血管平滑肌细胞及内皮细胞的体外培养

高尿酸血症对内皮细胞损伤及血管平滑肌细胞增殖的影响（体外培养部分）

背景：关于高尿酸血症致肾脏损害的机制，既往的研究认为：当体内pH＜5.5或脱水时，可引起尿酸盐结晶沉积在肾小管间质部位，通过经典途径或替代途径激活补体、血小板、炎性细胞和巨噬细胞，引起细胞因子、转化生长因子（TGF-β）和活性氧的表达增多，刺激纤维母细胞向肌纤维细胞转化，激活胶原交联，最终导致纤维化或肾功能衰竭。新近国外的研究发现高尿酸血症导致肾脏损伤的原因有：①内皮细胞的损伤作用：Sanchez-Lozada等发现，尿酸可通过抑制NO（一氧化氮）产生和刺激内皮细胞增殖而导致内皮细胞损伤。中度的高尿酸血症就可以抑制NO的产生。②高尿酸血症诱导产生严重的肾小球血管病变，并且这种病变并非继发于高血压。高尿酸血症能直接刺激血小板衍生因子（PDGF）的表达和血管平滑肌的增殖，诱导产生严重的肾小球血管病变，而且这种病变并非继发于高血压，即在血压控制良好的情况下，高尿酸血症大鼠出现肾小球入球小动脉增厚，肾皮质血管收缩，肾小球内高压和肾小球肥大，最终导致肾小球硬化。因可溶性尿酸刺激单核细胞产生IL-2β、IL-6、IL-18及TNFa，因此推测尿酸对血管平滑肌的损伤作用可能是通过炎症样反应完成的。尿酸诱导大鼠平滑肌细胞炎症途径是经由有机离子转运系统进入血管平滑肌细胞，增加单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和环氧化酶2（COX2）的表达而实现的。MCP-1是一种非常重要的血管疾病和粥样硬化的化学趋化因子，而COX2是可导致炎症反应的重要蛋白之一。上述两种物质加重肾小球纤维化，肾小球肥厚，导致高血压、蛋白尿和肾功能恶化。目的：通过细胞体外培养，从

高尿酸血症对血管内皮细胞功能受损及血管平滑肌损伤的影响，阐明高尿酸血症在肾脏疾病中的发病机制，控制高尿酸的肾脏保护作用。方法：取通过传代培养3—8代的内皮细胞及血管平滑肌细胞进行实验，加入不同浓度的尿酸在培养基内，分别用分光光度法测定NO，用放射免疫法检测ET-1，用ELISA方法检测PDGF、COX2的表达情况。

具体操作如下：

将购回的细胞进行分装，留取一定数量的细胞冻存，防止实验途中细胞受到污染难以挽救时备用，传代（传3-8代）后进行实验。

一胰蛋白酶消化；

1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（0.25％胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细最好，最佳消化温度是37℃。

2. 显微镜下观察细胞：倒臵显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

二.吹打分散细胞：

1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。

3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。

4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

三.分装稀释细胞：

1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

2.显微镜下观察细胞：倒臵显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

五.继续培养：

用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。

四.细胞计数：

1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。

5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4) ×2×104

五．绘制细胞生长曲线

取生长状态良好的细胞 , 以3 ×104 /ml浓度接种24孔板, 1m l/孔, 每组设臵10个复孔, 37℃、50 ml/L CO2条件下培养,分别于培养1—11 d进行台盼兰染色, 计数活细胞数, 绘制生长曲线。

六．不同浓度尿酸对血管平滑肌细胞增殖的影响

取生长状态良好的细胞, 以1 ×104 /ml浓度接种96 孔板, 200 微升/孔, 每组设臵5 个复孔, 待细胞完全贴壁后, 无血清培养液驯化24 h, 使细胞周期同步化, 实验组分别加入含20 mg/L, 40 mg/L, 60mg/L 尿酸的0. 5% 血清培养液, 对照组加入等量0.5% 血清培养液, 37℃、50 ml/L CO2条件下继续培养, 48 h后, 每孔加入20微升MTT, 37℃、50 ml/L

CO2条件下孵育, 4 h 后小心吸弃培养液, 每孔加入150微升二甲基亚砜(DMSO), 震荡器震荡10 min, 酶联免疫检测仪(A=490 nm波长处光吸收值 ) 测定各孔的A 值。重复4次。（MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。）

七：不同浓度尿酸对内皮细胞及血管平滑肌细胞刺激后部分细胞因子及炎性介质表达情况

取生长状态良好的细胞, 以1 ×104 /ml浓度接种96 孔板, 200 微升/孔, 每组设臵5 个复孔, 待细胞完全贴壁后, 无血清培养液驯化24 h, 使细胞周期同步化, 实验组分别加入含20 mg/L, 40 mg/L, 60mg/L 尿酸的0. 5% 血清培养液, 对照组加入等量0.5% 血清培养液, 37℃、50 ml/L CO2条件下继续培养, 分别用分光光度法测定培养基中NO，用放射免疫法检测培养基中的ET-1，用ELISA方法检测培养基中PDGF、COX2的表达情况。（内皮细胞：检测NO、ET-1，血管平滑肌细胞:检测PDGF、COX2）