTT，一半加入2.5%碘代乙酰胺，充分溶解。
3．等电聚焦完成后，关掉电源，用镊子夹出胶条，胶面朝上放在湿润的滤纸上。
另外一张湿润的滤纸覆盖在胶面上，轻轻吸去上面的油。
4．胶条支持膜紧贴平衡管壁放进含DTT的平衡液中进行还原，低速摇床上放置15min，把胶条取出来转入含碘代乙酰胺的平衡管中，烷基化打开的二硫键, 低速摇床上放置15min。
5．小心将已平衡好的第一向胶条放置在胶面上，支持膜紧贴长玻板，轻轻压紧，胶条与胶面之间不要有气泡，胶条一端（一般为碱端）加入分子量marker，覆盖一层0.5%琼脂糖固定胶条。
6．电泳及染色。见SDS-PAGE、ETTAN DALT II System 以及ETTAN DALT SIX 操作规程。
注意事项：
剥胶后要注意切角以方便辨别。
常见问题及解决方案：
1.参考文献1 p37-41
2.参考文献2 p42-44
3.参考文献3 p283-286
4. 参考文献5 p4-6,p7,p8
参考文献：(参考文献1-3在//bpi-server\ public\references\NEW\reference\by project\双向电泳文件夹下)
1.2-D Electrophoresis using Immobilized pH gradients, principles and methods，安
玛西亚公司操作手册
2.2-D Electrophoresis for Proteomics：A Methods and Product Manual. bio-rad公司
操作手册
3.Proteomics in Practice. Dr. Reiner Westermeier, Dr. Tom Naven。
Wiley-VCH Verlag GmbH
4．《肿瘤蛋白质组学》陈主初、梁宋平主编湖南科学技术出版社
5．双向电泳培训班讲义（定稿）
6．《蛋白质电泳实验技术》郭尧君编著
Western blotting Protocol
一、试剂配方：
1X TBS: Tris-base 12.11g
Nacl 8.775g
用HCl 调pH7.4，用纯水稀释至1L
5X Transfer buffer: Tris-base 15.1g
Glycine 72.0g
To 1 L
10X碱性磷酸酶缓冲液： 1 mol/L Tris-HCl pH 9.5
1 mol/L Nacl
50mmol/L MgCl2
TTBS：1XTBS +TWEEN20（1000：1）
碱性磷酸酶显色液：2.5mL 1X碱性磷酸酶缓冲液+16.5μL NBT混匀, 再加
8.25μL BCIP混匀。
辣根过氧化物酶显色液：10 mL 0.01 mol/L pH 7.6 Tris-HCl 溶解6mg
DAB，滤纸过滤（-20℃保存），显色时加10μL 30%H2O2
（即按1000：1加）。
二、实验操作：
1、SDS-PAGE，胶在电转液：1 X Transfer buffer + 20%甲醇+ 0.01%SDS
(800mL/800μL 10% SDS) 平衡10min。
2、处理尼龙膜：100%甲醇浸泡5min,再加4倍体积的双蒸水，使甲醇终浓度为
20%，浸泡5min。1 X Transfer buffer+20%甲醇（无SDS）浸泡10min。
3、转膜：按黑（—极）—海绵—滤纸—胶—膜—滤纸—海绵—白夹子（+极），
（在电转液：1 X Transfer buffer+20%甲醇+0.01%SDS(800mL/800μL 10% SDS)中进行）夹好三明志夹，用冰包裹电泳槽，100V 或350mA转70 min。（注意底部靠其下槽，排除气泡，转完后切角作标记）。
4、封闭：电转后膜用1XTBS漂洗1次，置于5%脱脂奶粉中（1XTBS+1000：1
TWEEN20），封闭过夜，或者37℃，30 min ~90 min。
5、一抗：抗体（抗体稀释比例根据自身实验具体确定，推荐比例：抗血清常用
1：100~1：5000 5%牛奶，培养液上清1：2~1：100，腹水1：200~1：10000 5%牛奶，），震荡孵育1或2小时。（一抗可回收冷冻保存）
6、TTBS洗三次，10 min/次。
7、二抗：1：1000~5000 TTBS稀释（常用1：3000），室温震荡孵育1小时。
8、TTBS洗三次，10 min/次。
9、显色：将膜放在PARAFILM膜上，滴加显色液5rpm（一般显色1 min即可，
注意控制好时间，否则显色背景过深）。
10、纯水终止显色，晾干或滤纸吸干保存。
考马斯亮蓝染色操作规程
实验目的：聚丙烯酰胺凝胶上蛋白质的显色
实验原理：考马斯亮蓝染料能与蛋白质的碱性氨基酸结合形成较稳定的复合物形式从而使蛋白质显色。
试剂：固定液、染色液、脱色液
实验操作程序：
1．聚丙烯酰胺凝胶取下来后放置到盛有固定液的盘子里，摇床上轻摇固定30min；
2．倒掉固定液，加入染色液，摇床上轻摇染色过夜或者37℃保温2-3Hrs；3．到掉染色液，加入脱色液脱色至点或条带清晰明亮，背景干净。
银染操作规程
实验目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。
试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛
实验操作程序：
?固定：30min或者更长时间
o100ml 乙醇40% 乙醇
o25ml冰醋酸10% 冰醋酸
o加水到250ml
?致敏：30min
o75ml 乙醇30% 乙醇
o17g 乙酸钠28.2g 三水乙酸钠
o0.5g硫代硫酸钠
o加水到终体积250ml
?水洗：3 x 10min
?银染：20min
o0.625g AgNO3
o100 ul 37%甲醛
o加水到终体积250ml
?水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)
?显色：视情况而定
o 6.25 g Na2CO3
o50 ul 37% 甲醛
o加水到终体积250ml
?终止：10min
o 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸
o加水到终体积250ml
?保存：1% 冰醋酸，4 ℃
注意事项：
1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。
2．甲醛在使用前加入。
3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。
4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。
聚丙烯酰胺开题报告
开题报告 一、课题名称 聚丙烯酰胺的制备。 （一）主要原料极其规格 丙烯酰胺聚合级工业品 M E TA MS 工业级 （甲基氧代乙基二甲基氨甲基硫酸酯） （二）制法 丙烯酰胺与适宜的阳离子单体（如ME T AM S）在水-特丁基醇（TB A）中自由基催化下发生沉积共聚合反应而制得聚丙烯酰胺。 （三）流程说明 配制好的50%液态丙烯酰胺单体溶液，通过离子交换塔，除去聚合抑制剂铜离子后，间断的加入沉积共聚合反应器然后加入精致水、蜜白胺和循环的TB A溶剂，再加入液态缓冲剂氯化铵，用氮气吹扫，除去残余的氧后，再加入催化剂-活化剂溶液。在聚合反应器中进行绝热反应，温度为50~60度、反应时间5~6h 聚合物的收率是定量的。 产物为悬浮于水和TB A中的微粒。通过离心机分出水和TB A，再将粒料在干器中进行干燥包装出厂母液经精制循环使用。二、课题研究的目的和意义 设计一种聚丙烯酰胺的生产工艺流程，能用于中试生产，工业及民用水处理的需求。 聚丙烯酰胺再合成水溶性聚合物中是用途最广、用量最大的，自五十年代用于造纸工业作为添加剂，已有四十多年的历史。采用不同的聚合工艺，引入不同的官能团，可得到一系列具有不同分子量和不同电荷密度的产品，使其应用范围更加广泛，现已被称为标准的造纸助剂。据报道，美国1985年用于造纸作为助流助滤剂的PA M为8700吨，1985—1990年间增长6—10%。因此
研究和开发高质量的PA M具有一定的理论价值和实际意义。 本课题的目的是研制出一种固含量高、分子量高、溶解迅速、稳定好、单体残存量少的聚合物乳胶产品，要求其生产工艺简单，生产成本低的生产工艺流程。 三、课题研究的对象 聚丙烯酰胺产品规格：有聚丙烯酰胺粉剂、非离子型和阴离子型干粉、胶体等。 聚丙烯酰胺产品用途：用作油田泥浆处理剂、污水处理剂、纺织上浆、纸张补强剂、絮凝剂等，广泛应用于石油、冶金、纺织、食品等工业。 1、石油工业 聚丙烯酰胺虽然对水的表面张力降低很小，但分子中有活性基团，吸附于界面之后，能改变界面状态，多年来作为增稠剂、降失水剂、絮凝剂、分散剂、降阻剂、阻垢剂、流度控制剂用于石油工业，提高钻井流体流动性和石油采收率，并减少流体阻力。 作为泥浆性能调整剂，经常使用的是部分水解聚丙烯酰胺。其作用是调节钻井液的流变性，携带岩屑，润滑钻头，减少流体流失等。用PA M调节的钻井泥浆相对密度低，固体含量少，能减轻对油气层的压力和堵塞，容易发现油气层，并有利钻井。 此外，还可大大减少卡钻事故，减轻设备磨损，并能防止井漏和坍塌，使井径规则。在提高石油采收率的三次采油方法中，聚合物驱油技术占有重要地位 在油田生产过程中，由于地层的非均质性，常产生水浸问题，需要进行堵水。PAM类堵水剂的发展甚快，用量大，具有对油和水渗透能力的选择性。选择性堵水这一点是其他堵水剂所没有的。采用P AM还可调整地层内吸水剖面及封堵大管道，实践中已见到良好效果。 从70年代以来，国际上发展起来一种新型发醇产品—黄原胶，它是由甘蓝黑腐单细胞菌以碳水化合物为主要原料（如玉米、淀粉等），经生物工程的手段得到的一种高分子微生物聚合物。
(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析
常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构 象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保 护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min， 未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材： 试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，
加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作
聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺 1、定义 丙烯酰胺聚合物是丙烯酰胺的均聚物及其共聚物的统称。工业上凡是含有50%以上的丙烯酰胺（AM）单体结构单元的聚合物，都泛称聚丙烯酰胺。其他单体结构单元含量不足5%的通常都视为聚丙烯酰胺的均聚物。 聚丙烯酰胺，polyacrylamide（PAM），CAS RN：[9003-05-8]，结构式为： n是聚合度。n的范围很宽，数量级为102~105，相应的相对分子质量由几千到上千万。 分子量是PAM的最重要参数。按其值得大小有低分子量（<100×104）、中等分子量（100×104~1000×104）、高分子量（1000×104~1500×104）和超高分子量（>1700×104）四种。不同分子量范围的PAM有不同的使用性质和用途。 2、分类 聚丙烯酰胺按在水溶液中的电离性可分为非离子型、阴离子型、阳离子型、两性型。 非离子型聚丙烯酰胺（NPAM）的分子链上不带可电离基团，在水中不电离；阴离子型聚丙烯酰胺（APAM）的分子链上带有可电离的负电荷基团，在水中可电离成聚阴离子和小的阳离子；阳离子型聚丙烯酰胺（CPAM）的分子链上带有可电离的正电荷基团，在水中可电离成聚阳离子和小的阴离子；两性的聚丙烯酰胺（AmPAM或ZPAM）的分子链上则同时带有可电离的负电荷基团和正电荷基团，在水中能电离成聚阴离子和聚阳离子，ZPAM的电性依溶液体系的PH值和何种类型的电荷基团多寡而定。 PAM的电性称谓和所带的电荷基团解离后的电性称谓相同。 按照聚合物分子链的几何形状可把PAM分为线型、支化型和交联型。PAM分子链的形状一般是线型结构。但是在丙烯酰胺自由基聚合反应的过程中会发生链转移反应。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
【跑电泳的步骤】 1、取出电泳仪器和四个烧杯； 2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口； 3、配制过硫酸铵溶液（AP）：0.1gAP+0.9g超纯水，保鲜膜封口； 4、取出所有药品。Tris-HCL(88,6.8)，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好； 5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只； 6、先配分离胶 7、组装凝胶模具，插好板 （1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里； （2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。 8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂； 9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）； 10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干； 11、配浓缩胶； 12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我； 13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。），样品煮沸3分钟； 14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内； 15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV； 16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。 【附配方】 分离胶separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL)1板2板
Prescription12%10%7.5% 3.5 mL7.0 mL Del H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL 1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL0.91 mL 1.82 mL 30%Acry/bis 2 mL 1.7 mL 1. 3 mL 1.19mL 1.38 mL 单体胶（29.2g+0.8g/100mL） 10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL 10%AP50uL50uL50uL35uL70uL 7uL(夏)~8 TEMED2uL2uL(5 uL)2uL 3.5uL uL 浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL) Prescription Volume(2 mL)(2 mL) Del H2O 1.4mL 2.1mL 0.5M Tris-HCL pH6.8250uL375uL 30%单体胶330uL495uL 10%SDS20uL30uL 10%AP20uL30uL TEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏) 【附所需试剂配制】 1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，2.67%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；(100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，0.45 uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1)
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示： 表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b 3.51000－2000 460 100 5.080－500 260 65 8.060－400 160 45 12.040－200 70 20 15.025－150 60 15 20.0 6－100 45 12 a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30 b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。 聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA 纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。 常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶： （1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶
SDS-PAGE电泳问题总结
SDS-PAGE电泳问题总结(2012-04-19 20:07:12)转载▼ 标签：杂谈分类：々☆常用技术☆々 蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？ 回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不 一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善 胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量 丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围 15 ％15～45 kDa 12.5％15～60 kDa 10 ％18～75 kDa 7.5％30～120kDa 5 ％60～212kDa 来源于《蛋白质技术手册》汪家政 每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区 间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家 尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。 下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用
至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了 SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降 低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。 做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的 加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久， 否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很 简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不 如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。
聚丙烯酰胺PAM
PAM申华原料规格： 申华化学工业有限公司 原料规格表M40-RAD-01 RAW MATERIAL SPECIFICATION 1、原料名称（Material） 原料编号（Code No.）M-4030 版别：1.0 原料名称（Material）聚丙烯酰胺(部分水解)〖Polyacrylamide (PAM)〗 2、规格项目（Specifications） 规格项目（Specifications）指标（Limits）测试方法（Test Method） Appearance White Grain Total Solid / % ≥90 Solubilization Speed / hr ≤1.5 Anion Content / % 20-30 即水解度 Free Monomer / % ≤0.05 3、分子式（Formula） ?[?CH2?CH?]m?[?CH2?CH?]n? ∣∣ C＝O C＝O ∣∣ NH2O Na 4、分子量（Molecular Weight）：3000,000-13000,000 聚丙烯酰胺(cpolyacrylamids)简称PAM，是一种线型高分子聚合物，是水溶性高分子化合物中应用最为广泛的品种之一，聚丙烯酰胺和它的衍生物可以用作有效的絮凝剂，增稠剂，纸张增强剂，以及液体的减阻剂等，广泛应用于水处理、造纸、石油、煤矿、矿冶、地质、轻纺，建筑等工业部门。 一、市售产品规格及主要技术指标 技术指标名称PAM 阴离子PAM 非离子PAM 阳离子PAM 复合离子 外观白色或微黄色粉末 粒径，mm < 2 固含量(%) ≥ 88 溶速(mim) ≤ 1.5 不溶物(%) ≤ 2 分子量(万) 500-2400 300-600 300-800 800-1500 水解度(%) 13-30 5-15 离子度5-50 10-20 注：根据用户要求，分子量控制在表格所定指标的范围内根据市场价格面议 加强混凝作用 ⑴聚合氯化铝（PAC）聚合氯化铝又名碱式氯化铝或羟基氯化铝。它是以铝灰或含铝矿物作为原料，采用酸溶或碱溶法加工制成。其分子式为[Al2(OH)nCl6-n]m ，其中m为聚合度，单体为铝的羟基配合物Al2(OH)nCl6-n ，通常n=1~5，m≤10。聚合氯化铝溶于水后，即
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 发布时间：11-06-01 来源：点击量：10032 字段选择：大中小聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点： ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。 ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100 万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。 ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。 ④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙
的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算： 公式 a：丙烯酰胺克数；b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。 交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。可通过下式计算来选择适当的凝胶网孔。 公式 式中：P为网孔平均直径，C为多聚体浓度，d为该多聚体分子直径（若不是卷曲的分子应为5A），K为常数，K值取决于涨胶的几何构型，假如多聚体的链是以近似于直角交联的，则约为1.5根据此式，我们可以通过多聚体浓度C近似地计算出网孔直径，例如已知多聚体浓度为5%，其网孔平均直径应为： 公式
最全的聚丙烯酰胺分类与特点详解
最全的聚丙烯酰胺分类与特点详解 有代表性的高分子聚丙烯酰胺有：非离子型聚丙烯酰胺（简写NPAM，分子量800-1500万）、阴离子型聚丙烯酰胺（简写APAM，分子量800-2000万）、阳离子聚丙烯酰胺（简写CPAM，分子量800-1200万，离子度10%-80%）。用量一般为废水量的百万分之一至百万分之二。 阴离子聚丙烯酰胺（APAM）产品特性：阴离子聚丙烯酰胺（APAM）外观为白色粉粒，分子量从600万到2500万。水溶解性好，能以任意比例溶解于水且不溶于有机溶剂。有效的PH值范围为4到14，在中性碱性介质中呈高聚合物电解质的特性，与盐类电解质敏感，与高价金属离子能交联成不溶性凝胶体。 阳离子聚丙烯酰胺（CPAM）产品特性：阳离子聚丙烯酰胺（CPAM）外观为白色粉粒，离子度从20%到55%水溶解性好，能以任意比例溶解于水且不溶于有机溶剂。呈高聚合物电解质的特性，适用于带阴电荷及富含有机物的废水处理。适用于染色、造纸、食品、建筑、冶金、选矿、煤粉、油田、水产加工与发酵等行业有机胶体含量较高的废水处理，特别适用于城市污水、城市污泥、造纸污泥及其它工业污泥的脱水处理。
两性离子聚丙烯酰胺是由乙烯酰胺和乙烯基阳离子单体丙烯酰胺水解共聚而成。分子链上既有阳电荷，又有阴电荷的两性离子不规则聚合物。 非离子聚丙烯酰胺（简写NPAM) 产品特性：非离子聚丙烯酰胺系列产品是具有高分子量的低离子度的线性高聚物。由于其具有特殊的基团，便赋予它具有絮凝、分散、增稠、粘结、成膜、凝胶、稳定胶体的作用。污水处理剂：当悬浮性污水显酸性时，采用非离子聚丙烯酰胺作絮凝剂较为合适。这时PAM起吸附架桥作用，使悬浮的粒子产生絮凝沉淀，达到净化污水的目的。也可用于自来水的净化，尤其是和无机絮凝剂配合使用，在水处理中效果最佳。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
聚丙烯酰胺 PAM
聚丙烯酰胺 河南佰科聚丙烯酰胺厂生产的佰科牌阳离子聚丙烯酰胺是一类新型高效的有机高分子絮凝剂,因其分子链节上带有阳离子,与废水中带阴离子的胶体颗粒进行电荷中和作用,降低ζ电位,压缩扩散层。同时,阳离子型聚丙烯酰胺的长链产生架桥效应,使胶体絮凝。其它悬浮的颗粒也被吸附、包卷和捕集,并相互集结形成大的絮体,即“中和”与“架桥”作用。因此阳离子型聚丙烯酰胺在污水处理中越来越受到重视。另外，聚丙烯酰胺在市政污水处理领域也扮演着重要的角色。日益严格的法规促进了水处理工业的发展，市政污水处理领域不仅未受到金融危机的影响，反而表现出良好的增长势头。包括摩洛哥、突尼斯、阿尔及利亚和埃及等国家在内的北非地区出现了新的市政污水处理市场，而其他一些国家，例如沙特阿拉伯和卡塔尔，也正在加大对水处理的私有化投资。在工业废水处理方面，煤炭开采和热电站建设提供了巨大的业务空间，而对中水回用技术的日益关注也是一个市场推动因素。 子量在300-2000万之间，产品外观为白色或略带粉末，液态为无色黏稠胶体状,温度超过120℃易分解,易溶于水,其水溶液几近透明的粘稠液体，属非危险品，无毒、无腐蚀性，固体PAM有吸湿性，吸湿性随离子度的增加而增加，PAM热稳定性好；加热到100℃稳 定性良好，但在150℃以上时易分解产中氮气，在分子间发 生亚胺化作用而不溶于水，密度（克）毫升23℃1.302。玻 璃化湿度153℃，PAM在应力作用下表现出非牛顿流动性。 本品无毒，注意防潮、防雨,避免阳光曝晒。贮存期：2年,25kg 纸袋（内衬塑料袋外为贴塑牛皮纸袋）。堆高不超过10层. 聚丙烯酰胺产品详情：PAM为水溶性高分子聚合物， 不溶于大多数有机溶剂，具有良好的絮凝性，可以降低液体 之间的磨擦阻力，按离子特性分可分为非离子、阴离子、阳 离子和两性型四种类型。 度高，在阳离子絮凝剂中一般是指添加的阳离子单体多，阳离子单体很昂贵，所以，离子度往往和成本密切相关。在阴离子絮凝剂中则一般是水解后呈阴性的基团，如--COOH多，水解程度强。很多SS类型物质的表面往往带有电荷，显然，同样带有电荷的絮凝剂就可以利用异性相吸的原理来絮凝SS类型的物质。电荷中和后再利用聚丙烯酰胺本身的分子链来形成大的絮团。这个是污水絮凝剂的基本原理。 我国的印染企业大多集中在江浙广等地,所产生的废水基本上内部处理,印染废水处理常用的物化处理工艺主要是混凝沉淀法与混凝气浮法。电解法、生物活性炭法和化学氧化法等有时也用于印染废水处理中。而这些要用到聚丙烯酰胺的地方选择各种离子度，混凝剂一般用阴离子聚丙烯酰胺，物理处理有用到阴离子或者非离子絮凝剂，生化污泥一般采用阳离子或者高分子量的非离子比较常见。 ?油田应用于油水分离 在油田开发过程中,为了提高油井产量和原油采收率,需要大量的水资源进行注水驱油同时,随着原油的采出,地层水和注入水又会随着原油一起被采出,在地面进行油水分离后产生大量采油污水,为节约水资源和降低水的应用成本,必须考虑采油污水的净化回用问题。针对姬塬采油区采油污水具有
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。 一、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1．样品的浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 实验报告
一、实验目的 1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理； 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳： (1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 (2)影响电泳效果的因素： ①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； ②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； ③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； ④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； ⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） (1)定义 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） (2)SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。 由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 (3) SDS-PAGE分类： ?SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类： 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 (4)聚丙烯胺凝胶的生成： 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种：
SDS-PAGE凝胶电泳
蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 一目的 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二原理 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量 三试剂和器材 试剂：1低分子量标准蛋白质 2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液） 3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用 4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml 5 10%(w/v)SDS 6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配） 7 四甲基乙二胺（TEMED） 8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。 9 2×样品稀释液：SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 12 染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中 器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽 四操作步骤 1分离胶制备： 凝胶浓度5% 7.5% 10% 12.5% 15% 凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2 水ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.7 10% SDS ml 0.3 10% 过硫酸铵ml 0.1 TEMED (μL) 20 将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形
聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺在回收贵重金属金、银、镍、铜等重金属中的贡献 聚丙烯酰胺产品作为提取重金属原料絮凝沉降剂用，这种废水一般来至于电镀厂、电子元器件厂、电子厂的废料或下脚料以及插头插件等，废水水质情况一般比较简单，提取这些金属一般采用湿法无毒提金方法，一般要用到硝酸、硫酸、絮凝剂等药品，提金过程中需要加热，加热方式可以采用电炉或煤炉加热；对于一些电子元件提金，需要进行粉碎，小规模生产粉碎工具可以自制，，大规模生产可以采用粉碎机或破碎机。提取这些金属的最关键点是货源，要有总够多的含金量高的废液，这些提取金属的方法一般都比较简单，电解回收法、金属置换法及化学沉淀法是常用的方法。 金属废液成分主要是含黄金和铜 把混合金属放入硝酸和盐酸组成的混合物（混合比例为1:3）俗称“王水”里，几分钟后，金溶解到王水里，只剩下铜了，把溶解液用坩埚把水蒸发了就得到金，另外用硫酸去腐蚀溶解金属，铜就溶解掉了，剩下的就是金了。 有这么一个情况，我们主要是做固体粉末状的聚丙烯酰胺产品，有很多多客户买去，溶解成液体，然后作为另外一种商品去销售，现遇到这么个情况，按照一定的比例溶解后，搁置一天后，聚丙烯酰胺溶液呈现分层现象，上面液体相对粘度要比下面的粘度要低很多，如果在正常现配先用的情况，这个问题不是问题，但作为另外液体商品，有的客户是做漆雾凝集剂，有的是作为造纸分散剂，有的是做造纸助滤剂，有的做建筑胶水用等等，但这样的客户可能就很难接受。有没有一种助剂可以加进去防止分层现象？ 生活污水处理厂，食品废水，选矿废水，还有比较特殊是蛋白废水处理 渗滤液虽然可生化性甚好，但其成份复杂，不仅浓度高，还会有诸多难生化降解有机物，单靠传统生化-物化方法不能处理到国家一级排放标准。正因为如此，许多地方不能达标排放而成为一项棘手的技术问题。 渗滤液中主要控制的污染指标是：COD(BOD)有机物、NH3-N氨氮、TN总氮、SS悬浮物、pH酸碱度等。还要考虑重金属离子和磷，会严重污染当地地表水和地下水。 其流程： 渗滤液收集池→生化系统→电催化氧化系统→排放 渗沥液处理工艺按流程可分为预处理、生物处理、深度处理和后处理(污泥处理和浓缩液处理)。应根据渗沥液的进水水质、水量及排放标准选择具体的处理工艺组合方式。主要的组合方式有以下几种： 1、预处理+生物处理+深度处理+后处理 2、预处理+深度处理+后处理
聚丙烯酰胺有什么用途
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体经自由基引发聚合而成的水溶性线性高分子聚合物。同时也是一种高分子水处理絮凝剂，由于可吸附水中的悬浮颗粒，在颗粒之间起链接架桥作用，使细颗粒形成比较大的絮团，并且加快了沉淀的速度。因此，现应用广泛，那么具体用途有哪些呢? 1、纺织印染行业 聚丙烯酰胺作为织物后处理的上浆剂、整理剂，可以生成柔顺、防皱、耐霉菌的保护层。利用它的吸湿性强的特点，能减少纺细纱时的断线率;也可以防止织物的静电和阻燃。用作印染助剂时，可使产品附着牢度增强、鲜艳度增高;也可以作为漂白的非硅高分子稳定剂;此外，还可以用于纺织印染污水的高效净化。 2、市政生活污水 在生活污水处理中，聚丙烯酰胺借着电性的中和及其本身所具有的吸附架桥作用，可促使悬浊粒子快速的凝集沉降达到分离，澄清的效果。现主要使用于污水处理厂的前段絮凝沉降和后段污泥脱水。 3、酒精行业
一般情况聚丙烯酰胺主要应用于后段污泥脱水过程，一般这种情况选择阳离子聚丙烯酰胺，选择何种离子度阳离子聚丙烯酰胺与生产酒精时采用何种原料?何种废水处理的工艺?以及污泥的PH值有关，具体情况一般建议做实验室烧杯实验选型。 4、电子、电镀行业 常用处理工艺在第一反应池中先将废水用硫酸调pH值至2～3，再加入还原剂，在下一个反应池中用NaOH或Ca(OH)2调pH值至7～8，生成Cr(OH)3沉淀，再加混凝剂，使Cr(OH)3沉淀除去。 5、炼钢厂 主要是以氧气顶吹转炉烟气净化废水，通常称为转炉除尘废水。炼钢厂的转炉除尘废水的治理应着重解决悬浮物的冶理、温度的平衡及水质稳定问题。悬浮物的混凝沉淀处理需去除大颗粒的悬浮杂质，然后再进入沉淀池。在沉淀池的明沟里投加PH调节剂，并投加聚丙烯酰胺，使在沉降池里实现悬浮物和成垢物的共同絮凝沉淀，最后，在沉淀池的出水中投加阻垢剂。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及常见问题分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及常见问题分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS 和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋