图像分析基本原理及分析过程

图像分析基本原理及分析过程

概述

在生物及医学研究中，对图像的判读与分析特别是对显微镜下微观图像的观察研究从来都是重要的研究手段。随着技术的进步，分析图像的方法也从眼观尺量进入到了使用计算机软件进行定量分析的阶段。计算机软件的发展速度呈加速前进，采集图像的设备也不断更新，这使得我们能有更多的手段来分析测量复杂的生物图像。

现在我们可以使用CCD数码相机来采集图像。使用功能比较强大的图像分析软件来进行图像分析测量。相比之下，在不太久远的十来年前使用的图像分析仪及单色的图像采集摄像机已经过时了。而图像分析的手段也比以前丰富。简单地引用以前的分析方法未必就是最佳的方法，在许多情况下，需要我们依据软件及相机的情况设计与研究目标相适应的分析方法。

分析测量图像绝不仅仅是一个软件使用的问题，而是从实验设计开始，就要综合考虑研究目标、样品制作方法、拍摄方式、选择视野等各方面因素，最后才是通过软件实现最有效的图像分析测量。一个完整的图像分析过程应该包括：

1.明确需要测量分析的对象。

2.使用适当的方法拍摄下这个对象，包括进行适当的染色及取样，采集到突出显示的测量对象的照片。

3.分析照片上的图像元素,确定能反映测量对象的图像图形

4.测量照片上的图形的测量参数,进而得到测量对象的测量数据

5.对测量对象进行统计分析。图像分析的最佳效果，是利用图像分析软件可以自动地判断测量目标，准确分析测量出目标对象的数值。由于生物图像的复杂性，软件往往作不到这一点。此时只能退而求其次，采取抽样统计，手工选择等方法进行近似的测量。测量方法本身有时候也能成为一个研究课题。

一、把研究目标转换到图像分析问题上。

在丁香园混了好几年了，虽然很喜欢与大家讨论图像分析的问题，但是却经常对一些求助视而不见，例如：

请问用IPP怎么分析双染的结果？谢谢！

最近正要测肾小球面积以及球内PAS染色阳性面积（粉紫色），不会操作，希望各位老师及同仁多多指教，非常感谢！传张片子上来，请指导一下哦！

免疫荧光定量分析选什么软件好？是IPP吗？

这个软件可以做杂交结果的分析吗？具体如下：杂交后获得阳性结果和阴性对照的结果，如何分析结果呢？下面是阳性和阴性的图。谢谢您的解答。

我做的是脐静脉内皮细胞管道形成实验，需要计算整张图片上内皮细胞管道的数目以及管道的总长度，这个怎么用IPP计算啊？希望能够提供详细步骤（附有图片）。谢谢！！！

我们在对免疫组化照片的阳性区域，进行最后的的统计学分析时，用的应该是哪个参数呢？

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上面这些提问我是没法回答的，除非是正好作过相关的研究，知道其来龙去脉。否则即使有图片提交，也看不出哪里是肾小球内PAS，哪里是管道。不知道需要分析的对象在哪里，当然也就不会作了。

所以一个完整的图像分析过程应当是前面所述的五条，其中最重要的却不在图像分析上，而在于确定所要分析的目标以及如何把这个研究目的转换成图像分析的问题。这是图像分析的关键之处。

当然，如果是常用的分析测量，是已经有比较成熟的方法的，以免疫组化样品为例：

免疫组化的分析对象（分析测量的目标）是组织切片上特定蛋白的表达量。为了达到这个测量目标，先用特定抗体与切片反应，使之与切片上的特定蛋白结合，然后用DAB对结合了蛋白的抗体进行染色。这样，DAB的染色深浅及范围就能反应切片上相应蛋白的表达量了。所以免疫组化技术就是把切片上“蛋白表达量”这个研究目标转换成了切片上“黄色染色物的分布”这个图像

分析问题。

荧光标记的免疫组化图片与此类似。

另一个例子：

利用凝胶电泳方法来测量RT-PCR产物的分子量及质量（重量），研究目标是样品中各种DNA 片段的分子量与质量。通过电泳把加样孔中的样品分布到泳道之中后，不同分子量的产物成份会分布到泳道的不同位置，形成条带。用EB染色后，在紫外灯照射下各条带发出荧光，就能显示出条带的位置与强度信息。这样就把研究目标（产物的各组分分子量与该组分的量重）转换成了凝胶图像上的条带的位置与光密度这个图像分析问题。

具体到前面提到的那些没法回答的问题，实际上就是提问的信息不够，没法确定如何把研究目标转换为图像分析问题。当然，这类分析方法往往是从文献上查找到的，是已经有的分析方法，这时候就要仔细学习参考文献上相关的叙述，弄明白文献上的方法是把分析目标转换成什么样的图像分析目标。明确了这一点后，才能考虑如何通过图像分析软件实现正确的测量。甚至进一步改进测量方法。

二、正确地处理样品并进行拍摄。

处理样品主要是指对切片作正确的染色。虽然染色的方法基本上有一个规范的程序，但进行图像分析的时候，根据分析目标对染色方法作适当的优化能让分析测量更加方便准确。

在免疫组化切片染色时，由于要分析比较染色深浅，所以在制片时就要强调以同样条件制作所有的组织切片。曾经遇到一位，在染色时，遇到阴性样品就有意延长一下显色时间，让片子黄一点，结果是阴性结果的光密度测量数值与阳性样品一样大。

如果要分析细胞核，就得特别注意苏木青蓝染的深浅要适当，一般情况下，浅浅的蓝色只能标记出细胞核的位置，明显的蓝色才适合于进行细胞核尺寸的测量或对细胞进行计数。而在进行细胞核上蛋白的免疫组化分析时，过浅的蓝染会导致细胞核选择困难，过深的蓝染则会掩盖免疫组化产物的颜色。

关于荧光免疫组化的染色就更复杂了，单染色的样品要注意样品荧光与背景荧光的对比度要足够高。双染色的样品还要注意两种染料的荧光强度应当适配，不要一种颜色的荧光特别强，另一种特别弱。最常见的是红色荧光特别亮，而FITC的绿色却很弱。结果是在拍摄时绿色的荧光实际上是红色荧光图像的绿色分量。

拍摄样品时影响的因素更多，更容易出错。

在拍摄大体物品时要特别注意背景与物体之间的对比。在拍摄离体组织器官时，把组织块放在干净的白纸或黑纸上以保证组织图像与背景之间有清晰的分界线，在两侧各用灯光照明以避免留下影子。在缺乏照明条件的时候，也可以选择在室外背光处拍摄，既有足够的照明也能避免明显的阴影。

一般的组织切片只要正确选择视野并拍摄清楚就行了。而免疫组化的样品却额外要注意拍摄时的曝光：以同样的曝光条件拍摄样品。特别是荧光，一个对照组的弱荧光样品，就应该拍摄得光强较弱，阴性的甚至拍摄出一张黑照片。如果有意延长弱样品的曝光，照片虽然漂亮，但其表现的光密度就与阳性样的强荧光差不多了。所以在我介绍免疫组化样品的分析方法之前，都是先强调如何拍摄样品。

在使用倒置显微镜拍摄活细胞的时候，很多人并未注意到在显微镜上方的灯光筒下边有一个长方形可推移的板，上面有三四个大小不一的园孔，这几个孔的位置是与物镜的选择有关的。高倍镜要使用小孔，低倍镜用大点的孔。选择不对的时候，观察图像的反差不好。

拍摄彩色照片的时候，相机色彩也是常被忽视的。最常见的是拍摄的照片色彩偏蓝。这对分析免疫组化图片的影响非常大。偏蓝的照片不仅降低了黄色深色的深浅程度，而且会使较浅的黄色变成了白色甚至浅蓝色。

三、确定图片上的测量目标

在分析图片时，虽然我们嘴上说的是测量细胞、细胞核或胞浆。但是心里应该有一个概念，就是实际上我们测量的是图片上的一片黄色，一个蓝色的园斑，或者一些边界线围成的区域，或者是某种色彩组成的区域。有了这个概念，才能真正地把研究目标转换到图像分析的目标。进而进行正确的测量。

生物图像几乎没有直线、正方或圆形这样规则的图形。因此，要测量对象的长度，面积，直径这些指标时，是需要考虑该如何进行近似测量或等效测量的。软件可以准确测量不规则曲线的长度与不规则区域的面积。其他的指标往往就需要作等效计算或近似计算。

例如：测量细胞的半径。可以先测量细胞的面积，然后利用area=pi *r^2公式计算其等效半径。也可以通过细胞中心画一组放射线，测量细胞在这些放射线方向上的直径，然后取平均值作为它的近似测量值。这种测量等效值或近似值的方法在几何测量中经常用。我个人认为测量等效值更准确一些。

选择测量目标的另一个原则是要保证测量的可重复性。即使是手工测量，也应当保证两次独立的重复测量数值不会有太大的差异。

四、使用软件测量

说到这里，才算是提到了图像分析软件了。

实际上Image-pro plus不过是许多种图像分析软件中的一种。它是一种通用的图像分析软件，不仅是用在生物图像分析上，在其他场合用得更多。其优势当然是功能强大，操作也顺手。缺点只有一个，就是贵。请大家不要在此场合讨论非正版软件的问题，这不符合丁香园网站的规定。通用的软件适合于多种场合下的应用，专用的软件则有特定的应用场合，比如凝胶电泳分析软件，它的功能范围远比不上通用的图像分析软件，但是在分析凝胶电泳图片时，它却非常方便。这次既然提到了关于RT-PCR凝胶图片的分析及Western blot膜的分析，就得提到Image-pro plus 的姊妹软件：gel-pro。如果使用IPP来分析电泳图片，恐怕会相当麻烦而且结果会比较粗糙。用gel-pro来分析就轻松得多了。

Image J也是图像分析软件。与IPP的功能类似，操作当然有不同。优点是能自己编制处理功能，但要作到这一点却是有难度的。

专门分析凝胶图片的软件是很多的。常用的除了gel-pro之外，还有bandscan，quantity one, visionworks等，它们大多是与凝胶拍摄系统一起购买使用的。分析原理都一样，操作上略有不同，功能基本上都差不多，用哪个都行的。用惯了IPP，再用gel-pro会熟悉一些。

使用凝胶电泳分析软件可以分析DNA凝胶图片，RNA凝胶图片，蛋白质的凝胶电泳图片，Western blot膜的照片，化学发光作的Western blot胶片等。

具体的软件操作步骤不是本讲座的重点。在另外文章里，有关于Image pro plus以及gel-pro 软件的详细具体的操作方法。

五．测量数据的统计分析。

实际上统计分析测量数据依然是把研究目的转换成图像分析的问题的一部分。虽然是最后进行的工作，但在一开始就需要考虑对测量数据该如何处理。

在最理想的情况下，使用软件能准确地识别图像上的测量对象，识别准确了，测量也就准确了。生物图像本身是相当复杂的。软件不能识别测量对象的情况非常普遍。往往只能手工选择测量对

象，这当然会有误差。在更多的情况下，测量对象有许多，手工无法全部选择上，这时候还得更退一步，选择部分对象进行抽样测量，这就必须要统计分析。

实际上，在分析组织切片的时候，拍摄照片本身就是一种抽样。你不可能把切片全部拍摄下来，而是选择几个视野拍摄下照片。在哪里拍摄就有讲究了。再深一步探究，就连在组织块的哪个部位作切片也是一种抽样。这是图像分析软件所无能为力的。所以从根本上来说，如何进行测量数据的统计分析并不是图像分析的问题，而是实验设计的问题。与图像分析有关的是，实验设计时必须考虑到图像分析的因素。才能实现最终的实验目标。

有句俗话叫“功夫在诗外”。要想写出好诗，关键并不在于写诗的技巧有多高，而在于诗人的境界有多高。类似的，要想应用好图像分析软件，关键并不在于对软件的操作技术有多熟悉，更重要的却在于实验设计上。在设计实验的过程中就要考虑如何利用图像分析来得到有意义的实验结果。有的时候，通过图像分析能得到眼睛看不出来的有意义的实验结果。

免疫组化技术是当今广泛应用的检测组织切片内特定蛋白的实验手段。利用图像分析软件来判读切片图像上蛋白表达程度是随着软件技术的发展逐步应用到免疫组化技术中的。

组织上的蛋白表达程度，在图片上表现为免疫染色的深浅及面积大小。用肉眼只能定性地进行判读，最多粗略地作一个主观的分级评价。使用图像分析软件则可以对图片染色的程度作一个定量的测量。这个测量结果与切片上的蛋白表达强度有理论上的线性相关性。所以能客观定量地反映它。

在图像分析的方法中，使用灰度来表示一个点的明暗程度，而图片上一个点的明暗程度是与切片上免疫染色物的“光学密度（OD，Optical Density ）”决定的，再往下追踪一步，就是与组织切片上这个点的蛋白表达程度决定的。这有点类似于分光光度计的情形，比色皿里液体样品的吸光度与液体中吸光成分的浓度相关，符合朗伯-比尔定律。图片上一个点的光密度则与该点上的蛋白表达程度正相关（近似为正比）。所以测量一个点的光密度值，就是在测量这个点上蛋白表达程度的一个相对的量值。

朗伯-比尔定律：A = lg(1/T) = kbC

A为吸光度,T为透射比,是投射光强度比上入射光强度

c为吸光物质的浓度b为吸收层厚度

请注意：郎伯比尔定律中的指数关系表现在吸光度A与透射率T之间。吸光度A就是光密度O D。它与样品浓度是线性关系。所以图片上光密度值与蛋白表达之间的关系理论上也是线性的。但它与灰度值之间的关系是指数的。因此，测量光密度值能更紧密地与蛋白表达程度相关，而灰度值则类似于透光率，它与蛋白表达程度的关系是朗伯比尔定律的反向的指数关系。这就是我一再强调要测量光密度值的原因。

在分光光度法中，我们需要作标准曲线来定量分析样品的实际浓度，但在组织切片的情形下，是没法作标准曲线的。所以我们只能测量到一个相对值。能对不同点的蛋白表达程度进行比较，但不能测量到这个点的蛋白量具体是多少微克。把一片区域内所有的点的光密度值累加起来，就得到一个积分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。图片上一片片的染色斑块的深浅与范围反映了切片上的特定蛋白表达的程度，它可以由图片上的积分光密度来相对定量地来表示。

光密度值是一个相对的数值，所以它是没有单位的！所以后面的积分光密度值与平均光密度值都是没有单位的。

这种相对的测量数值对我们设计图像分析方法有直接的影响。我们没法通过图像分析的方法测量出切片上有多少测定的蛋白。只能通过比较的方法来判断实验组样品与对照组样品之间的蛋白表达差异。

无论使用什么图像分析软件，测量原理都是一样的。就是测量图片上一个区域内的黄色染色物的积分光密度。但是具体测量哪些区域的积分光密度以及最后要如何作统计分析，就不是一个简单的图像分析问题了，而是与研究目标密切关联的实验设计问题。这也就是我无法说出该选择什么样的测量区域来计算区域面积与区域内光密度值的原因。我只能总结出一个规律，就是要计算一个平均光密度指标来进行实验组样品与对照组样品的统计比较。也就是计算出测量区域内的积分光密度值，然后对这个区域的面积进行平均。以这个平均光密度值作为统计比较的依据。

示例：根据实验设计选择的测量指标：

注意上一帖的右图是阴性对照的典型图片。在测量这种图片上的平均光密度的时候，IOD会是一个极小的数值。但是在选择测量区域的时候，则需要与阳性样品一样选择一个较大的测量区域，所以最后计算出来的平均光密度值会也是一个极小的数值。

一个常见的错误是对这种阴性样品进行测量时，以染色区域面积作为计算平均光密度值时使用的面积。要知道虽然整张照片的染色很浅。但某些细小的点上的密度却不小。如果只计算这些染色的小片区域，最后计算出来的平均光密度值将是一个不小的错误数值。

直接比较整张图片的积分光密度值。实际上测量面积就是整张图片的面积。

比较特定区域的平均光密度值。在一张图片上有许多区域的时候，可以只抽取其中部分试样来测量的。这影响到的是抽样量。当然，应当尽可能地测量图片上全部应当测量的区域。

同一张图片上不同的区域之间进行比较。这时候一张图片上能得到一对数据，全部样品测量数据可以作配对T-检验。

测量图片上一个特定区域内的平均光密度。注意选择测量区域的时候，选得不太准不要紧，这仍然是个抽样的问题，它对平均光密度值的影响是很小的。

测量区域就是染上了颜色的细胞，此时在测量黄色的IOD值的时候能同时测量出面积来。不必另外去选择测量区域。根据实验设计可以有多种测量指标供选择：每个细胞的面积，积分光密度，平均光密度，照片上的细胞数量（其实就是细胞密度）等等。

测量了图片上特定区域的IOD之后，还需要测量这个区域的面积。然后计算出一个平均光密度值（mean optical density = IOD SUM / area SUM）在整个分析过程中，一般每张图片测量出的只是一个平均光密度值，作为一个测量数据。一张切片则需要拍摄多张照片，这些照片各自的光密度平均值平均之后可以作为这张切片的测量数值。一个实验样品又可能会制作多张切片，所以最终一个样品（一块组织，一个动物，一个病例等）的测量数据就是所有这些照片的平均光密度值的平均值。在两组实验样品的统计处理中，就是把每个实验样品的所有照片的平均光密度值再作一次平均，作为该样品的测量数值。一组样品的测量值再计算其平均值与标准差进行统计分析。

对细胞核上蛋白的免疫组化测量有其特殊性。如果蛋白只在细胞核上表达，则不需要对核作蓝染，切片上只有细胞核上有黄色染色物。可以直接进行分析测量。

在更多的情况下，对细胞进行蓝染是必须的。只有染上蓝色才能判断细胞核的区域。但同时，蓝染对细胞核的光密度测量造成了严重干扰。会导致光密度测量值的极大误差。这时候用肉眼主观判断与图像分析测量的结果基本上没啥区别了。一个主观的定量方法就是用肉眼判断阳性细胞核与阴性细胞核，然后计数其比例作为一个定量的测量值。但这只适用于切片上有两类细胞的情况。测量细胞核上的免疫组化图片需要从染色开始就要考虑其分析测量过程。过程会比较复杂。这也相当于一个实验方法的研究课题了。

关于使用荧光染料染色的荧光照片，使用图像分析方法测量其荧光强度是不被提倡的。这并不是因为图像分析软件测量不了图片的光密度，而是因为在荧光图片的拍摄过程中，完全不能把切片的荧光强度正确地表现到图片的光密度上。最终的定量分析结果恐怕还不如镜下目视的判断结果准确。

Rheumatoid factor interference in the determinat ion of carbohydrate antigen

19-9 (CA 19-9)

Clin Chem Lab Med 2006;44:1137－1139

Background: Investigation of a 61-year-old Caucasian male suffering from fatigue and weight loss led to the finding of a carbohydrate antigen 19-9 (CA 19-9) concentration of 80 kU/L using an ADVIA Centaur analyser. Determination of CA 19-9 on Vidas, AxSYM and Architect i2000 systems gave normal results. His rheumatoid factor concentration was very high (900 kIU/L) and assay interference was suspected.

Methods: Besides using several laboratory procedures to show the cause of the interference, we tried to estimate the frequency of the suspected interference. Therefore, two studies were performed. The first was carried out in a multicentre setting using four different CA 19-9 methods on 51 randomly selected samples with high rheumatoid factor concentrations and ten samples containing no or very low rheumatoid factor. In the second study we used heterophilic blocking tubes for 68 routinely analysed samples with CA 19-9 concentrations ranging between 37 and 250 kU/L using an ADVIA Centaur analyser.

Results: In the multicentre study we found eight discrepant CA 19-9 results, but only one was clearly due to interference. We showed that the interference detected, just as in the index case, was caused by rheumatoid factor. The other discrepancies could not be explained, but are probably related to method-dependent differences. In the 68 routinely analysed samples, no interference could be shown using the heterophilic blocking tubes.

Conclusions: Although interferences in the CA 19-9 assay are not frequent, the ADVIA Centaur system appears to be more sensitive to rheumatoid factor i nterference. The lack of standardisation remains an important issue for this assay. The determination of CA 19-9 during the follow-up of patients should be performed using a single method. If, however, there is any clinical doubt about a result, CA 19-9 should be determined using another method to exclude possible interferences.

杂志连接：

https://www.360docs.net/doc/6d8603913.html,/doi/abs/10.1515/CCLM.2006.205

其实RF是个是个干扰免疫学检测的因素之一，已有多篇报导发表在检验专业主流杂志上。有兴趣的站友可以去pubmed一下。

类风湿因子干扰糖类抗原19-9（CA19-9）的测定

Clin Chem Lab Med 2006;44:1137－1139

背景：调查有疲劳，体重减轻症状的61岁男性白人, 使用拜耳ADVIA Centaur分析仪发现糖类抗原19-9（CA19-9）浓度为80kU/L。Vidas，AxSYM和Architec i2000系统测定CA19-9正常。他的类风湿因子浓度非常高(900 kIU/L)怀疑有分析干扰。

方法：除了几个实验室查找干扰的原因外，我们也试图估计怀疑干扰的频率。因此，进行了两项研究。首先是进行了一个多中心用四种不同的方法随机抽取测定51个高类风湿因子浓度样品和10个不含或含非常低浓度类风湿因子样本的CA19-9。在第二项研究中，我们对使用ADVIA Ce ntaur分析仪常规测定CA 19-9浓度介于37和250kU/L的68例样品使用嗜异染阻断管。

结果：多中心研究中我们发现8例CA19-9的结果有差异，但只有一个显然是由于干扰造成。表明类风湿因子干扰检测。其他的差异无法解释，但可能与方法不同有关。在68例使用嗜异染阻断管常规分析样品未显示受干扰。

结论：虽然CA 19-9受干扰不频繁，但ADVIA Centaur系统似乎对类风湿因子的干扰更加敏感。缺乏标准化仍然是一个重要的问题。对于监测随访病人的CA 19-9应该用同一个方法。但是，如果临床对CA 19-9结果有任何的疑问，应用其他方法来排除干扰的可能。

1.Ki67是一种大分子的蛋白质,相对分子质量为345×103 及395 ×103 ,位于细胞核内，是一种存在于增殖细胞中的核抗原，是一种与细胞周期相关的蛋白质其确切功能目前尚不清楚．但通过研究它的表达及在核内分布的情况，认为它的功能与染色质相连与细胞有丝分裂有关，因此是目前应用最广泛的增殖细胞标记之一。Gerdes等研究表明Ki67免疫的反应与细胞周期密切相关，在G1、S、G2、M期均表达，但G0期无表达，而且还发现Ki67在G1晚期／S早期微量表达，S期聚集，尤其在后半期表达率明显增高，有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定簇，故认为Ki67是检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一。

2. 目前有研究表明在多种实体恶性肿瘤中Ki67的表达远高于正常组织，并与恶性肿瘤的发展，转移及预后有关。国外有报道Ki67在乳腺癌组织中阳性率为78.0％。有报道Ki67的表达与乳腺癌肿瘤的生长和浸润以及淋巴结转移之间存在着密切相关性，即Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性程度大，细胞增殖活跃，因此肿瘤生长速度快，侵袭性大，转移的机会高，预后差。但其机制目前尚不清楚。