牛的遗传多样性

第11章牛的遗传多样性

11．1 概述

牛属（Bos）共有7个现生牛种（taurina），即普通牛（Bos taurus）、瘤牛（Bos indicus）、爪哇牛（Bos bangteng或Bos javanicus）、〔牛曷〕牛（Bos gaurus）、牦牛（Bos grunniens）、野牛（Bos bison）和大额牛（Bos frontalis）。在这些牛的野生祖先中，Bos bison和Bos frontalis 是野生类型，欧洲野牛（Bos bonasus）已灭绝，除美洲野牛仅有野生种之外，其他牛都有自己的已被驯化的后代。

我国牛属品种间和品种内的遗传多样性，特别是细胞和分子水平上的多样性研究是一个薄弱的环节，以往的工作主要集中在体型、外貌、生理指标、地理分布和生态条件等特点，以及历史文物资料等方面。在现有的工作中，也只是对黄牛的遗传多样性研究作了较多的工作。

在我国，黄牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛，属于偶蹄目（Artiodactia）牛科（Bovidae）牛属（Bos）中的牛种（taurina）（邱怀等 1986）。黄牛的起源、演化和分类一直受到畜牧学家的关注。许多学者认为黄牛的起源是多元的，可以归纳为3个系统：普通牛系即无峰牛（Bos taurus），印度牛系即有峰牛（Bos indicus），中间牛系或巴厘牛系（Bos javanicus或Bos bangteng）是封闭在印度尼西亚的爪哇和巴厘岛上的Bangteng牛小型化的有峰牛（Kikkawa 1995）。Bos taurus和Bos indicus的祖先原牛（Bos primigenius）是相似的。

中国黄牛一直被中外学者认为是瘤牛（有肩峰）与普通牛（无肩峰）的混血种。陈宏、邱怀等（1993）对我国一些黄牛Y染色体多态性的研究发现，南方黄牛在系统发育过程中受瘤牛的影响大，北方黄牛受普通牛的影响大，中原黄牛介于两者之间。陈幼春等（1990）根据6种血液蛋白多态性座位、体态特征和毛色等的研究认为，我国黄牛不但具有普通牛和瘤牛的混合血统，同时还含有位于印度尼西亚爪哇牛的血统，该血统主要分布在中国的岭南地区和东南沿海；另外，南方肩峰牛有可能源于与印度瘤牛不同的其他肩峰牛的祖先，而不单单是瘤牛。王毓英等（1991）在南阳牛中发现了Tf A1基因，说明我国黄牛中可能还含有非洲瘤牛的血统。

看来我国黄牛起源复杂，其遗传基础非常丰富。同时由于我国地域辽阔，生态环境差异很大，适应不同生态环境的地方黄牛品种具有丰富的遗传多样性。中国地方黄牛是我国固有的，干百年来形成了能够适应当地的生态环境和社会经济状况的土著牛品种。我国现有地方黄牛品种28个，另外，还存在其他一些地方类群（或品种）（常洪 1988，1991；邱怀等 1986）。

在《中国黄牛品种志》中（邱怀等1986），中国的黄牛按照地理分布被分为北方黄牛、__________________________

本章作者：聂龙，陈永久，兰宏，张亚平，文际坤，俞英，杨关福，张细权

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中原黄牛和南方黄牛三大类型。云南黄牛属于南方黄牛类型。一般认为云南黄牛和中原黄牛一样，起源于亚洲原牛（Bos taurus homadicus），在未驯化之前的进化过程中可能已有分化，同时又与瘤牛有一定的血缘关系，可能两者都参与了云南黄牛的形成。此外，云南还分布有起源尚未确定的大额牛（也叫独龙牛）。

云南黄牛从肩峰、垂皮来看，由南向北逐渐变小。滇南黄牛肩峰高，垂皮长，与瘤牛相似。滇东北黄牛与滇西北黄牛形态上则与普通黄牛较为接近，但肩峰仅是一个由结缔组织、皮下组织和脂肪等组成的组织实体，有峰牛和无峰牛在骨胳结构上并没有差异。肩峰的高低只能作为牛种鉴别的一个辅助参考指标，从形态上严格区分瘤牛和普通黄牛是很困难的（黄启昆等 1987）。

云南是我国生物多样性保存较好的地区，牛的数量丰富、品种众多，开展云南牛遗传多样性调查对牛资源的合理改良和利用有着重要的意义。

本文重点总结我们实验室近年来研究我国一些地方黄牛品种在染色体多态、血液蛋白质多态和线粒体DNA限制性片段长度多态等方面的遗传多样性进展。

11．2 牛的染色体多态

家畜的染色体研究始于本世纪20年代，1927年，Kralinger就已确定牛（Bos taurus）的染色体数目为2n＝60。很多学者对我国部分地方黄牛品种进行过一般核型、G带和Ag-NORs 等方面的研究（单祥年 1980a，b；曾养志 1984；于汝梁等 1991；陈宏等 1993）。我国黄牛公牛核型为2n＝60，XY；母牛为2n＝60，XX。58条常染色体均为近端着丝粒染色体，X染色体为大的亚中着丝粒染色体。

研究发现，我国黄牛Y染色体形态具有明显的多态性，Y染色体着丝粒位置分别是中部（或亚中部）和近端。瘤牛（Bos indicus）为近端着丝粒Y染色体，普通牛（Bos taurus）为中部或亚中着丝粒Y染色体（Potter等 1979）。中国黄牛Y染色体呈现多态，说明中国黄牛含有瘤牛、普通牛的血缘。看来，Y染色体形态体现了牛种的特征，是黄牛品种的父系起源及类型研究的重要依据之一。

兰宏等（1993）对来自云南省昆明市牛羊肉类联合加工厂的15头黄牛、来自云南省贡山县独龙江地区的1头大额牛和来自昆明市西山区国营三家村农场的2头昆明黑白花奶牛进行了染色体核型研究。结果表明，Y染色体具有端着丝点和亚中着丝点两种类型。所有研究的黄牛的Y染色体都是端着丝点，未发现具有亚中着丝点Y染色体的黄牛。这一结果与冯蜀举等（1991 个人交流）的研究一致。但冯蜀举等根据Y染色体的研究认为，云南黄牛全部是瘤牛。这一结论显然值得商榷。蛋白质多态性的研究结果已证明云南黄牛同时具有瘤牛和普通黄牛的血统（陈幼春等 1990），只是以前形态分类和蛋白质研究都认为在云南黄牛中普通牛的血统是主要的，而mtDNA分析结果则提示在云南黄牛中瘤牛的血统可能是主要的（兰宏等 1993）。所有研究的黄牛都具有端着丝点Y染色体，而大额牛和昆明黑白花奶牛Y染色体则是亚中着丝点（表11-1）。

最近，文际坤、俞英等采用常规外周血淋巴组织培养、染色体核型、C带、G带和Ag-NORs 对云南省文山黄牛、迪庆黄牛、德宏黄牛和德宏瘤牛的染色体进行比较研究，结果表明：4个云南地方牛种的常染色体及X染色体均无明显差异，但Y染色体的形态和C带具有多态性，

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每细胞Ag-NORs数也有一定变化。文山黄牛和德宏黄牛可能主要是瘤牛起源，迪庆黄牛可能主要是普通牛（Bos taurus）起源。

C带可以鉴别染色体上的结构异染色质，一般认为C带的分布和大小反映了结构异染色质的分布和含量，结构异染色质是一种能够促进核型进化的遗传物质。云南四地方牛种的58条常染色体着丝粒区均为C带阳性、臂均浅染，X染色体着丝粒区均为C带阴性。Y染色体多态性上文山黄牛有别于其他3种牛，其Y染色体着丝粒区C带阴性，而出现臂端插入异染色质。迪庆黄牛、德宏黄牛和德宏瘤牛整条Y染色体呈现弱阳性C带。因此，Y染色体的C 带多态现象反映了文山黄牛在遗传进化中与其他3种牛存在一定的差异，其臂端特有的异染色质是否在该牛种的进化过程中起特殊作用还有待进一步研究。

银染技术是特异显示核仁组织者区的有效方法之一，核仁组织者区代表的是有活性的rRNA基因位点。我国黄牛Ag-NoRs数目除了在不同个体和不同品种间有一定的差别外，Ag-NORs分布的染色体也有变化。云南4种牛的每细胞Ag-NORs数的变化反映了它们在这一遗传特点上的差异。

11．3 同工酶和蛋白质多态性

由于现代遗传学和生物化学技术的发展，已有可能根据动物的某些基因频率去探索品种间的亲缘关系。自60年代开始，蛋白质电泳技术成为检测遗传变异的主要方法。目前，蛋白电泳技术作为遗传多样性及品种鉴定的研究手段之一，已经在家养动物中得到了广泛的应用，

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并取得了一系列有意义的结果。

黄牛（Bos taurus）的血液蛋白多态性研究工作在当今较为引人瞩目。中国农业科学院畜牧研究所（陈幼春等 1990）以6种血液蛋白位点26个等位基因频率以及Y染色体的形态特征，并结合表型特征、体型、毛色、体尺测量结果及中外历史记载和文物考证等，对中国20个主要黄牛品种进行了生化遗传学分析，为中国黄牛的起源和各品种的相互关系提供了重要资料。

但总的来说，近年来国内学者利用血液蛋白多态性对中国黄牛进行的研究一般仅选用少数几个多态座位。Gorman和Renzi（1979）认为，对于杂合度和遗传距离的计算，所检测的座位数目远比样本数目重要，座位数目越多（＞30），其可靠程度越高。

11．3．1 独龙牛的蛋白质多态性

独龙牛（Bos frontalis），又名“大额牛”，产于云南省西北部的贡山独龙族怒族自治县独龙江流域，是一种为数很少的半野生半家养的珍贵畜类（黄启昆等 1987）。由于独龙牛四肢下部全为白色，故当地俗称“白袜子”。据权威老人介绍，独龙牛饲养的历史有近200年，独龙江地区生产方式非常落后，牲畜的交配完全靠自然本交，但据当地的科技工作者多年来的调查，发现独龙牛和黄牛的交配是很难受孕的，故一般将独龙牛作为一个独立的种。过去国外的许多动物学家曾误认为独龙牛是印度野牛的家养型。独龙牛在国外仅分布于印度阿萨姆邦、东孟加拉和与中国云南省贡山县毗邻的缅甸北部钦邦等（曾养志等 1979）。到1993年底，贡山县独龙牛总存栏数达到396头，其中选出190头较优秀的集中繁殖，重点保护，其余分散饲养；福贡县独龙牛存栏头数达到54头，加上出售、屠宰及意外死亡头数，实际群体达到106头。独龙牛饲养量缅甸多于我国。

独龙牛常野牧于陡峭的山坡丛林之中，体质大，肉质细嫩，对恶劣的自然环境具有很好的抵抗能力，性情比野牛温驯，是有待进一步开发的宝贵的动物遗传资源。有关独龙牛的研究资料甚少，尤其在分子水平研究方面。在遗传多样性遭受毁灭性威胁的今天，从保护动物资源的角度上看，对独龙牛这一具有体壮、力大、耐寒、耐粗饲等特点的牛种进行遗传多样性的调查和评估的任务尤为迫切。

聂龙等（1995）运用水平淀粉凝胶蛋白质电泳技术，从酶基因的角度对独龙牛遗传多样性及其种群遗传结构进行了研究。该研究对分别来自云南省贡山县和福贡县的30头独龙牛群体进行了43个遗传座位的分析（表11-2）。通常用以衡量群体蛋白多态性的指标包括：多态座位百分比（P值）、平均杂合度（H值）和平均等位基因数（A值）（计算方法见Pasteur等1990）。根据表现型推断基因型，并由此计算相应的基因频率和平均杂合度，结果见表11-3。LDH、MDH等40个座位都是单态，只在Tf、EST、Amy-Ⅰ等3个座位中发现多态。且Tf 座位中，基因频率基本上相似，只有2个和4个个体分别发现D和E等位基因，其余24个个体带型皆一致。贡山和福贡独龙牛群体近年来虽然互无基因交流，但其同来自缅甸独龙牛群体，结合表11-3的数据，我们认为它们之间现在基本上无遗传隔离。

对蛋白多态性的研究表明，哺乳动物种内有一定水平的变异，其多态座位百分比和平均杂合度的平均值分别为P＝0.222，H＝0.050（Nevo等 1984），而一般大型走动的哺乳动物的H值则又相应略低。较低的H值反映出贡山和福贡独龙牛群体遗传结构单一，可能是其分别由小种群引种而来，受到所谓瓶颈效应（Bottleneck effect）的作用，并伴随有创立者事件（Founding event）的发生，使新的种群很难通过狭窄的通道——瓶颈而与原来的种群进行交

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流，因此具有较少的等位性或杂合性。独龙牛仅产于独龙江一带，其分布区域较为局限，遗传结构单调，H值较低（H＝0.0262），我们据此推测独龙江的独龙牛群体可能在历史上曾遭遇过严重的瓶颈效应。

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Amy-Ⅰ中，B等位基因频率明显高于A等位基因频率，原因是小种群的等位基因易受到遗传漂变的影响，A基因在一定程度上已受到随机漂变的作用。贡山群体Tf座位中无D和E 等位基因，一方面可能是受到遗传漂变的作用，D和E等位基因已丢失，另一方面也可能是该种群的抽样数较少，没有反映真实的情况。Gorman和Renzi等（1979）认为，对于杂合度和遗传距离的计算，所检测的座位数目远比样本个体数目重要，座位数目越多（＞30），其可靠性程度越高。但Archie等（1989）不赞同其增加座位数目可以弥补个体数不足即小样本（＜5）的说法。根据本文的数据，我们认为，对于亲缘关系较近的分类群，不但座位数要求＞30，个体数目同样也是重要的，作为有效群体，个体数应该至少大于20。因此，要调查整个独龙牛群体的遗传多样性，设计30个个体是合适的。

独龙江一带雨水充沛、牧草优良，是独龙牛适宜的自然环境。独龙牛群体纯度保持好，繁殖力高，抗病力强，适应在高山阴坡下放养，能在一般牛到不了的溪谷，陡峭的山坡草丛和林间地带出没，并能泅渡湍急的江水，其生存能力较强大。大怒江两岸的自然环境与独龙江一带相似，因此福贡县自1984到1989年先后共引入9头独龙牛进行纯种繁育，至1993年底，群体数达到100余头。这是一个成功的例子，说明选择优秀的独龙牛在适合的自然环境下进行繁殖是一种良好的保护策略。但是，贡山县和福贡县独龙牛由于近交等因素造成的遗传多样性贫乏，也将会导致该种群子代的遗传质量下降，使这一优良的种质资源受到严重的威胁。

遗传多样性是生命进化和适应的基础，种内遗传多样性越丰富，物种对环境变化的适应能力也越大，而遗传的均一性威胁种群或物种的生存已是明显的事实。例如遗传多样性的消失导致大熊猫在适应环境、繁殖和对疾病的抵抗力等方面的能力低下，以至陷于濒危的境地（宿兵等 1994）。因此，对于贡山县和福贡县的独龙牛群体，从遗传管理（Genetic management）和保护遗传学（Conservation genetics）的角度来说，我们认为有必要采取以下几点措施：①充分扩大有效种群大小。②避免过多的近亲繁殖，并且定期与其他独龙牛群体（如缅甸）交换，引进新的个体，保证群体间基因流（gene flow）的畅通，从而尽可能久地保存该物种的遗传多样性。

11．3．2 海南黄牛和徐闻黄牛的蛋白质多态性

海南黄牛和徐闻黄牛分布于海南岛和雷州半岛，由于其产地独特的生态地理环境和个体独特的体型、外貌，因此被认为是两个有代表性的中国黄牛南方品种，是研究中国黄牛起源、演化和分类不可缺少的素材。陈幼春等（1990）因海南黄牛的Tf的F基因在世界牛种中频率出现最高（高达0.848），而认为海南可能是世界牛属发源地之一。

由于海南隔离条件较好，海南黄牛和徐闻黄牛一直被认为是两个品种。由于雷州半岛原与海南岛相连，于第四纪发生断层形成琼州海峡后两地分开，因此有些学者认为，两地黄牛往来频繁，具有相似的生物学特征和品种特性，可合称为雷琼黄牛。在杨关福和李加琪等人（1990）的研究中，发现从海南黄牛和徐闻黄牛的毛色特征和6个血液蛋白基因频率分布有共同特征，这一结果为上述观点提供了佐证。

1995年，杨关福等运用淀粉凝胶电泳技术研究了15头徐闻黄牛、17头海南黄牛和24头荷斯坦牛血液蛋白的遗传多样性。在所分析的36种血液蛋白（酶）共计40个遗传座位中，徐闻黄牛和海南黄牛相同，有13个多态座位，荷斯坦牛有11个多态座位，其余为单态座位。徐闻黄牛和海南黄牛的多态座位百分比均为P＝0.325，徐闻黄牛的平均杂合度H＝0.141，海南黄牛的平均杂合度H＝0.132；荷斯坦牛的多态座位百分比P＝0．275，平均杂合度H＝0．099。

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研究结果表明，徐闻黄牛、海南黄牛和荷斯坦牛的遗传多样性相当丰富，可能是由于该家养动物群体数量大、遗传交流多和近交程度低。另外，在牛中随着选育程度的提高，多态座位百分比和平均杂合度都会有所降低。研究结果再次为把徐闻黄牛和海南黄牛合称为雷琼黄牛提供了佐证。

11．3．3 云南文山黄牛和迪庆黄牛的蛋白质多态性

俞英、文际坤等采用水平淀粉胶蛋白电泳技术分析云南文山黄牛和迪庆黄牛的33种血液蛋白及同工酶，共计37个遗传座位，其中两种牛的ALB、CAR、HB-β、NP、TF这5个座位和迪庆黄牛的6PGD座位具有多态性。文山黄牛的多态座位百分比P＝0.1389，平均杂合度H＝0.0610；迪庆黄牛P＝0.1667，H＝0.0711。通过Nei氏遗传距离计算，利用“CONTML”、“UPGMA”和“NEIGHBOR”法聚类得出：文山黄牛可能主要是瘤牛（Bos indicus）起源，与巴厘牛（Bos bangteng）可能也有一定的血缘关系；迪庆黄牛可能主要是普通黄牛（Bos taurus）起源。

11．4 线粒体DNA限制性片段长度多态性

进化速度快（约为单拷贝核DNA的5～10倍）、易于提取、较小的基因组、结构简单而稳定、在世代传递遗传过程中不会发生重组、无组织特异性、普遍地存在于真核生物以及严格的单性母系遗传方式等决定了线粒体DNA（mtDNA）是进化和群体遗传研究的有效标记物（张亚平等 1992；Nei 1987）。mtDNA多态分析，一般有限制性片段长度多态性（RFLP）和测序（sequencing）两条途径。RFLP又有限制性片段途径和限制性位点途径之分。限制性片段途径快速、经济，适用于近缘种及种内群体间的比较。目前家畜的mtDNA RFLP主要用于分析品种的起源、遗传分化以及亲缘关系等方面。

尽管蛋白质多态性研究为牛生态种（ecospecies）划分及亲缘关系鉴定提供了许多有意义的资料，但它只是根据群体内基因频率的不同来进行分析。由于蛋白质在遗传过程中会发生复杂的重组和杂合，因此只能用于作群体水平的研究，对于特定个体的鉴别则比较困难。

近年来，人们不断探索新的能用作牛生态种鉴定的指标，其中Y染色体形态的多态性引起了人们的注意。普通黄牛的Y染色体为亚中着丝点，瘤牛的Y染色体为亚端着丝点。因而通过检查Y染色体的形态，就可以确定某一特定个体的Y染色体是起源于普通黄牛还是来自瘤牛。但是由于Y染色体遵循父系遗传方式，因而这个指标只能用于调查牛生态种的父系起源。

在家畜遗传学中研究采用mtDNA限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）技术有两个优点：①mtDNA基因组织结构简单而稳定，在遗传过程中不发生重组，因而家畜mtDNA一般能保持其野生祖先的mtDNA类型，这使得我们可以通过研究家养动物的mtDNA来考查它的起源。②mtDNA在遗传过程中遵守严格的母系遗传方式，子代的mtDNA来自父本的可能性小于0．004％。同一母系祖先的子代其mtDNA都是一样的，因而一个个体的mtDNA类型就代表一个母系连锁群，这就减少了供试动物的数量。由此，mtDNA分析不像蛋白质基因频率分析那样需要调查大量的个体。

在牛的mtDNA遗传学方面，Watanabe等（1985）分析了日本黑奶牛（ Japanese black

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cow）、日本短角奶牛（Japanese shorthorn cow）和Holstein奶牛的mtDNA RFLP，建立了17个酶的限制性内切酶图谱后，发现其多态性非常贫乏，所有牛的限制性类型几乎一致。随后，Watanabe等人（1989）继续研究了9头菲律宾本地黄牛的mtDNA多态性，发现菲律宾本地黄牛中有两种类型的mtDNA分子。这两种分子在Bam HⅠ、Bg1Ⅱ、EcoR Ⅴ、Pst Ⅰ、SeaⅠ、Hind Ⅲ这6个限制性酶座位中存在差异，两者的遗传距离为0.095±0.040。5头黄牛的酶切类型全为B型，这5头牛被定名为菲律宾Ⅰ型；另外4头牛的限制性类型全为A型，被定名为菲律宾Ⅱ型。没有发现中间类型或重组类型。他们认为菲律宾黄牛群体中两种mtDNA分子的存在可能表明了菲律宾黄牛是亚洲黄牛和欧洲黄牛两种母系起源的混合血统。最近，Bhat等（1990）分析了Hariana牛（Bos indicus）和Holstein牛（Bos taurus）的mtDNA，发现Holstein牛的mtDNA类型与菲律宾Ⅰ型的相同（A型），而Hariana牛则与菲律宾Ⅱ型相同（B型）。

上述研究为鉴定牛种的母系来源提供了较为可靠的遗传学标记，即通过考察牛mtDNA在上述的限制性内切酶作用下所产生的限制性内切酶图谱，就可以判断该牛的母系起源是普通牛（Bos taurus）还是瘤牛（Bos indicus）。

11．4．1 云南黄牛和大额牛的线粒体DNA限制性类型

兰宏等（1993）运用mtDNA限制性内切酶片段长度多态（RFLP）技术对15头云南黄牛、1头大额牛和2头昆明黑白花奶牛进行了研究。所用的4种酶处理后均产生两种限制性类型：Bam HⅠ-A型具有9.8kb、3.2kb、1.9kb和1.4kb4条带，Bam HⅠ-B型具有11.2kb、3.2kb和1.9kb3条带；PstⅠ-A型只有一条16.3kb片段，PstⅠ-B型有9.4kb和7.0kb两条带；Bg1Ⅱ-A 型有一条16.3kb片段，Bg1Ⅱ-B型有9.7kb和6.6kb两条带；有的牛mtDNA有一个EcoR Ⅴ切点，有的牛没有切点，而所有的牛均有一个共同的SalⅠ切点，因此若用两种酶同时处理，则有一个EcoR Ⅴ切点的mtDNA将显示出两条带（分子量为11.1kb和5.2kb，定为EcoR Ⅴ-A型），没有EcoR Ⅴ切点的mtDNA只有一条16.3kb片段（EcoR Ⅴ-B型）。mtDNA限制性类型汇聚于表11-4。

120 中国动植物的遗传多样性11．4．1．1 昆明黑白花奶牛的限制性类型

我们在两头昆明黑白花奶牛中检测到了两种类型的mtDNA分子。第一头奶牛与瘤牛相同，第二头奶牛与普通黄牛相同。除了上述4种内切酶外，我们还以其他限制性酶（如EcoR Ⅰ，Hind Ⅲ，KpnⅠ，PvuⅡ，Sa1Ⅰ，Hind Ⅲ等）作消化处理，其中第一头牛的Hind Ⅲ限制性类型与Bhat（1990）报道的瘤牛的限制性类型相同，其余的酶与Watanabe等（1985）和Bhat等（1990）报道的酶切类型一致。这些酶的限制性座位在瘤牛和普通黄牛中没有差异。

根据史料记载，昆明黑白花奶牛的父本一般是荷兰公牛（Holstein）或外地已繁殖成功的黑白花奶牛的公牛，母本绝大多数是云南邓川黄牛，在品系形成历史过程没有混入其他母系品种，因此，我们认为这两头奶牛mtDNA的多态性最有可能反映了邓川黄牛在遗传上也具有瘤牛和普通黄牛两种母系起源。这一结果还有待于对邓川黄牛本身mtDNA的调查的证实。11．4．1．2 云南黄牛的mtDNA类型

我们的研究结果初步表明，云南黄牛与菲律宾黄牛一样，具有两种mtDNA分子。在我们研究的15头黄牛中，有5头显示普通黄牛的mtDNA类型，10头显示瘤牛的类型，从而mtDNA 分析的结果表明在云南黄牛中瘤牛的血统可能是主要的。值得指出的是，mtDNA显示的类型与肩峰高低没有对应关系（见表11-4），即没有肩峰的牛可能出现瘤牛的mtDNA，而肩峰牛中也有可能出现普通黄牛的类型。看来，以肩峰作为牛生态种鉴定的指标是不很合适的。

需要指出的是，由于我们研究的15头黄牛来自屠宰场，具体来自云南何处不得而知。因此，进一步研究云南省不同地区黄牛的mtDNA多态性无疑是十分必要的。

11．4．1．3 大额牛的mtDNA类型

由于材料来源的限制，我们只分析了一头大额牛的mtDNA，其限制性类型与瘤牛完全相同。由于这头牛的mtDNA类型至少可以代表大额牛的一个母系群体，因此可以推测大额牛在母系起源上与瘤牛有密切的联系。

关于大额牛的起源，文献资料十分贫乏。大额牛的染色体数目为2n＝58（单祥年等1980b），介于普通黄牛（2n＝60）、瘤牛（2n＝60）（单祥年等 1980）和野牛（Bos gaurus）（2n＝60）（陈宜峰等 1978）之间。黄牛的常染色体全为端着丝点，而大额牛和野牛的核型中分别有一对和两对近中着丝点常染色体，其核型正好依次相差一个罗伯逊易位（Robertsonian translocation）。有人认为大额牛是被驯化了的野牛，也有人认为它是独立进化而来的种类，还有人认为它是野牛和瘤牛的杂种。我们的研究结果为第三种推测提供了新的证据，因为大额牛的mtDNA与瘤牛的相同，雄性野牛的Y染色体是亚中着丝点，与大额牛的相同（单祥年等 1980），很可能大额牛是雄性野牛和雌性瘤牛杂交的后裔。当然要证实上述的推测，还有两个问题尚待进一步研究：①调查其他大额牛个体的mtDNA，看是否只存在一种类型。②研究野牛的mtDNA，看是否与瘤牛或普通黄牛的相同。

11．4．1．4 mtDNA限制性类型对研究牛生态种的意义

从表11-4可以看出，瘤牛的mtDNA在Bam HⅠ、PstⅠ、Bg1Ⅱ、EcoR Ⅴ4种酶中的限制性类型为A-A-A-A型，普通黄牛为B-B-B-B型，没有发现任何重组类型或中间类型，进一步证明了mtDNA分子在遗传过程中是不会发生重组的。也就是说，只检查一个酶的限制性

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类型，就可以推知其余3个酶的限制性类型，即可判定mtDNA的分子类型。这就为建立一个新的牛生态型鉴定系统奠定了基础。

通常用作RFLP分析的mtDNA需要从肝或肾等内脏组织中提取，这就需要宰杀动物才能进行实验。对于大型动物的大规模调查显然是不合适的，对于一些珍贵的物种（例如前面提到的野牛和大额牛），这是很困难或不可能的。但是，如果只作一个内切酶分析就可以解决问题，则可以从血液中提取到所需的mtDNA。20ml全血中提取到的mtDNA就足够一次酶解反应（EB染色），这就为快速简便地开展大规模的牛生态种调查提供了可能。

11．4．2 云南文山黄牛和迪庆黄牛的线粒体DNA多态性

文际坤、俞英等（1995）用8种限制性内切酶分析了云南文山黄牛（5头）和迪庆黄牛（6头）共11个个体的线粒体DNA限制性片段长度多态性。结果表明两种牛的AvaⅠ、BamHⅠ、Bg1Ⅱ、EcoR Ⅴ、HpaⅠ、PstⅠ、SalⅠ这7种酶的酶切类型有多态性，其中AvaⅠ-B（8.0，4.4，3.8）、SalⅠ-A（15.0，1.3）的多态性为首次报道，并且在迪庆黄牛中发现了前人未报道过的BamHⅠ-C（9.1，6.0，1.2）型和HpaⅠ-C（13.0，3.3）型（表11-4）。BamHⅠ和Hpa Ⅰ的C型仅出现在迪庆牛的一个个体中，SalⅠ-A仅出现在迪庆牛的两个个体中，AvaⅠ-B分别出现在文山牛和迪庆牛的1个和4个个体中。归结出3种基因单倍型分别是：代表瘤牛型的A-A-A-A-A-A-A，代表普通黄牛型的B-B-B-B-B-B-B，和前人尚未报道过的第三型A-C-B-B-C-A-A（表11-5）。

值得注意的是，第3种特殊单倍型既不是瘤牛型，也不是普通黄牛型。这种类型的形成有3种可能，一是突变体，二是含有部分牦牛血缘，3是一种独立起源的新类型。由于A、B、C3型同时出现在同一个个体中，因而不大可能由突变导致。另据我们观察，该个体的体型外貌特征与牦牛相差很大，而与黄牛无异，因此起源于当地牦牛的可能性不大。因此，更可能是一种前人未发现过的黄牛线粒体DNA新类型。

11．4．3 海南黄牛和徐闻黄牛的线粒体DNA多态性

聂龙、陈永久等采用 ApaⅠ、AvaⅠ、BamHⅠ、BglⅠ、BglⅡ，DraⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、Hind Ⅲ、HpaⅠ、PstⅠ、SalⅠ、ScaⅠ和XhoⅠ这14种限制性内切酶，分析来自海南岛的海南黄牛和雷州半岛的徐闻黄牛的线粒体DNA限制性片段长度多态性（mtDNA RFLP），

122 中国动植物的遗传多样性

结果只有一种限制性内切酶。（SalⅠ）在海南黄牛品系的两个个体内检测到变异，并且其中的C型（15.0，1.3）以前尚未作过报道。共检出海南黄牛限制性片段40个，徐闻黄牛限制性片断38个（各片段大小见表11-6），经计算，有差别的两种mtDNA基因型之间的遗传距离仅为0.001 08，整个群体遗传多态程度的π值（与蛋白质研究中的座位平均杂合度值H含义相同）为0.024％（计算方法见Nei 1979），这在所有已经用RFLP方法研究的家养动物品种间几乎为最小。该群体线粒体DNA水平遗传结构的单一，表明了它们非常近的亲缘关系。

宿兵等（1995）曾对来自云南省文山州马关县和麻栗坡县的21匹普通马和14匹矮型马作过分析，在所检测的44个遗传座位中，有10个座位发现多态性，其多态座位百分比和平均杂合度值分别为P＝0.227、H＝0.089和P＝0.205、H＝0.083，为已报道多态程度较高的家养动物。王文等（1994）则研究了云南普通家马和矮型马的mtDNA多态性，发现其mtDNA多态性程度也很高，π值为0.72％。蛋白电泳和线粒体DNA RFLP的分析给出一致的结果，即云南家马和矮型马在极为有限的地理范围内表现出非常高的核内和核外基因组遗传多样性，说明其父系和母系均可能为多起源。杨关福等（1995）运用蛋白电泳技术对15头徐闻黄牛和17头海南黄牛40个遗传座位进行了分析，结果多态座位高达13个，多态座位百分比P＝0.325，平均杂合度值分别为H＝0.141和H＝0.132，从而在蛋白质水平上显示了丰富的遗传多样性。海南黄牛和徐闻黄牛mtDNA极低的变异度表明其核外基因组多态低，但核内基因组多态高，说明其母系起源可能单一，而父系则较复杂。这是一个十分有趣的现象，一方面，可能是我们用于分析的个体数较少，另一方面，可能是品种形成时，公牛和母牛的参与情况有差异。总之，对这个现象的深入研究将对黄牛的起源问题提供更为有价值的信息。

Watanabe等（1985，1989）和Bhat等（1990）对牛mtDNA的限制性酶研究表明，普通牛的mtDNA表现为限制性B型，瘤牛则为A型（Bhat 1990）。我们用14种酶对2个品种6个个体mtDNA所作的分析表明，6头黄牛的限制性图谱几乎完全一致。报道过出现多态的7种酶（包括本文的报道）在徐闻黄牛的3个个体和海南黄牛的1个个体中与菲律宾Ⅱ型完全相同，均表现为A型，即是mtDNA基因单倍型为：A-A-A-A-A-A-A，海南黄牛的另2个个体的基因单倍型为：A-A-A-A-A-A-C，而不含有任何一个B型，即普通黄牛的血统，从而说明这些品种的瘤牛起源，同时也说明了海南黄牛和徐闻黄牛的单一母系起源。在黄牛的mt

第11章牛的遗传多样性 123

DNA RFLP研究方面，在国内外关于亚洲黄牛及欧洲牛品种的报道中，A型和B型都有作为支配地位的比例出现，从而可以认为黄牛具有瘤牛起源和普通牛起源两种类型（兰宏等1993；Watanabe et al 1985，1989；Bhat et al 1990），而我们所分析的两个品种的黄牛只有瘤牛的血统。由此，我们支持海南可能是世界的一个牛属的发源地之一的说法。我们的研究结果还从线粒体DNA水平上支持将海南黄牛和徐闻黄牛合并为雷琼黄牛的结论。

值得指出的是，文际坤等（1995）对文山牛和迪庆牛的研究中，AvaⅠ-B（8.0，4.4，3.8）、SalⅠ-A（15.0，1.3）、BamHⅠ-C（9.1，6.0，1.2）、HpaⅠ-C（13.0，3.3）的多态为首次发现。本研究中，在唯一检测到多态性的限制性内切酶SalⅠ中，其C型（15.0，1.3）只在海南黄牛内的两个个体中出现，并且与文山牛和迪庆牛的SalⅠ-A相同。线粒体DNARFLP分析可以为鉴定牛种的母系起源提供有效、可靠的遗传学标记。陈幼春等（1990）在云南黄牛的血液蛋白多态、Y染色体特征等方面作了大量的研究工作，认为云南黄牛与东南亚牛亲缘关系密切，是瘤牛、普通牛和巴厘牛的混血。线粒体DNA RFLP分析可以为鉴定牛种的母系起源提供有效、可靠的遗传学标记。这些新发现的非瘤牛和普通牛的类型是否有可能代表巴厘牛等类型，显然很有必要作进一步的研究。但普通黄牛（Bos taurus）和瘤牛（Bos indicus）对中国黄牛的影响仍然是主流。

1994年Loftus等对黄牛的瘤牛－普通牛起源说提出了一些异议，他们分析了6头欧洲黄牛（taurine）、3头印度瘤牛和4头非洲牛（3头瘤牛和1头普通黄牛）的mtDNA序列，结果表明，13头牛并不按照普通黄牛－瘤牛的形式聚类，而是按照地理位置聚类为两大系，即欧洲牛和非洲牛聚为一大系，印度牛聚为另一大系，将印度牛（Bos indicus）作为亚洲牛的代表。Loftus等的研究结果还以分子生物学方面的证据表明了亚洲瘤牛独立的驯化历史，并从可被检测到的mtDNA序列数据揭示了在黄牛家养种中存在相当低水平的遗传多样性。我们的研究结果与此是一致的。

11．5 遗传多样性及其保护

中国黄牛历史悠久，品种众多，数量巨大，分布面广，产地生态环境不同，各地选育方向不一，遗传资源相当丰富。因此，中国黄牛是世界家牛属遗传资源宝库的重要组成部分。

遗传多样性的研究对于了解家畜的起源和品种分化以及指导家畜的遗传育种都具有重要的参考价值，因为物种的适应性和进化的基础是种内的遗传变异。同样，在家畜的早期驯化和现代的遗传育种工作中，种内的遗传变异即遗传多样性也具有重要意义。遗传多样性愈丰富，对环境变化适应性就愈大，杂交育种的潜力也就愈大。

我国地方黄牛品种经过千百年的自然选择和人工选择，形成了能够适应当地的生态环境条件和社会经济状态的地方品种，成为宝贵的牛品种资源基因库，具有丰富的遗传多样性。这些地方品种作为当地劳动人民的生产资料，是珍贵的地方财富，即使有些种生产性能低，但其本身具有的优良特征是良种所不及的，是改良品种和培育新品种所必要的。地方品种也是杂种优势利用的原材料，所以从长远角度来讲，应该很好地保存我国的地方黄牛品种资源。

保存地方品种是更好地利用地方品种的前提，利用地方品种要在保存地方黄牛品种资源的基础上进行，盲目地进行杂交改良，将会造成地方黄牛品种资源的丢失。