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翟中和《细胞生物学》(第4版)配套题库【考研真题精选+章节题库】

翟中和《细胞生物学》（第4版）配套考研真题精选一、选择题 1在英国引起疯牛病的病原体是（）。[中山大学2019研] A．阮病毒 B．RNA病毒 C．立克次体 D．支原体 【答案】A查看答案 【解析】疯牛病，又称为牛海绵状脑病，是动物传染性海绵样脑病中的一种。疯牛病为朊病毒引起的一种亚急性进行性神经系统疾病，通常脑细胞组织出现空泡，星形胶质细胞增生，脑内解剖发现淀粉样蛋白质纤维，并伴随全身症状，以潜伏期长、死亡率高、传染性强为特征。 2SARS病毒是（）。[武汉科技大学2019研] A．DNA病毒 B．RNA病毒 C．类病毒 D．朊病毒 【答案】B查看答案 【解析】A项，常见的DNA病毒有痘病毒科的天花病毒。B项，SARS属正链RNA病毒，流感病毒属负链RNA病毒，HIV属RNA病毒中的反转录病毒。C项，常见的类病毒有马铃薯纺锤块茎病类病毒。D项，引起疯牛病、羊瘙痒病、人克雅氏症的病毒为朊病毒。 3体外培养的成纤维细胞通过（）附着在培养基上。[中山大学2019研]

A．黏合斑 B．黏合带 C．桥粒 D．半桥粒 【答案】A查看答案 【解析】体外培养的成纤维细胞通过黏着斑贴附在培养皿基质上，微丝终止于黏着斑处，这种结构有助于维持细胞在运动过程中的张力以及影响细胞生长的信号传递。 4动物细胞中cAMP的主要生物学功能是活化（）。[中山大学2019研] A．蛋白激酶C B．蛋白激酶A C．蛋白激酶K D．Ca2＋激酶 【答案】B查看答案 【解析】一般认为，真核细胞内几乎所有的cAMP的作用都是通过活化蛋白激酶A，从而使其底物蛋白发生磷酸化而实现的。 5适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是（）。[武汉科技大学2019研] A．荧光显微镜 B．相差显微镜 C．倒置显微镜 D．扫描电镜 【答案】C查看答案 【解析】A项，荧光显微镜主要用于细胞内蛋白质、核酸、糖类等组分定性定位的研究中。

流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤

流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤 分享 首次分享者：☆秋秋☆已被分享29次评论(0)复制链接分享转载举报一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN- COULTER公司。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA 和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，?多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，，一般流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力，鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息

流式细胞术原理及功能介绍

流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统

流式细胞仪细胞分选的操作步骤

细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞

「实验笔记」流式细胞术实验过程中的操作要点

「实验笔记」流式细胞术实验过程中的操作要点 流式细胞术可以同时分析单个细胞的多个参数。目前广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量等方面，在流式流式细胞术实验过程中，以下操作要点一定要注意，避免影响实验结果。 1、上机前处理 小心荧光淬灭 操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办?可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。

注意染色顺序 在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。 选好染色方案 染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。(考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。) 做好阴性对照及同型对照试验 细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。 同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。

选择合适的抗体 通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。 2、参数设定 数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。 电压 电压的调节需根据阴性对照管来调节。

流式细胞术样本制备.

样本制备实例: 细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining 原理: 对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。 材料: ?被检测细胞 ?FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用 ?相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 步骤: 1. 在 100 μL外周血加入抗体: a. 同型对照:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL b. 单阳管:PB 100μL +CD4 FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL c. 单阳管:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+CD8 PE 20 μL+ Isotope APC 5 μL

人体流式细胞术参数的正常参考值资料讲解

人体流式细胞术参数的正常参考值 外周血中各种流式细胞仪检测指标的正常参考值 T细胞表面标志细胞名称平均数±标准差范围 T细胞抗原 CD2 总T细胞76.28±7.68 62.5~89.0 CD3 成熟T细胞69.98±5.79 61.1~77.0 CD4 T辅助/诱导性细胞亚群32.25±5.16 15.8~41.6 CD5 T细胞（B细胞亚群）77.06±7.34 69.5~8.8 CD8 T仰制/细胞毒性细胞亚群25.08±4.34 18.1~29.6 CD28 T细胞受体共刺激分子49.59±9.30 39.5~64.8 CD8+/CD28+ 细胞毒性T细胞13.22±4.18 8.6~15.5 CD8+/CD28- T仰制性细胞15.99±5.13 9.9~24.8 CD3+/HLA-DR- 静止T细胞67.10±11.69 55.3~77.1 B细胞抗原 CD19 全部B细胞11.56±2.54 7.3~18.2 CD20 全部B细胞12.20±2.92 NK细胞抗原± CD3-/CD(16+56)+ NK细胞14.91±4.87 8.1~25.6 单核巨噬细胞 CD14+ 单核细胞 5.10±2.00 活化细胞表达抗原 CD3+/HLA-DR+活化T细胞 3.05±1.34 1.2~5.8 CD3-/HLA-DR+活化B细胞7.42±3.22 3.0~11.7 CD3+/CD2 5+活化T细胞15.94±3.67 1.01~2.20 CD5+/CD19+活性B细胞 4.65±1.51 3.1~6.6 CD69 活化诱导分子（AIM） 2.09±0.87 0.8~3.5 CD38 活化T细胞51.07±5.67 42.4~60.0 免疫调节细胞 CD4+/CD29+ T辅助性细胞诱导亚群16.92±5.35 9.8~26.0 CD4+/CD45-RA+ T仰制性细胞诱导亚群20.51±3.64 15.0~25.0 其他参数 HLA-DR MHC-Ⅱ类分子DR抗原10.93±4.51 6.1~17.0 CD45-RA 白细胞共同抗原CD45异型66.99±5.06 59.8~73.7 CD4/CD8值 1.42±0.89 0.98~1.94 I型变态反应介导分子 CD23 IgE低亲和力受体（Fc ） 3.19±0.65 1.9~4.4 IgE 膜结合IgE 1.95±0.89 0.9~3.7 造血干细胞、祖细胞 CD33 粒细胞前体25.90±3.32 21.3~30.4

最详细的流式细胞仪实验方法

流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病

第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.

（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通

BD FACSCalibur流式细胞术标准操作规程

BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序 目的： 规范BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。 适用范围： 本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。 责任者： 操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。 保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。 科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。 内容： 1. 每日开机程序 1.1 在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认： 1.1.1鞘液充满状态，约3L 1.1.2盖紧盖子 1.1.3安上金属挡板 1.1.4管路畅通，无扭曲 1.2. 检查废液桶，确认： 1.2.1废液桶充满400ml漂白剂 1.2.2管路畅通，无扭曲 1.3打开流式细胞仪。 1.4打开电脑。 1.5气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。 1.6做Prime。 1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。 2. 每日关机程序 2.1 用3mlFACSClean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。 2.2 将样品支撑架置于中位，以HI RUN运行10分钟，使内管吸入约1ml。 2.3 将样品管换成蒸馏水重复1-2步。 2.4 放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。 2.5 选择Standby模式10分钟，将激光冷却后可关掉主机。 2.6 退出所有应用软件，关闭电脑。 2.7 将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。 3. 每月维护程序 3.1 将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。 3.2 旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINE FILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联

流式细胞术实验方法

流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。 9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。

流式细胞分析技术讲解

流式细胞仪分析技术及应用 第一节概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节流式细胞仪技术要求 一、检测样品制备 二、常用的荧光染料与标记染色 三、胶乳颗粒的应用 四、流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求 第五节、流式细胞仪的科研应用 第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用 一、细胞周期和DNA倍体分析 二、染色体分析 三、细胞表面标志的检测 1、淋巴细胞及其亚群的分析 2、淋巴细胞功能分析 3、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。 流式细胞术主要包括：1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、数据的采集和分析技术 流式细胞术发展史: ?1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究 ?1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 ?1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 ?1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 ?1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 ?1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 ?1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 ?1972年Herzenberg研制出细胞分选器 ?1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂 ?大量厂家不断生产流式细胞仪 ?目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司、BACKMAN COULTER公司 流式细胞术的特点： 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量 主要特点：单个细胞水平分析；多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度；可分析大量细胞；速度快：5000-10000个细胞/秒；统计学意义：提供细

(完整word版)流式细胞术步骤.docx

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 (设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组，2μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L 辛伐他汀组 正常对照组 (NC 组)：胰岛素终浓度 0.058mg/L A 组：辛伐他汀终浓度2μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； B 组：辛伐他汀终浓度5μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； C 组：辛伐他汀终浓度10μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； 于 37℃， 5%CO2 培养箱中孵育 48h） 2. 胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3.800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。 4.用低速振荡器边震动边加入5 mL 预冷的 70%乙醇，固定， 4℃过夜。 5.次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃上清，加入 4 mL PBS 清洗一次，用 0.4 mL PBS 重悬细胞。 6. 加入 5 μL RNaseA（ 10 mg/ml ） 37℃消化 1 （propidium iodide PI ）4℃避光染色过夜（或者小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶37℃避光染色 1 小时），在 EPICS XL 流 式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3 . 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到 1.5 mL离心管中。 4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm ，小型离心机离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 3 次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS 中。

流式细胞仪操作流程

查看文章 流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ 2008-11-01 10:20 一PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 l PBS溶液（配制方法见附录）； l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 l 70%乙醇 l 400目筛网 l 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去

免疫学实验：流式CBA多因子检测详解

简介：优宁维实验服务之CBA流式检测服务 提供商：上海优宁维生物科技有限公司 服务名称：流式细胞术CBA流式检测技术服务 服务名称标本要求实验周期单位备注CBA 可溶性蛋白50ul 1周每个样BD C6 FCM检测服务 Cytometric Bead Array简称CBA，那么什么是CBA呢？CBA，即微量样本多指标流式蛋白定量技术是一个基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。 CBA的原理 通过利用一系列带有荧光标记的微小、分散的微球连接特定 的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物，通过对应各种不同 检测物的特异微球上所带有荧光强度不同从而同时测定分析 样本中多种可溶性成分的数量。

CBA强大的优势 ?能够同时对单个样本进行多种检测。 ?较传统检测节省样本量9倍。 ?灵敏度高、重复性好。 ?所有分析只需一组标准曲线。 ?避免酶联反应所致人工假象。 ?节省操作时间。 ?节省检测时间。 革新的CBA技术与传统的蛋白定量相比有下列优点： 传统ELISA流式CBA检测技术 单项检测多参数检测 每项实验样本用量50-200ul样本用量少于50ul 需要抗原包被操作方便，节省时间 实验时间大于24h流式细胞仪自动检测，标准曲线自动测定，专用软件自动计算酶-底物背景干扰无酶-底物背景干扰 优宁维抗体相关实验技术服务 WB/IP/COIP、IHC、IF、FC、ELISA、多因子检测(CBA/MSD/luminex)、抗体芯片，流式检测… univlab@https://www.360docs.net/doc/6e12314167.html, 优宁维优势： 1、专业的抗体公司 2、博士后领衔团队 3、先进的实验仪器平台 4、可靠、放心 的结果 5、实惠、亲民的价格 6、认真、严谨的工作态度 优宁维公众平台：优宁维抗体专家

流式细胞术染色步骤

流式细胞术染色步骤 在染色之前，首先用1份固定破膜浓缩液放在3份固定破膜稀释液中稀释成想要的工作液的体积，这种缓冲液储存不能超过1天。例如，检测12个样本，用3ml固定破膜浓缩液加入到9ml固定破膜稀释液中。试剂盒中所提供的破膜缓冲液是10倍浓度的，在使用前应该用蒸馏水稀释成1倍的溶液，这种破膜缓冲液应在每次使用前配成新鲜的。 1,加100μl准备好的细胞（1×106）到每一个试管里； 2，通常先标记表面分子，使用大约0.125μg FITC -CD4和0.06μg PE - CD25 抗体放在100μl 流式着色缓冲液中。如果在特殊应用的时候最好滴定这些试剂。4℃避光孵化30min。Fc block可以在表面抗体孵化前加入； 3，使用冷流式细胞着色缓冲液清洗，离心并弃去清洗液1500rmp离心，5分钟4，悬浮细胞沉淀物，给每个样本加1ml准备好的新鲜固定/破膜工作液，再次悬浮溶液； 5，在暗处4℃孵化30min~18h（当用固定/破膜工作液孵化30min~18h不同的时间变化，只要用相同的供者样本，所得到的结果是具有可比性的） 6，用2ml破膜缓冲液洗涤细胞，离心并弃去上层清夜；2500rmp离心，5分钟7，重复步骤6； 8，0.5μg Fc block放在1倍破膜缓冲液，体积调整至100μl ，4℃放置15min；9，阻滞步骤后不用清洗，加0.5μg小鼠PE-Cy5-FOXP3（FJK-16S）抗体或者PE-Cy5-IgG2a同型对照抗体放入到1倍透化缓冲液中，暗处4℃至少孵化30min。要想在实验中得到最理想的染色请做进一步的滴定； 10，用2ml破膜缓冲液洗涤细胞，离心并弃去上层清夜；3500rmp离心，5分钟11，重复步骤10； 12，悬浮适当的流式细胞着色缓冲液体积，上流式细胞仪检测并且记录，由于固定和破膜的过程中细胞数量的FSC/SSC分布与肝细胞不同，因此需要在入口和电压上做出相应调整。 试剂盒内所含有的试剂： FITC -CD4 0.1ml （100μl）含50μg 浓度0.5μg /μl 0.125μg=0.25μl 稀释方法：2μl FITC -CD4+18μl PBS 浓度0.05μg /μl 0.125μg=2.5μl PE - CD25 0.25ml （250μl）含50μg 浓度0.2μg /μl 0.06μg=0.3μl 稀释方法：3μl PE - CD25+27μl PBS 浓度0.02μg /μl 0.06μg=3μl Fc block：0.1ml （100μl）含50μg 浓度0.5μg /μl 0.5μg=1μl PE-Cy5-FOXP3（FJK-16S）0.125ml （125μl）含25μg 0.5μg=2.5μl PE-Cy5-IgG2a同型对照抗体0.125ml （125μl）含25μg 0.5μg=2.5μl

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于 100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓

将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上

↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析

BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤_corr_ZYH_20140520

电子版本: \\NOVOPUBLIC\NovoBio\流式细胞仪\BD FACSCalibur 流式细胞仪简易操作步骤 _corr_ZYH_20140520 - 1 - BD FACSCalibur 流式细胞仪 简易操作步骤 一、开机 1） 先打开净化交流稳压电源，其次打开110V 稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。 2） 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT 位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN 位置。 二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件 1） 在屏幕下方点击CELLQuest （第四个图标） 启动软件。桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。

2）从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。 3）在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。 4）从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024；如果是双标，Y轴选择：FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明)，如果是单标，Y轴选择：SSC-H。 点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。

流式细胞术及其应用教程

流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称：流式细胞术及其应用教程 二、总学时数：38学时，2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象： 博士生、硕士生，专业不限