分子生物学

1.分子生物学与所学专业的关系。

答：周围神经损伤的治疗是临床上的难题,神经损伤后功能恢复的结果取决于断端缺损是否较好地桥接修复.神经再生速度的快慢及再生轴索能否精确地长入原先支配的靶器官或功能相关的组织,随着显微外科学,材料学及分子生物学的发展,在神经缺损的桥接吻合及促进神经的再生方面取得了一定的进展,但神经功能恢复的效果仍然不理想,原因是再生的神经未能准确地选择性地再支配靶组织,运动终板和感觉神经末梢,即错向生长,感觉神经错向长入运动支的神经内膜管,运动神经错向长入感觉支的神经内膜管,神经错生长入瘢痕组织形成神经瘤。因此,充分理解神经再生趋化性的细胞和分子生物学基础,在治疗中运用神经再生趋化性理论,对促进神经功能恢复具有重要的意义.

2.分子生物学的发展过程，3-5个诺贝尔奖得主的贡献。

1962年，美国科学家Watson和英国科学家Crick因为在1953年提出DNA 的反向平行双螺旋模型获得诺贝尔生理学或医学奖。

1962年，Wikins因对DNA分子的X射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA分子模型。

1968年，美国科学家Nirenberg由于在破译DNA遗传密码方面的贡献获得诺贝尔生理学或医学奖。

1984年，德国人Kohler，美国人Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理学或医学奖。

2009年，澳籍美国科学家E.Blacknburn由于揭示了端粒和端粒酶在保护染色体免遭降解方面的贡献，获得诺贝尔生理学或医学奖。

发现DNA合成酶的是：

1957年，美国科学家Arthur Kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶，这种酶被称为DNA聚合酶I（简称：Pol I）。1970年，德国科学家Rolf Knippers发现DNA聚合酶II（Pol II）。随后，DNA聚合酶III（Pol III）被发现。

3.人类基因组计划为什么能促进分子生物学进步。基因组（Genome）：是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细

胞内全部DNA分子的总和。人类基因组：3.2×109 bp

人类基因组计划的科学意义：1. 确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。

2. 了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观

水平上理解基因转录与转录后调节。

3. 从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序

列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。

4. 研究空间结构对基因调节的作用。

5. 发现与DNA复制、重组等有关的序列。

6. 研究DNA突变、重排和染色体断裂等。

7. 确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围

序列的性质。

8. 研究染色体和个体之间的多态性。

4中心法则，复制，转录和翻译的定义，中心法则会发生改变吗？

答案：中心法则(genetic central dogma)，是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）是对中心法则的补充。

①DNA 复制

亲代DNA分子在DNA 聚合酶等酶的作用下，分别以每条单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基互补配对的游离dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全形相同的子代DNA分子的过程。

②转录：转录是遗传信息由DNA转换到RNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是mRNA以及非编码RNA（tRNA、rRNA等）的合成步骤。

③翻译：以mRNA为模板，在核糖体上由tRNA解读，将贮存于mRNA中的密码序列转变为氨基酸序列，合成多肽链的过程。P471

中心法则的补充：

1. 有人在一些离体实验中观察到，一些与蛋白质合成抑制剂类抗生素

如新霉素和链霉素，能扰乱核糖体对信使的选择，从而可以接受单链DNA分子代替mRNA，然后以单链DNA为模版，按核苷酸顺序

转译成多肽的氨基酸顺序。另外还有研究表明，细胞核里的DNA可以直接转移到细胞质中的核糖体上，不需要通过RNA也可以控制蛋白质的合成。

2. 中心法则的扩充：

a. 蛋白质有自剪接现象，与mRNA相同，一些蛋白质前体具有内含

子（intein）序列，多肽序列中间的某些区域被加工切除，剩余

部分的蛋白质外显子（extein）重新连接为蛋白质分子。

b. 蛋白质可作为ＤＮＡ复制模板，一种叫Rev1 DNA聚合酶的蛋白

质，它可以为DNA复制提供编码信息。新发现的蛋白质可以以

自身为模板在复制链上加一个胞嘧啶，这个胞嘧啶无论鸟嘌呤是

否在DNA链中存在都会被Rev1加上去的，在DNA复制时可以利

用一条单链，根据碱基配对原则复制出新的DNA链。细胞利用

这种崭新的机制在含有致癌物质的情况下对受损的DNA进行复

制。这是第一次发现蛋白质可以作为一种合成DNA的模板。

c. 朊病毒是通过改变其他蛋白质的构象来进行自身精确复制的一类

蛋白质。也就是：蛋白质→蛋白质。

　克里克说：虽然本文所提出的各类法则看来是可靠的，可是我们对分子生物学的认识，即使只是一个细胞—更不用说大自然里的整个生命体—仍然远远未完备到，足以让我们把它当成教条一样肯定正确的程度。

5. PCR，原位杂交，southernblot，northernblot，westernblot，免疫共沉淀原理

⑴PCR原理：变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。

⑵分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类： ① Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA 或RNA。

② Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或

RNA。

Southern杂交原理和步骤

原理：将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤

的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

步骤：

Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤:

1) 用限制性内切酶酶切DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段；

2) 转膜：将DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；

3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点；

4) 杂交：让探针与同源DNA片段特异性结合；

5) 洗脱：去除非特异性结合的探针；

6) 自显影检查目的DNA所在的位置。

（3）Western Blot一般称为蛋白质印迹。

原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

⑷免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）该技术核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。首先，将靶蛋白的抗体通过亲和反应链接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心沉淀或微膜过滤法将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。如果靶蛋白与待筛选蛋白发生了相互作用，那么这个待筛选蛋白就通过与复合体结合而被分离出来。

6文库的定义，DNA文库，cDNA文库的建立过程及用途。

答案：P183，

基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。

DNA文库：用限制性内切酶酶切整个基因组DNA，把所得到的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。是某个生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。

cDNA文库：①cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。

②由某个生物体的某个器官或组织mRNA反转录形成的总cDNA，构建形成的基因文库，称之为cDNA文库（任选其一）

基因组文库的构建过程：

1）从生物体提取大片断的基因组DNA；

2）用适当的限制性内切酶（常为4碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组DNA ；

3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的DNA片断（根据载体的要求）；

4）载体的酶切、回收；

5）将处理好的基因组DNA片断与载体连接；

6）将重组子导入宿主细胞

7）文库的鉴定、收集、保存

构建cDNA文库的一般步骤：

1）总RNA（total RNA）提取

2）mRNA的分离纯化

①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。

② mRNA的分离纯化 Column（柱）

3）cDNA的合成

① cDNA第一链合成

②降解mRNA模板

③cDNA第二链合成（cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。）

4）cDNA与载体连接：

5）噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖）

建立DNA文库的目的：从复杂的基因组中分离基因。

（百度百科答案，可自行修改）

基因文库应用：①建立和使用基因文库是分离基因，特别是分离高等真核生物基因的有效手段

②可以应用在个体发育的研究中。例如从芽孢杆菌的正在形成芽孢的菌体中分离mRNA，并用同位素标记做成探针，用这些探针可以从芽孢杆菌的基因文库中分离出只在芽孢形成过程中活动的基因，有助于对发育过程中基因调控进行研究。

③基因文库也可以应用在高等生物，例如人的基因定位工作中。基因文库在生产实际中也是取得所需要的基因的一种重要方法。

7.分子克隆流程原理。

在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

分子克隆可以分为以下几个步骤：

1）带有目的基因的DNA片段的获得

2）重组DNA分子的构建

3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选

4）特定重组克隆的鉴别

（自己写的，不对的话，请修改）

流程：设计引物→PCR→琼脂糖凝胶电泳→回收DNA→双酶切→琼脂凝胶电泳→割胶回收DNA→连接→转化→振荡培养（1h）→涂板→ 37℃培养箱培养（14-18h）→提质粒→酶切所提质粒→琼脂糖凝胶电泳查看是否有目的条带→送去测序（有目的条带）

8.DNA模型建立时间及人物

1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制