温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响

（间接碘量法）

（effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme）

一、目的

1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响

2.学习酶活性的判定

二、原理

酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。酶活性大，反应速度就快。反之则慢。酶促反应速度受多种因素的影响。如温度、pH、激活剂、抑制剂等。

本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。借以验证各种因素对酶活性的影响。

唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。麦芽糖具有还原性。根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。

具体反应如下：

1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO4、Na2CO3、NaHCO3、KI、KIO3、酒石酸钾钠、草酸钾。

2、判定酶活性大小的化学反应过程：

Na2CO3 ＋2H2O —→2NaOH ＋H2CO3

CuSO4＋2NaOH —→Cu(OH)2↓＋Na2SO4

5KI ＋KIO3 ＋3H2SO4—→3I2＋3K2SO4 ＋3H2O

酶

淀粉———→麦芽糖麦芽糖＋Cu++—→麦芽糖氧化产物＋Cu+

Cu+＋I2—→Cu++ ＋2I-

COO- 草酸钾COO-

Cu++＋|—————→| >Cu

COO- 防止逆反应COO-

剩余I2 ＋Na2S2O3 —→2I- ＋Na2S4O6

（与淀粉呈兰色) （与淀粉无色)

3、判定酶活性大小的标志

酶活性大→麦芽糖多→Cu+ 生成量多→I2 消耗量多→

剩余I2少→Na2S2O3 消耗量少

酶活性越大，Na2S2O3 消耗量越少。空白实验无酶活性，因此Na2S2O3 消耗量

最多。与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。

三、实验用品：

（一）器材

1.中试管16支。

2.试管架1个。

3.恒温水浴箱1台。

4.温度计1支。

5.50ml量筒1个。

6.吸管：0.5ml 1支，1ml 2支，2ml 1支，5ml 1支，10ml 1支。

7. 25ml、100ml烧杯各1个。

8.电炉子一个。

（二）试剂

1.2% 淀粉溶液

2.1N NaCl溶液：称取58.5gNaCl，溶于1000ml水中。

3.磷酸盐缓冲液

甲液：称取Na2HPO4·12H2O 23.9g溶于1000ml水中，既为M/15 Na2HPO4溶液，此溶液pH为8.5。

乙液：称取KH2PO49.08g溶于1000ml水中，既为M/15 KH2PO4溶液，此溶液pH为4.5。

取甲液37.5ml，乙液62.5ml，两液混匀后既为pH 6.6磷酸盐缓冲液。

4. 0.01% HgCl2。

5.1N H2SO4溶液：取水约250ml，加入浓H2SO4 28ml，稀释至1000ml。

6.Shaffer-Hartman-Somogyi试剂（S、H、S试剂）

溶液A：结晶硫酸铜（CuSO4.5H2O）6.5g溶于100ml水中。

溶液B：酒石酸钾钠12g，无水碳酸钠20g，碳酸氢钠25g溶于500ml水中。

溶液C：碘化钾10g，碘酸钾0.8g，草酸钾18g溶于300ml水中。

将溶液B倒入溶液A中混匀，再倒入溶液C混匀后定容至1000ml。

7.标准0.005N Na2S2O3溶液：取硫代硫酸钠（Na2S2O3.5H2O）25g溶于1000ml 水中。此溶液浓度约为0.1N ，其准确浓度须用碘酸钾标准方法标定。（方法略）取已调整至0.1N 标准Na2S2O3溶液50ml稀释至1000ml即为0.005N。

四、实验步骤：

1、制备稀释唾液：收集唾液于小烧杯内，吸取下层唾液0.5ml（要求无气泡）加入量筒内，用蒸馏水稀释至25ml，混匀备用。

2、取中试管8支，标号0—7，0号为空白对照，1-3号为测定温度对酶活性的影响，4-5号为pH对酶活性的影响，6-7号为激活剂和抑制剂对酶活性的影响

按下表操作。加入试剂及唾液后各管充分混匀。

影响因素管号淀粉NaCl 缓冲溶液H2O 温度稀释温度

（ml）（ml）pH ml ml 时间唾液时间空白0 4.0 2.0 6.6 2.0 3.0 37℃10ˊ-- 37℃20ˊ

温度的 1 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 37℃10ˊ0.5 37℃20ˊ

影响 2 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 10℃ 10ˊ0.5 10 ℃20ˊ

3 4.0 2.0 6.6 2.0 2.5 80 ℃10ˊ0.5 80℃20ˊpH值的

4 4.0 2.0 4.

5 2.0 2.5 37℃ 10ˊ0.5 37℃20ˊ影响 5 4.0 2.0 8.5 2.0 2.5 37℃ 10ˊ0.5 37℃20ˊ激活剂

6 4.0 — 6 .6 2.0 4.5 3

7 ℃10ˊ0.5 37℃20ˊ抑制剂7 4.0 HgCL2 6 .6 2.0 2.5 37 ℃10ˊ0.5 37℃20ˊ的影响（2ml）

3、充分混匀后开始保温，保温后立即由各管吸取2ml分别加入已预先加入2ml S、H、S试剂相应号码的试管中，并充分混匀。

4、各管放入沸水中加热8分钟。

5、向各管加入1N H2SO4 2ml，轻轻摇动至不产生气泡为止。

6、以0.005N Na2S2O3滴定各管，至蓝色消退为止。并记录结果。

7、由零号试管消耗Na2S2O3 ml数分别减去其余各管所消耗ml数，以此结果判定各种因素对酶活性的影响。

五、实验结果与分析（略）

思考题：

1.本实验判定酶活性大小的化学反应过程是什么？为什么酶的活性越大，消耗Na2S2O3越少？

3.加入H2SO4的作用是什么？

3.根据实验结果分析温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响。

生物技术实验教学中心