空气中细菌种类的测定(新)

培养基的制备与空气中微生物的检测

一、实验目的与要求

1、了解并掌握微生物所需的营养成分以及培养基的类型。

2、学习并掌握牛肉膏蛋白胨培养基的配制原理，配制方法以及熟悉实验步骤。

3、掌握高压蒸汽灭菌器的原理以及了解其操作步骤。

4、空气中微生物的检测。

二、实验原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。

高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以彻底高效杀死各种细菌及其高度耐热的原理。

空气是人类赖以生存的必须环境，也是微生物借以扩散的媒介。空气中存在着细菌、真菌、病毒、放线菌等多种微生物粒子，这些微生物粒子是空气污染物的重要组成部分。空气微生物主要来自于地面及实施、人和动物的蹑手呼吸道、皮肤和毛发等，它附着在空气气溶胶细小颗粒物表面，可较长时间停留在空气中。某些微生物还可以随着空气中细小颗粒穿过人体肺癌存留在肺的深处，给身体健康带来严重危害，也可以随着空气中细小颗粒物被输送到较远地区，给人体带来许多传染性的疾病和上呼吸道疾病。因此，空气微生物含量多少可以反映所在区域的空气质量，是空气环境污染的一个重要参数评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生物数量和空气污染微生物。

三、实验内容

1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备。

2、高压灭菌。

3、空气中微生物的检测。

四、实验步骤

1、查配方

牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏 1g；蛋白胨 2g；NaCl 1g；琼脂粉 4g；蒸馏水 200mL；pH 7.0—7.2。

2、称量

3、配制

先将牛肉膏、蛋白胨溶入烧杯中搅拌至完全溶解，再加入其他成分一次溶解，倒入500mL的锥形瓶中，加水至200mL，加入琼脂粉，拿报纸封口。

4、高压灭菌

5、分装，凝固

6、暴露取样：在指定的地点：一楼、三楼、五楼、七楼各放2皿，将平板皿盖打开，在空气中暴露10min ，时间一到，立即合上皿盖。

7、培养观察：把培养皿置于生化培养箱培养，于48h 后记录所生长的菌落数。

8、计算1平方米空气中的微生物的数目。

奥梅染斯基曾建议：如面积为100㎝2的平板培养基，暴露在空气中10分钟，置于37℃培养24小时后所生长的菌落数，相当于10L 空气中的细菌数。 2100

100r N X π??= X 每m3空气中的细菌数

N 平板暴露5分钟，置37℃培养24小时后生长的菌落数

r 平皿底半径5㎝

五、实验数据记录及处理

测得各个楼层的菌落数如下表所示： 1楼：X （外1）=764（个） X （外2）=1401（个） X （外平均）=1083（个） X （内1）=382（个） X （内2）=2038（个） X （内平均）=1210（个） 3楼：X （外）=637（个） X （内）=764（个）

5楼：X （外）=637（个） X （内）=1656（个）

7楼：X （外）=255（个） X （内）=382（个）

由计算得出的数据可知，空气中微生物的分布具有不定向性以及不均匀。

六、实验体会

1、微生物需要的营养物质

营养物质应满足微生物的生长、繁殖和完成各种生理活动的需要。它们的作用可概括为形成结构（参与细胞组成）、提供能量和调节作用（构成酶的活性和物质运输系统）。微生物的营养物质有六大类要素，即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源。

① 水：水是微生物的重要组成部分，在代谢中占有重要地位。水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水。结合水与溶质或其他分子结合在一起，很难加以利用。游离水（或称为非结合水）则可以被微生物利用。

② 碳源：碳在细胞的干物质中约占50%，所以微生物对碳的需求最大。凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，称为碳源。作为微生物营养的碳源物质种类很多，从简单的无机物（CO2、碳酸盐）到复杂的有机含碳化合物（糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、芳香化合物及各种含碳化合物等）。但不同微生物利用碳源的能力不同，假单孢菌属可利用90种以上的碳源，甲烷氧 1楼 1楼 3楼 5楼 7楼 外 6 11 5 5 2

内 3 16 6 13 3

化菌仅利用两种有机物：甲烷和甲醇，某些纤维素分解菌只能利用纤维素。

大多数微生物是异养型，以有机化合物为碳源。能够利用的碳源种类很多，其中糖类是最好的碳源。异养微生物将碳源在体内经一系列复杂的化学反应，最终用于构成细胞物质，或为机体提供生理活动所需的能量。所以，碳源往往也是能源物质。

自养菌以CO2、碳酸盐为唯一或主要的碳源。CO2是被彻底氧化的物质，其转化成细胞成分是一个还原过程。因此，这类微生物同时需要从光或其他无机物氧化获得能量。这类微生物的碳源和能源分别属于不同物质。

③ 氮源：凡是构成微生物细胞的物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质，称为氮源。细胞干物质中氮的含量仅次于碳和氧。氮是组成核酸和蛋白质的重要元素，氮对微生物的生长发育有着重要作用。从分子态的N2到复杂的含氮化合物都能够被不同微生物所利用，而不同类型的微生物能够利用的氮源差异较大。

固氮微生物能利用分子态N2合成自己需要的氨基酸和蛋白质，也能利用无机氮和有机氮化物，但在这种情况下，它们便失去了固氮能力。此外，有些光合细菌、蓝藻和真菌也有固氮作用。

许多腐生细菌和动植物的病原菌不能固氮，一般利用铵盐或其他含氮盐作氮源。硝酸盐必须先还原为NH+4后，才能用于生物合成。以无机氮化物为唯一氮源的微生物都能利用铵盐，但它们并不都能利用硝酸盐。

有机氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆等，工业上能够用黄豆饼粉、花生饼粉和鱼粉等作为氮源。有机氮源中的氮往往是蛋白质或其降解产物。

氮源一般只提供合成细胞质和细胞中其他结构的原料，不作为能源。只有少数细菌，如硝化细菌利用铵盐、硝酸盐作氮源和能源。

④ 无机盐：无机盐也是微生物生长所不可缺少的营养物质。其主要功能是：（1）构成细胞的组成成分；（2)作为酶的组成成分；（3)维持酶的活性；（4）调节细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位；(5)作为某些自氧菌的能源。

⑤ 生长因子：一些异养型微生物在一般碳源、氮源和无机盐的培养基中培养不能生长或生长较差。当在培养基中加入某些组织（或细胞）提取液时，这些微生物就生长良好，说明这些组织或细胞中含有这些微生物生长所必须的营养因子，这些因子称为生长因子。

生长因子可定义为：某些微生物本身不能从普通的碳源、氮源合成，需要额外少量加入才能满足需要的有机物质，包括氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶及其衍生物，有时也包括一些脂肪酸及其他膜成分。

2、消毒与灭菌

消毒是指清除和杀灭环境和物体中的致病微生物或使微生物灭活的过程，分物理消毒和化学消毒两种。物理消毒主要指阳光和紫外线照射等。化学消毒指用化学药品清除、杀灭和灭活致病微生物的过程。

消毒剂分类及常用消毒剂

1）按消毒剂作用水平分类

高效消毒剂：指可杀灭所有微生物，包括各种细菌繁殖体、细菌芽孢、真菌、结核杆菌、囊膜和非囊膜病毒等，也称灭菌剂，如过氧乙酸、甲醛、戊二醛等及有机汞类；

中效杀毒剂：除不能杀死细菌芽孢外，可杀死细菌繁殖体、真菌和病毒等其他微生物，如乙醇、酚剂类；

低效杀毒剂：可杀死部分细菌繁殖体、真菌和囊膜病毒，不能杀灭结核菌、细菌芽孢和非囊膜病毒，如季胺盐类等阳离子表面活性剂——新洁尔灭、洗必太等。2）按消毒剂用途分类

环境消毒剂；带畜(禽)体表消毒剂(包括饮水、器械等）。

按物品性状：固体、液体、气体。

3）按化学性质分类

过氧化物类消毒剂：指能产生具有杀菌能力的活性氧的消毒剂，如过氧乙酸、过氧化氢、过氧戊二酸、臭氧、二氧化氯等，如杜邦公司Antec的“Virkon”过一硫酸氢钾复合盐消毒剂等。缺陷及危害：过氧乙酸、过氧化氢、过氧戊二酸不稳定、刺激性强，长期使用对人和动物眼睛、呼吸道黏膜、环境有强力的破坏。