常用的细菌实验

常用的细菌试验

1. 细菌抹片、制备及染色

细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见其外貌；制成抹片和染色后，则能较清楚地显示其形态和构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

1.1细菌抹片的制备

1.1.1玻片准备：载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有残余油迹，可按下列方法处理：

1.1.1.1滴上95%的酒精2~3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯上轻轻通过几次。

1.1.1.2若上法仍未能去除油渍，可再滴1~2滴冰醋酸，用纱布擦净，在在酒精灯上轻轻通过。

1.1.2抹片：所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。

1.1.

2.1液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁）可直接用灭菌接种环取一环材料于玻片的中央均匀的涂成适当大小的薄层。

1.1.

2.2不是液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

1.1.

2.3组织脏器材料，先用镊子夹持局部。然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印或涂成一薄片。

1.1.

2.4如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一张玻片上有秩序地排好，做多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留的标本片，应贴标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

1.1.3干燥：上述涂片，应让其自然干燥。

1.1.4固定：有两类固定方法

1.1.4.1火焰固定：将干燥好的抹片，是涂抹面向上，以其背面在酒精灯上来回通过数次，略做加热（但不能太热，以不烫手为度）进行固定。

1.1.4.2化学固定：血液、组织、脏器等抹片要做姬姆萨染色时，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2~3分钟，取出晾干：或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2~3分钟，自然挥发干燥，抹片如作瑞氏染色，则不必先作固定。染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。

1.2常用的染色方法

常用的细菌染色方法，主要有两种类型：

1.2.1简单染色法：只应用一种染料进行染色的方法，如美兰染色法。

1.2.2复染色法：应用两种或两种以上的染料或再加媒染料进行染色的方法。如革兰氏染色、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆萨染色法等。

1.2.2.1吕氏碱性美兰染色法：

1.2.2.1.1染液配制：美兰0.3g、95%乙醇30ml、0.01%氢氧化钾溶液100ml。将美兰溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。

1.2.2.1.2染色法：抹片在火焰上固定后，加染液于玻片上，染色3~5分钟。水洗、吸干、镜检。

1.2.2.2瑞氏染色发

1.2.2.2.1染液配制：瑞氏染色剂粉0.1g、白甘油1.0ml、中性甲醇60.0ml。置燃料于一个干净的乳钵中，加甘油研磨至完全细末，再加入甲醇使其溶解，溶解后盛于棕色瓶中一星期，过滤于中性的棕色瓶中，保存于暗处，该染色剂保存时间愈久，染色的色泽愈鲜。1.2.2.2.2染色法：图片任其自然干燥；加染色液约1ml于涂片上，染色1分钟，是标本被染液中甲醇所固定；再加上与染色液等量的磷酸盐缓冲液或蒸馏水（或自来水）用口吹气，是染色液与蒸馏水充分混合，并防止染料的沉淀，经5分钟左右，使表面显金属的闪光；冲洗、吸干、镜检。

注：磷酸二氢钾缓冲液：磷酸二氢钾6.63g、无水磷酸钠2.56g、蒸馏水100ml。

1.2.2.3吉姆萨氏染色法

1.2.2.3.1染液配制：取吉姆萨氏染色剂粉末0.6g，加入甘油50ml，置于55~60℃温度中1.5~2小时后，加入甲醇50ml，静置一日以上，过滤后即可应用。

1.2.2.3.2染色法：加姬姆萨氏染色液10滴于10ml蒸馏水中，配成稀释的溶液，所用蒸馏水必须为中性或微碱性（必要时可加1%

碳酸钠液1滴于水中，使其变为微碱性）；抹片任其自然干燥，浸于盛有甲醇的玻缸中或滴加甲醇数滴于玻片上固定3~5分钟；于后将玻片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分钟或者染色数小时至24小时，过夜亦可；水洗、吸干、镜检。

1.2.2.4革兰氏染色法

1.2.2.4.1革兰氏液的配制：

1.2.2.4.1.1龙胆紫原液：龙胆紫粉末5g，加95%酒精100ml。石炭酸龙胆紫液：龙胆紫原液10ml，5%石碳酸液90ml混合，虑过后备用。

1.2.2.4.1.2碘溶液（鲁格氏液）：碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml

现将碘化钾2g加水30ml使其溶解，再将研碎的碘片1g加入，完全溶解后再加足量的蒸馏水，使其全量为300ml。

1.2.2.4.1.3脱色液：95%酒精。

1.2.2.4.1.4稀释复红：

碱性复红原液：碱性复红粉末10g，加95%酒精100ml。

石炭酸复红液：碱性复红原液10ml，5%石炭酸液90ml混合，放置过夜后滤过，贮褐色瓶中备用。

稀释石炭酸复红液：石炭酸复红液10ml、蒸馏水90ml混合后，即为稀释复红。

1.2.2.4.2革兰氏染色法

1.2.2.4.2.1在已干燥，固定好的抹片上，滴加龙胆紫染色液，

经1~2分钟，水洗。

1.2.2.4.2.2加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1~3分钟，水洗。

1.2.2.4.2.3加95%酒精于抹片上脱色，约30秒至1分钟，水洗。

1.2.2.4.2.4加稀释碳酸复红10~30秒钟，水洗。

1.2.2.4.2.5吸干、镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

[注]在进行各种染色时都应注意，当抹片滴上染色液后，不可以直接将剩余染液倾去，应用水连染液一起充分洗去，然后进行下一步骤，以免发生沉渣粘附，影响染色效果。

2.细菌培养

2.1培养基

常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基、和艳阳培养基。常用培养基制备的方法与步骤：配料——溶化——测定PH值——过滤——分装——高压——无菌检验，备用。

例如麦康凯培养基的制备方法：去麦康凯琼脂粉4.9g加1000ml无离子水中混合，放置20分钟隔石棉铁丝网微火煮沸使完全溶解，10磅10分钟高压灭菌。冷至50℃左右倾入无菌平皿内，凝固后冷藏备用。用途：作沙门氏菌分离培养及区别大肠杆菌。

2.2分离培养法

常用的细菌分离培养法有以下几种：

2.2.1需氧菌分离培养法

2.2.1.1平板划线分离培养法：此法为常用的细菌分离法。平板划线分离培养的方式很多，可按习惯选择应用。其目的是为了将被检材料作适当的稀释，使细菌长成独立存在的菌落，防止形成菌苔，以便根据菌落性状进行鉴别和纯培养。

2.2.1.2斜面划线分离培养法

2.2.1.3加热分离培养法

此法适用于芽孢菌的分离培养，尤其是当芽孢菌的病料中污染有非芽孢菌时，因芽孢菌耐热，故可采用法。其操作方法：

2.2.1.

3.1将固体被检物用生理盐水作5~10倍稀释，然后放在80摄氏度温水中10分钟，以杀灭非芽孢菌。

2.2.1.

3.2用白金耳蘸取上述溶液，按划线接种法接种在适宜的培养基上，孵育24小时后，就可以分离出芽孢菌。

2.2.1.4增菌分离培养法

被检材料中如果含菌量较少，估计用上几种方法不易达到分离细菌的目的时，可先行增菌培养。其法是将病料直接接种在普通肉汤培养基或血清肉汤培养基内，经18~24小时孵育后，再移植到其他适宜培养基内，以分离单个菌落。

2.2.1.5通过实验动物分离法

当分离某种原菌时，可将被检材料注射于感受性强的实验动物体内，如将结核菌材料注射于豚鼠体内，杂菌不得发育，而豚鼠终必得慢性结核病而死，实验动物死后，取心血或脏器用以分离细菌，有时甚至可以得到纯培养。

2.2.2厌氧菌分离培养法

厌氧菌生长繁殖的条件与需氧菌不同，它不需要氧气，当游离氧进入时，能使其死亡。培养厌氧菌时，都应用无氧培养基或无氧环境，通常采用各种方法以阻止氧的进入和人工驱除氧。艳阳培养方法很多，常用的有以下几种：

2.2.2.1加组织培养基分离培养法

即在液体培养基内加入肝、肾、心、脑、肉渣等组织作为还原性物质，吸收游离氧。如在培养基表面加一层灭菌流动石蜡，以杜绝空气进入，则效果更佳。

2.2.2.2焦性没食子酸法

此法是应用焦性没食子酸与碱性溶液作用后，形成焦性没食子酸盐，以吸收游离氧而造成无氧条件。本法操作简单，并容易分得单个菌落。

2.2.3二氧化碳培养法

2.2.

3.1蜡烛法

此法操作简单，不需要特殊设备，故较常用。培养时将接种好的培养皿放入有盖子的大玻璃缸内（如圆形标本缸），取蜡烛一支放在缸内点燃，烛火需距缸口10cm，盖好缸盖。周围涂凡士林，密封缸盖，当缸内氧气消耗完，蜡烛自灭，此时缸内约含10%的二氧化碳，将此缸置37℃条件下培养。

2.2.

3.2二氧化碳培养箱培养法

这是目前较先进的仪器设备，配有二氧化碳浓度控制系统及温控制指示系统，可用于细菌、细胞的培养，使用时按需要调整二氧化碳的浓

度及温度，将培养物置人培养。

3.细菌生化性状的检查

进行生化性状检查，必须用纯培养菌进行，不然容易出现错误的结果。生化性状检查的项目很多，应当根据诊断的需要适当选择。