常量肉汤稀释法讲课教案
常量肉汤稀释法
1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为18
2.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
1.1.
2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml
弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
1.1.6.孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。
1.1.7.结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β-内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如β-内酰胺类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。
MIC的测定(微量二倍稀释法)
微量肉汤稀释法测MIC 一、试验原理目的 细菌在96孔板MH培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀，很容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后，无沉淀的最后一个空即为MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且96孔板占地少，一板可做96个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约时间。 二、试验器材、化学试剂及菌种 96孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。 菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验准备 1、培养基的配置 MH培养基42g，蒸馏水1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可。 2、工器具的灭菌 将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。 2、抑菌剂的配置 抗菌药物的溶解与稀释，一般情况下，水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶解，而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性，采用甲醇，缓冲液，NaOH溶液，DMSO溶液等，尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释后，作为抗菌药原液。 3.、菌悬液的配置 从冰箱取出需要测试的菌种活化后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取1mL 的菌
无菌检查法标准操作程序
1目的 建立一个无菌检查法标准操作程序，保证实验的准确性、可靠性。 2范围 适用于原料、辅料及成品的无菌检查。 3职责 微生物检验员遵照执行。 4内容 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 4.1 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌的培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。 4.1.1 培养基的制备及培养条件 培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2?25°C、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 4.1.1.1 硫乙酵酸盐流体培养基
胰酪胨15. 0g 氯化钠 2. 5g 酵母浸出粉 5. 0g 新配制的0. 1 % 刃天 无水葡萄糖 5.0g 青溶液 1.0ml L-胱氨酸0. 5g 琼脂0. 75g 硫乙醇酸钠0.5g 水1000ml (或硫乙醇酸）（0.3ml) 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节p H 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节p H , 使灭菌后在25℃的p H 值为7.1 土0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100°C水浴加热至粉红色消失（不释过2 0分钟），迅速冷却只限加热一次，并防止被污染。 除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30?35C培养。 4.1.1.2 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪胨 1 7 . 0g 氯化钠 5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 3. 0g 磷酸氢二钾 2. 5g 葡萄糖/无水葡萄糖 2. 5g/2. 3g 水1000m l 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节p H 使灭菌后在2 5℃的p H 值为7. 3±0. 2，加入葡萄糖，分装，灭菌。 胰酪大豆胨液体培养基置20?2 5 ℃培养。 4.1.1.3 中和或灭活用培养基 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。 4.1.1.4 0.5% 葡萄糖肉汤培养基(用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查） 胨 1 0 . 0g 氯化钠 5 . 0g 牛肉浸出粉 3 . 0g 水1000m l 葡萄糖 5. 0g 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节p H 为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后在25℃的p H 值为7. 2士0.2，分装，灭菌。 4.1.1.5 胰酪大豆胨琼脂培养基 胰酪胨15.0g 琼脂 1 5 . 0g
普通肉汤琼脂培养基使用
中文名称：营养琼脂(普通肉汤琼脂培养基) 英译名称：Nutrient Agar 品种编号：022020 营养琼脂规格：250g干粉培养基 营养琼脂用途：用于细菌总数测定、保存菌种及纯培养，也可用于消毒效果测定。 营养琼脂使用原理： 蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源;氯化钠能维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂。 微生物图册： 营养琼脂配方(每升)： 蛋白胨10g 牛肉膏粉3g
氯化钠 5g 琼脂15g 最终pH 7.3±0.2 营养琼脂使用方法： 1、称取本品33g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。 2、(食品)以无菌操作称取检样25克(或25mL)，放入含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的玻璃三角瓶中(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，充分振摇，即为1：10的均匀稀释液。依次做1：100，1：1000……稀释液。 3、根据对样品污染情况的估计，选择2—3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿。 4、稀释液移入平皿后应及时将凉至46℃左右的培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，倒置于36±1℃温箱中培养48±2h。 5、观察结果。 6、菌落计数方法： 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在计下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 7、菌落计数的报告： 选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。平皿内如有我链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落;如有不同来源的几条链，则应将每条链视为一个菌落计。 营养琼脂质量控制： 本营养琼脂接种下列菌株，置于36±1℃温箱中培养48±2h，结果如下： 菌名菌号生长状况菌落特征
CLSI微量稀释法
最小抑菌浓度(MIC)测定 以肺炎链球菌ATCC49619 为质控菌株，采用美国临床和实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，MIC值参照国家临床实验室委员会2002年标准。抗菌药物稀释范围（毫克/毫升）：氨苄青霉素（1–16）、头孢噻呋（0.03–8）、环丙沙星（0.015–4），红霉素（0.125–16）、氟苯尼考（0.12–32），青霉素（0.015–8）、大观霉素（1–256），四环素(0.06–32)、泰妙菌素（0.25–32）、替米考星（2–64）、甲氧苄啶和磺胺甲恶唑（0.015–8）。每株菌液接种于含不同药物浓度的96 孔微量板中，35 ℃培养20–24 h ，观察结果，同时以A TCC27090 和 ATCC25922 作为抗菌药物的敏感性试验质控菌株。 1.5 最小抑菌浓度(MIC)测定以肺炎链球菌ATCC49619 为质控菌株，采用美国临床和实验 室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，检测临床上常用的19种抗生素对红斑丹毒 丝菌安徽分离株的MIC。 1.5.1 菌株活化将红斑丹毒丝菌安徽分离株接种于3 mL BHI肉汤(含5%犊牛血清)中，37℃振荡(120 r/min)培养12 h，在对数生长期(600 nm吸光度为0.883)分别在BHI琼脂平板中传 代两次，挑取单菌落划线接种到CAMHA上，培养18-24 h，再挑取单菌落接种于含5%胎 牛血清的CAMHB中，培养至浊度为0.5麦氏比浊单位，此时菌液浓度约为5×108 CFU/mL，用CAMHB做1：1000稀释备用。 1.5.2 抗菌药物储存液的制备称取各种抗生素粉末，根据药物的理化性质及使用说明进行稀释配制，分别配制成终浓度为1280 μg/mL的药物储存液，分装至1.5mL EP管中，用封口膜封口后存至-80℃冰箱保存备用，可保存半年时间内不失活，避免反复冻融。 1.5.3 MIC的测定在96孔微量稀释板中连续倍比稀释药物储存液，药物初始浓度为128 μg/mL，得到一系列100μL药物梯度稀释液(药物浓度范围为128~0.0625 μg/mL)，空白对照只加100 μL培养基，阴性对照加菌悬液和培养基的混合物100μL。置于35℃温箱中培养24 h。在读取所测试菌株的MIC前，检查阴性对照管的细菌生长情况是否良好，同时检查空白对照是 否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。肉眼观察没有细菌生长的最低药物浓度即 为该药物的MIC，每组试验重复三次。根据CLSI提供的人用抗生素的判定标准(M45-A2) 进行结果判定[6](表1)。 表1 MIC的判定标准
常量肉汤稀释法
常量肉汤稀释法 1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为18 2.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。 1.1. 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml
几种MIC的测定方法
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的方法 1浊度法 1.1常量肉汤稀释法（试管） 1.1.1.抗菌药物贮存液制备 将抗菌肽稀释到无菌水中，制成1024μg/ml的原液，（也可以用0.22um滤膜进行过滤，但要去掉前面5 ml的过滤抗菌肽溶液）。抗菌药物贮存液浓度按照不同梯度稀释。 1.1. 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基推荐使用LB肉汤培养基，pH7.0~7.4。指示菌为大肠杆菌或沙门氏菌。1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的LB肉汤中，35℃孵育2-6 h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或LB肉汤培养基校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，推荐直接取培养18~24 h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用LB肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6ml LB肉汤外，其余每管加入LB肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1024μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。（注：在稀释的过程中，每次吸取1ml到下一管中后，要换掉枪头，后面的方法相同） 1.1.6.孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃摇床培养16~20h。 1.1.7.结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC 值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。或者用分光光度计测定OD600，与未接菌的比对，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。 1.2.微量肉汤稀释法（酶标板） 1.2.1.抗菌药物和培养基制备同常量肉汤稀释法。 1.2.2.MIC板制备无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，药物浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml。第12孔不加药作为生长对照，如果当时不使用，则冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。 1.2.3.接种物制备将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经LB肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加90μl，密封后置37℃摇床孵育16~20h判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125μg/ml。 1.2.4.结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC（用酶标仪测得OD600）。当阳性对照孔（即不含抗菌肽）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释
微量肉汤稀释法
微量肉汤稀释法 1.2.1.抗菌药物和培养基制备同常量肉汤稀释法。 1.2.2.MIC板制备无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。 1.2.3.接种物制备将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。当试验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育时间为20~24h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满24h。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。 1.2.4.结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。 2.琼脂稀释法琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。 2.1.培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。 2.2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
药敏MIC方法
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）技术 几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）技术 1.1.常量肉汤稀释法1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于 1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。 1.1. 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度 范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108C FU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1 管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。 1.1.6.孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌 应持续孵育满24h。 1.1.7.结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC
抗生素最低抑菌浓度(MIC)和半数抑菌浓度(MIC)测定方法
抗生素最低抑菌浓度（MIC）和半数抑菌浓度（MIC）测定方法 常量肉汤稀释法 1.1抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为 1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。 1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如 1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。 1.6.孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。 1.7.结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情
药物敏感试验
药物敏感试验 1.药物敏感试验种类 1.1纸片琼脂扩散法（disc agar diffusion test）常采用Bauer-Kirby）法。 1.2液体稀释法（dilution test）：肉汤稀释法（broth dilution）和琼脂稀释法（agar dilution test），肉汤稀释法又包括试管稀释法（tube dilution）和微量稀释法（microdilution）。 2.应用 2.1纸片琼脂扩散法： 2.1.1术语： 敏感——表示被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌药物治愈，禁忌症除外。 耐药——被测菌株不能被常用剂量所达到的组织内或血液中的抗生素所抑制。 中度敏感——表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制或在生理性浓集的部位被抑制，如β-内酰胺类药物。 中介度——这一范围只是抑菌圈直径介于敏感和耐药之间的缓冲域，以防止由微小的技术因素失控所导致的较大的结果解释错误，抑菌圈落入中介度范围，意义不明确，如果没有其他可以替代的药物，应重复或以稀释法测定MIC。 2.1.2应用：一般认为药敏结果与临床约有80~90%合格率，药敏实验是提供治疗感染性疾病最有力的依据，也可以进行流行病学调
查，了解耐药菌株的耐药机制。此外利用药敏谱可对被检菌株进行鉴定。 2.2液体稀释法（dilution test） 2.2.1术语： MIC——最小抑菌浓度 MBC——最小杀菌浓度 MIC50——能抑制50%的试验菌的最低药物浓度即为该药物对被测菌的MIC。 MIC90——能抑制90%的试验菌的最低药物浓度即为该药物对被测菌的MIC。 2.2.2应用：液体稀释法比较繁琐，一般不作为常规试验。仅在以下几个方面采用：调查罕见耐药，调查药敏定性试验是敏感但临床疗效不佳的原因，确定中介度的敏感性，有效的选择二线药，评价新药。 3.影响药敏性试验准确性的因素 3.1细菌的分离培养 综合动物的临床发病症状，剔除并避免选用少量杂菌。选取5份以上菌落，平板划线于血平板上，或根据实验要求划线于不同的鉴别培养基，再培养。从而达到分离培养的目的，如常用的肠道菌的分离选择S.S琼脂和麦康凯琼脂。 3.2培养基选择 培养基成分不同，不但影响着敏感菌株的生长繁殖，并可影响到
MIC的测定(微量二倍稀释法)复习过程
M I C的测定(微量二倍 稀释法)
微量肉汤稀释法测MIC 一、试验原理目的 细菌在96孔板MH培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀，很容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后，无沉淀的最后一个空即为MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且96孔板占地少，一板可做96个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约时间。 二、试验器材、化学试剂及菌种 96孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。 菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验准备 1、培养基的配置 MH培养基42g，蒸馏水1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可。 2、工器具的灭菌 将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。 2、抑菌剂的配置
抗菌药物的溶解与稀释，一般情况下，水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶解，而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性，采用甲醇，缓冲液，NaOH溶液，DMSO溶液等，尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释后，作为抗菌药原液。 3.、菌悬液的配置 从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液），再吸取0.5ml 加入到4.5mlMH培养基中，用枪头吹匀待用。 四、试验步骤 1.在96孔板每个孔加入MH肉汤培养基100μl 。 2.在A/B/C三排的第一孔加配好的药液100 μl，然后对药物进行二倍稀释。即，第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少三次以上）使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，第12列吸出100ul扔掉。 3.再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl,重复做三次（A/B/C三排样品）。 4.在同一块板上的G排上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和在H排上做一排阳性对照（加菌液不加药液）。 5.将96孔板放入37℃恒温培养箱16～20小时后，观察结果。
肉汤琼脂培养基使用说明
编号：022020 品种名称：营养琼脂(普通肉汤琼脂培养基)(Nutrient Agar) 用途： 用于细菌总数测定、保存菌种及纯培养，也可用于消毒效果测定 (GB/T4789.28-2003 中4.7 ，GB/T4789.2-2003，GB15979-2002和 GB15981-1995)。 原理： 蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源;氯化钠能维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂。 图鉴： 配方(每升)： 蛋白胨10g 牛肉膏粉3g 氯化钠 5g
琼脂15g 最终pH 7.3±0.2 使用方法： 1、称取本品33g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。 2、 (食品)以无菌操作称取检样25克(或25mL)，放入含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的玻璃三角瓶中(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，充分振摇，即为1：10的均匀稀释液。依次做1：100，1：1000……稀释液。 3、根据对样品污染情况的估计，选择2—3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿。 4、稀释液移入平皿后应及时将凉至46℃左右的培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，倒置于36±1℃温箱中培养48±2h。 5、观察结果。 6、菌落计数方法： 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在计下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 7、菌落计数的报告： 选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。平皿内如有我链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落;如有不同来源的几条链，则应将每条链视为一个菌落计 A：稀释度的选择： 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见附表)。 若有两个稀释度.其生长的菌落数无均在30-300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，则应报告其平均数;若大于2则报告其较小的数字(见表中例2及3)。 若所有稀释度的平均菌落数均大于300则应按稀释度最高的平均菌落数乘 以稀释倍数报告之(见表中例4)。