双向电泳

双向电泳的应用及研究进展

摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。

关键词: 双向电泳，应用，前景

1.1双向电泳技术概述

双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，

产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。

1.2双向电泳基本原理

1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。

2双向电泳的应用

双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其分辨率已从15 个蛋白质点发展到10 000多个蛋白质点。一般的双向电泳也能分辨 1 000～3000 个蛋白质点。因此，近年来，双向电泳被广泛应用于农业、医学等研究领域。

2.1 在动物科学中的应用

在动物科学研究方面，双向电泳被广泛应用于小鼠血清蛋白、卵巢蛋白、兔晶状体蛋白质、昆虫离体细胞膜蛋白、户尘螨蛋白、家蚕雌性附腺及其Ng突变体蛋白质、大腹园蛛毒素蛋白质、家蚕蛋白质、牛精液蛋白、猪巨噬细胞蛋白等方面的研究。如钟小兰等[2]利用双向电泳技术分析肝郁症模型大鼠血清蛋白质组的差异表达。王治东等[3]采用蛋白质组学的双向电泳和蛋白质氨基酸序列分析技术研究了8Gy γ射线照射后24 h 小鼠血清蛋白质的变化。马翔等[4]通过双向电泳和质谱技术分析性成熟小鼠卵巢蛋白质组，并对其中的一种蛋白质进行免疫组化研究。刘奕志等[5]通过双向电泳和质谱鉴定有效分离和分析兔晶状体蛋白质组的特性，为白内障的防治带来新的前景。柳亦松等[6]以大腹园蛛粗毒为材料利用双向电泳技术获得蛋白质组双向电泳图谱，检测到500 个左右的蛋白质点，并对其中部分蛋白质点进行了质谱分析。靳远祥等[7]采用双向凝胶电泳和计算机辅助分析方法，分别对家蚕（Bombyx mori）限性黄茧品种雌蚕（黄茧）和雄蚕（白茧）的中部丝腺组织细胞蛋白质进行分离和比较分析。

2.2 在植物中的应用

在植物科学研究方面，双向电泳被广泛应用于水稻蛋白质、小麦蛋白质、茶树蛋白质、杉树蛋白质等方面的研究。如易克等[8]利用双向电泳技术对水稻种子胚乳蛋白进行了分析，获得了较好的电泳图谱，为探讨水稻灌浆期间与籽粒充实相关蛋白表达的变化，建立了一套适于水稻种子胚乳蛋白双向电泳分析技术。Picard 等利用双向电泳分析了亲缘关系较近的硬粒小麦不同株系的遗传多样性。林金科等[9]利用双向电泳技术分析了茶树蛋白质组，探索出一种可获得重复性好，清晰度高的蛋白质双向电泳图谱技术，并发现

一种辨别茶树蛋白质样品质量好坏的简便方法。杨梅等[10]建立了适用于杉叶片蛋白质组研究的双向电泳技术，对杉木叶片蛋白质的溶解方法、上样量、IEF 及SDS-PAGE 电泳等关键步骤进行了优化。另外，梁文裕等[11]应用双向电泳技术分析了龙眼胚胎分化发育过程中蛋白质组分的变化。丁坤善等[12]建立了油松雌性不育系球果蛋白质双向电泳技术体系。李慧玉等[13]对樟子松突变丛生枝蛋白质进行了双向电泳分析。

2.3 在医学中的应用

目前许多研究者利用双向电泳对人体的各种组织、器官、细胞进行了研究，为疾病的诊治及了解发病机制提供了新的手段，例如，在肿瘤的研究中，寻找与肿瘤发生、发展和抗药性有关的蛋白，孙庆、杨小玉等[14]对骨肉瘤组织和正常组织进行了双向电泳分析，得到较好的电泳图谱，建立和优化人骨肉瘤蛋白质组双向电泳图像分析方法。苏坚[15]采用二维电泳、图像分析、质谱技术等方法在相同条件下，对二烯丙基二硫（DADS）处理前后SW480细胞两种样品的总蛋白质进行双向电泳，其中167个匹配的蛋白质点存在表达量上的差异。与对照组相比，处理组蛋白质表达量下调的有69 个，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对其中8个表达明显下调的蛋白质斑点进行分析鉴定，获得相应的肽质量指纹图谱（PMF），通过数据库搜索，确定了这8 个蛋白，这些差异蛋白质涉及细胞周期调控、细胞分化、细胞凋亡及细胞分裂增殖等众多事件。从而说明，DADS可能具有抑制结肠癌细胞生长，阻滞细胞周期，诱导细胞分化及凋亡的作用。

利用双向电泳技术建立和优化了人血清蛋白质图谱，为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础。刘希成等[16]对人未做处理的血清以及去除白蛋白和免疫球蛋白G（IgG）的蛋白质组学方法进行比较和优化，质谱分析了9 个差异蛋白点，鉴定为8 种蛋白质，其中7 种为功能蛋白质。胡成效等[17]通过双向电泳分析系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞蛋白质表达谱的变化，发现有11 个蛋白点在SLE 患者组表达上调，9 个表达下调，SLE 患者外周血单个核细胞蛋白质表达发生了明显改变，为从淋巴细胞蛋白质谱变化的整体角度上阐明SLE 发生的分子机制及免疫调控通路奠定了基础。赵慧辉[18]采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对8 例心绞痛血瘀症患者血瘀症程度变化前后的血浆进行比较蛋白质组学研究，寻找心绞痛血瘀症相关蛋白。结果初步发现了凝聚素（Clusterin）、载脂蛋白A-Ⅰ（ApoA-Ⅰ）在血瘀症程度变轻后表达增加，而纤维蛋白原β链（Fibrinogen βchain）、维生素D 结合蛋白（Vitamin D-Binding Protein）、结合珠蛋白β链（Haptoglobin βchain）等在血瘀症程度变轻后表达降低。以上这些物质均可能与心绞痛血瘀症相关，但结果有待运用其它生物学的方法进行具体的验证并探索其机制。另外双向电泳还应用在临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、食品检测、甚至物种鉴定等方面。

3双向电泳技术的局限性及方法的改进

虽然双向电泳技术具有其他蛋白质分离技术无可比拟的分离能力,目前仍然存在着一些技术细节上的挑战和缺陷。主要有以下几个方面:

3.1蛋白样品制备效率偏低

样品制备是双向电泳的第一步,其成功与否是决定双向电泳分离能力高低的关键。在蛋白质样品提取过程中,一些低浓度蛋白质往往会相对过早丢失。此外,一些难溶的蛋白,尤其是膜蛋白的提取效率较低。目前一些公司如Bio-Rad研制出一种顺序提取试剂盒，专用于提取一些难溶的膜蛋白。

3.2疏水性膜蛋白的难于分离与检测

一般来说,疏水性膜蛋白比亲水性蛋白质更难操作。膜蛋白更易于聚集在管壁上,由于蛋白质组的研究常在nmol甚至fmol水平上进行,这种特性将会导致很大的损失,甚至完全丢失。另外,α-螺旋跨膜蛋白在变性的2-D胶上不能很好被有效分离。若要分离这些蛋白质,需要有机溶剂分馏法或者反相HPLC等技术的辅助。

3.3极端酸性或碱性蛋白质的难于分离

极性蛋白质尤其是碱性蛋白质在细胞中常与DNA结合,在信号转导中起着调控作用,因此分离这类蛋白质有着很重要的意义。在胶条水合时,选用窄范围IPGs（固相PH梯度胶条）如pH 3~7或pH 7~10水合上样会引起明显的横纹,影响蛋白点的分离。目前用杯上样水合可以提高分离效果。在杯上样时,一般将蛋白样品

放在酸性窄范围IPGs的阴极端或在碱性窄范围IPGs的阳极端。

3.4蛋白质的动态分辨率有待提高

对于一根固定长度和pH范围的IPGs胶条,最多能分离几千个蛋白质。因此,要将某一种组织的所有蛋白质在仅一个pH范围的IPGs上分离是不可能的。一般采用多个pH范围的IPGs进行分离。在样品水合上样前,需将蛋白样品按不同pH范围进行预分离，可以提高低丰度蛋白质的分辨率。

3.5自动化程度需进一步提高

在双向电泳进行过程中,有不少步骤需要手工操作,因此比较费时,而且易产生误差,造成低重复性。也不利于实现高通量分离蛋白质。目前,双向电泳后半部分操作如蛋白胶图的软件分析和蛋白点的切割和处理已实现半自动化,大大加速双向电泳进程。蛋白质组学理想的高通量全系统方法应包括以下部分:样品收集技术、高分辨电泳装置、自动化凝胶染色仪、半自动化图像分析软件、机器人模拟的斑点处理过程、MALDI-TOF 和串联质谱仪,并且具有整合的生物信息学软件,可以链接到单个模块并进行畅通的样品处理、追踪、数据分析和数据归档。

3.6蛋白质定量的问题

在蛋白样品水合前,一般需要测定样品中蛋白含量。最常用方法用Bradford法测定蛋白浓度。由于蛋白样品含有去污剂如SDS和还原剂DTT等物质,因此,用此法测定蛋白浓度线性关系差,测定结果出现偏差,给不同样品或处理条件下蛋白表达差异比较带来误差。目前,一些公司已经开发了蛋白定量测定试剂盒,提高样品中蛋白定量的准确性。

4 前景与展望

目前双向电泳技术尚未完善,手工操作较多,经验性强,且存在许多局限性,尽管如此,该技术目前仍然是蛋白质组研究中不可替代的分离方法,随着蛋白质组学的兴起,对技术有了新的要求和挑战。随着相关学科的发展和技术的进一步完善以及新仪器的开发，限制双向电泳的羁绊不断被突破，双向电泳将在今后的研究中以其独到的优势继续发挥不可替代的作用。

双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景

1 双向电泳技术

1.1双向电泳技术概述

双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，

产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。