色谱法概论

第一节：概述
一、色谱法的由来
1903年俄国植物学家茨维特 （Tsweet）将CaCO3装入竖直的玻璃 管，在顶端加入植物色素后，用石油 醚进行洗脱，在管的不同部位形成不 同颜色的色带，1906年在其发表的论 文中将其命名为色谱 （chromatography）。
色谱分析法概论
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固定相（stationary phase）：固定不动的 一相，成为固定相 流动相（mobile phase）：携带样品流经 固定相的流动体，称为流动相
二、色谱法的现在
现在：一种重要的分离、分析技术 分离混合物各组分并加以分析 固定相——除了固体，还可以是液体 流动相——液体、气体或超临界流体 色谱柱——各种材质和尺寸 被分离组分——不再仅局限于有色物质
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三、色谱法的定义和用途
（一）定义： 同一时刻进入色谱分析系统的混合物，与固定相和流动相发生 相互作用，由于各组分理化性质不同，混合物被分离，然后依次流 出分析系统，进而进行定性和定量分析的方法。 色谱法又称为层析法
（二）用途 1、分离混合物 2、进行定性和定量分析
分离
? 分析 ? 鉴定 ? 纯化
混合物
单一组分
? 定量
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四、色谱法特点
（一）优点：“三高”、“一快”、“一广” 1、高选择性——可将性质相似的组分分开 2、高效能——分离效果 3、高灵敏度——10-11~10-13g 4、分析速度快——几~几十分钟完成分离 5、应用范围广——气体，液体、固体物质化学衍生化再色谱分离、 分析 （二）缺点：对未知物分析的定性专属性差，需要与其他分析方法 联用（GC-MS,LC-MS）。
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第二节：色谱过程和基本原理
一、色谱过程
由于结构和性质的不同，样品各组分与固定相作用的类型、强 度也不同，结果在固定相上滞留时间的长短也就不同，或被流动相 携带移动的速度不同，即产生差速迁移，因而被分离。
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二、色谱流出曲线和有关概念
（一） 色谱流出曲线和色谱峰 1、色谱流出曲线 （chromatogram）：检测器输出的信号强度对时 间作图所绘制的曲线，又称色谱图。
色谱过程示意图
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2、基线（baseline） 是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线，稳定的基线应 该是一条平行于横轴的直线 基线漂移 基线噪音
3、色谱峰 （1）流出曲线上突出的部分，是组分流经检测器时产生的信号 （2 ）表征色谱峰的三项参数： 峰高或峰面积——用于定量分析 峰位——用保留值表示，用于定性分析 峰宽——用于衡量柱效 （3）峰型： 正常峰——正态分布 拖尾峰——前陡峭后缓慢 前延峰——前缓慢后陡峭
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（4）对称因子（symmetry factor，fs）
（二）保留值
1、保留时间（retention time;tR）：从进样到组分在柱后出现浓度极 大时的时间间隔，即从进样开始到组分色谱峰顶点的时间间隔。 2、死时间（dead time;t0）：分配系数为零的组分即在固定相上没有 保留组分到达检测器的时间 3、调整保留时间（adjusted retention time; tR’）被固定相保留的组分 比不保留的组分多停留的时间
W ( A + B) f s = 0.05 h = 2A 2A
正常峰：对称因子0.95～1.05 拖尾峰：对称因子>1.05 前延峰：对称因子<0.95 A
Wh/2 0.05h W0.05h B
h
t R ' = t R ? t0
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4、死体积（dead volume;V0）
V0 = t0 Fc
R
5、保留体积（retention volume;VR） V
= tR Fc
6、调整保留体积（adjusted retention volume; VR’）
VR ' = VR ? V0 = t R ' Fc
Fc——流动相的体积流速
R2 R2 7、相对保留值（relative retention; r） r = t ' = V ' R1 R1
t'
V'
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（三）色谱峰高和峰面积 峰高（peak height; h） 峰面积（peak area; A）
（四）色谱峰区域宽度 有三种表示方法： 1、标准偏差（σ）：0.607h处的峰宽度 的一半 2、半峰宽（W1/2）：峰高一半处的宽 度 3、峰宽（基线宽度）（W）： W =1.699 W1/2
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（五）分离度（Resolution, R） 反映组分在色谱中的分离情况
R = tR (W
1
2
R=0.75
? t R1 )
2
? t R1
2
+ W
) / 2
t R2
=
2 (tR W
1
2
+ W
R=1
t R1
R=1.5
W1
W2
定量分析时，规定R≥1.5（2005版药典）
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分离度计算示意图
三、分配系数和色谱分离
（一） 分配系数和保留因子 1、分配系数K：在一定的温度和压力下，达到分配平衡时组分在固 定相（s）和流动相（m）中的浓度比
分配系数讨论： 与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 实验条件固定，K仅与组分性质有关; 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢，保留时间越 长； 组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。
C K = C
s m
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2、保留因子k：在一定温度和压力条件下，达到平衡时，组分在固 定相和流动相中的质量之比。（又称质量分配系数或分配比或容量 因子）
（二）保留因子与保留时间的关系
k=
ms CV = s s mm CmVm
k =
tR ? t0 t′ = R t0 t0
3、分配系数K和容量因子k的关系
k值越大，保留时间越长
k=K
Vs Vm
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（三）色谱分离的前提 分配系数（保留因子）不相等是色谱实现分离的前提 K（k）相同，样品组分在色谱柱上保留时间相同 K（k）相差越大，越容易实现分离
第三节：基本类型色谱方法及其分离机制
一、色谱法的分类
（一） 按流动相与固定相聚集状态分类 气体：GC Gas chromatography 流动相 液体：LC 气固色谱法 气液色谱法
液固色谱法 Liquid chromatography 液液色谱法 超临界流体：SFC Supercritical fluid chromatography
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（二） 按操作形式分类 GC 柱色谱法 操 作 形 式 平面谱法 HPLC SFC 纸色谱( PC) （paper chromatogrpahy） 薄层色谱(TLC) (thin layer chromatography) 薄膜色谱 毛细管电泳法
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经 典 柱 色 谱 柱 G C 毛 细 管 柱
H P L C 柱 制 备 型 柱 分 析 型 柱
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毛细管电泳法
纸色谱装置 TLC薄层板及展开装置
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（三）按分离机制分类 分配色谱法： 吸附色谱法： 分离机制 利用分配系数的不同 利用物理吸附性能的差异
二、分配色谱法
利用被测组分在固定相和流 动相中溶解度差别实现分离，即 在两相中的分配系数差别实现分 离。 气液分配色谱 液液分配色谱
离子交换色谱法： 利用离子交换原理 空间排阻色谱法： 利用排阻作用力的不同 其它方法：亲和、手性色谱法等
载体
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固定相
样品分子
流动相
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分配系数K
三、吸附色谱法
利用被测组分对固定相表面吸
K=
各组分分配 系数不同
Cs Cm
随流动相迁 移速度不同 各组分 分离
附中心的吸附能力差别实现分离 气固吸附色谱法 液固吸附色谱法 流动相
在固定相中溶解度大的组分迁移速度慢， 溶解度小的组分迁移速度快
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固定相（吸附剂）
样品
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吸附系数Ka
[ X a ]为溶质分子在吸附剂表面的浓度 [ X m ]为溶质分子在流动相中的浓度 S a为吸附剂表面面积 Vm为流动相的体积
四、离子交换色谱法
利用被测组分与固定相（离子交换树脂）离子交换能力的差别 而实现分离 选择性系数Ks
[ X ][Y ]n X S Ka = a m n = a a [ X m ][Ya ] X m Vm
各组分吸附 能力不同 吸附系 数不同
Ks =
随流动相迁 移速度不同 各组分 分离
[ RX + ] [X +]
（阳离子交换树脂） 各组分 分离
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在吸附剂上吸附能力强的组分迁移速度 慢，吸附能力弱的组分迁移速度快
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组分离子交 换能力不同
选择性系 数不同
随流动相迁 移速度不同
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五、分子排阻色谱法
根据样品分子的大小进行分离 渗透系数Kp
六、不同色谱法比较
分离方法 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱 分离原理 溶解性 吸附性 电荷强度 扩散性 相平衡常数 分配系数 吸附系数 选择系数 渗透系数 广义分配系数 在一定的温度和压力 下，分配达到平衡时 组分在固定相和流动 相中的浓度比
[X ] Kp = s [Xm]
各组分大小 不同 渗透系 数不同 随流动相迁 移速度不同 各组分 分离
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第四节：色谱法的发展概况
一、发展历史
始于20世纪初茨维特分离色谱； 30年代相继出现了薄层色谱与纸色谱； 1941年，Martin和Synge发现液液分配色谱法，并于1952年获得 Nobel奖 1952年Martin和James创立气液色谱法，50年代建立了各种气相色 谱法和色谱理论
60年代气相色谱-质谱联用； —气相色谱法的鼎盛时期-石油工业的需要 70年代高效液相色谱； 80年代末超临界流体色谱、高效毛细管电泳
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二、发展趋势
新型固定相 新型检测器 色谱新方法：HPCE、CEC、μ-TAS、lab-on-chip 色谱联用技术 色谱——光谱联用 色谱——色谱联用
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