分子生物学-背诵版

名词解析

1、原位PCR(in situ PCR):直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在完整细胞中进行PCR抗增的方法。

2、实时定量PCR(qPCR):在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。

3、易错PCR(error-prone PCR):通过改变PCR 条件，提高扩增产物的碱基错配率，从而获得与原来不同的 DNA 序列或基因。

4、分子信标：是一种茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团靠近。

5、荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)。如果检测到荧光信号超过阈值则被认为是真正的信号。荧光阈值通常设置为3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍。

6、Ct值（循环阈值）：PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值与模板起始拷贝数（起始模板量）的对数呈线性关系，模板起始拷贝数越大，Ct值越小。

7、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链的核酸内切酶，又称为内切酶或限制酶。

8、限制性核酸内切酶的星号活性：限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断。

9、质粒（plasmid）:是存在于细菌染色质以外，具有自我复制能力的双链环状DNA。

10、蓝白斑筛选：是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，主要为α-互补与抗生素基因。蓝白斑筛选在指示培养基上，未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。

11、转化：将质粒DNA或以质粒载体构建的重组DNA导入原核细胞细菌(大肠埃希菌)的过程。

12、包含体：是无定型的蛋白质聚合物，其中大部分（50%以上）是外源基因的表达产物，这些产物一级结构正确，但空间构像错误。

13、印迹：指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。

14、核酸分子杂交：指含有一部分互补序列、分子来源不同的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。

15、核酸探针（probe）：用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的标记互补片段。

16、荧光原位杂交（FISH）：是直接用荧光标记的核酸探针与组织切片或细胞涂片中的目标基因进行杂交的方法。可用于检测组织切片或细胞内某些特异性核苷酸或核酸片段。17、随机引物：含有各种可能排列顺序的6聚寡核苷酸片段的混合物。

18、receptor(受体）：位于细胞膜或细胞内的能特异识别和结合信息分子，并转导信号引起生物学效应的一类生物大分子。

19、ligand(配体）：与受体特异结合的生物活性分子。

20、hormone（激素）：指体内的某一细胞、腺体或者器官所产生的可以影响机体内其他细胞活动的化学物质。

21、growth factor（生长因子）：是能够刺激细胞生长、增殖、愈合和细胞分化的天然存在的物质。

22、signal molecule(信号分子）：具有调节细胞生命活动的化学物质。

23、cell communication（细胞通讯）：体内一些细胞发出信号，另一些细胞接收信号并将其转变为自身功能变化的过程。

24、signal transduction（信号转导）：细胞针对外源信息所发生的细胞内生物化学变化及效应的全过程。

25、extracellular signal molecules(细胞间信息物质):是由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称，又称作第一信使。

26、intracellular signal molecules(细胞内信息物质):在细胞内传递细胞调控信号的化学物质。

27、second messenger(第二信使):激素等配体作用于膜受体后，在胞内传递信息的信号分子。

简答题

1、多肽与蛋白质的区别与联系。

答：区别：⑴在结构上：多肽指的是多个氨基酸脱水缩合形成的线性氨基酸链，仅仅是蛋白质的初级结构形式，它没有空间结构。蛋白质是由氨基酸以脱水缩合的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的物质，具有一定空间结构的。⑵在功能上：多肽分子量较小，不一定具有生物学活性。蛋白质的分子量较大，一般都具有生物学活性。

联系：氨基酸是组成多肽和蛋白质的基本单位，所以多肽和蛋白质都能水解成氨基酸。蛋白质是由一条或几条多肽经过加工变形得到的具有复杂空间结构的大分子。

2、蛋白质的结构如何影响其功能。

答：⑴蛋白质一级结构是空间构象的基础，也是功能的基础。一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能，若一级结构发生改变影响其功能，称分子病。⑵蛋白质空间构象与功能有密切关系。生物体内蛋白质的合成、加工和成熟是一个复杂的过程，其中多肽链的正确折叠对其正确构象的形成和功能的发挥至关重要。若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病的发生，称为蛋白质构象疾病。

3、凝胶过滤层析的原理。

答：是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。当含有分子量不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入凝胶珠的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以分子量越小的蛋白质，从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大分子蛋白质，所以分子量大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。

4、PCR过程中的DNA模板变性、模板与引物退火、引物延伸3步的温度设置一般大致是多少？设置的主要依据是什么？

答：(1)DNA模板热变性 (denature)：94℃左右高温使模板DNA完全变性。(2)单链DNA 模板与引物退火 (annealing)：55℃左右引物与模板形成复合物的几率>>DNA分子自身的复性。(3)引物的延伸 (extension)： 72℃左右耐热DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应。

5、衡量PCR好坏的参数主要有哪些？一般来说好的结果如何体现？

答：(1) 特异性Specificity:最好只有目的DNA带。(2) 产量Quantity:DNA带明亮。

(3) 真实性Fidelity:DNA序列正确。(4)敏感性Sensitivity：极限值为1个DNA模板。

6、以TaqMan技术和SYBR Green I技术为例，简述实时荧光PCR的原理。

答：（1）技术原理：①TaqMan技术：加入TaqMan探针，PCR扩增时,Taq酶的5’→3’端外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光；每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。②SYBR Green I技术：SYBR Green I是能与双链DNA非特异性结合并发出荧光的一种染料，通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

（2）定量原理：①绝对定量：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过测定未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。②相对定量：a、选择内参照基因：选择GAPDH、β-actin等看家基因作为内参照基因，其在细胞内的表达量恒定，受环境因素的影响小，其结果代表了加入样品的量。b、计算相对表达量(△△Ct)=(Ct目的基因－Ct内参基因)实验组－(Ct目的基因－Ct内参基因)对照组。C、计算相对表达比率(2－△△Ct)，通过公式2－△△Ct计算相对表达比率；表示实验组目的基因的表达量相对于对照组目的基因表达量的倍数。

7、简述DNA重组技术的基本步骤。

答：(1)分：获取目的基因并进行必要的改造。(2)切：选择载体并用适当的限制性内切酶切割。(3)接：将目的基因与载体连接成重组DNA。(4)转：将重组DNA导入宿主细胞。

(5)筛：含重组DNA宿主细胞的克隆化及鉴定。

8、简述获取目的基因的4种主要途径。

答：（1）酶切法直接分离目的DNA片段：①从载体上切割DNA片段。②构建基因组文

库。（2）PCR和RT-PCR技术体外扩增合成目的DNA片段。（3）筛选文库获得目的DNA片段。（4）化学合成-PCR搭接法获得目的DNA片段。

9、简述大肠埃希菌表达载体及其表达方式。

答：（1）非融合表达载体：仅表达目的基因编码的蛋白质或多肽。（2）融合表达载体：表达融合基因(目的基因+附加基因)编码的蛋白质或多肽。（3）分泌表达载体：加入了信号肽编码序列。（4）表面展示表达载体：噬菌体表面展示技术、细菌表面表达技术。（5）带分子伴侣的表达载体：促进蛋白质正确折叠。

10、简述真核表达载体中含有哪些的原核和真核的重要序列。

答：（1）真核表达质粒载体，一般由两部分组成，一部分（用于原核细胞）来源于pUC质粒，包括复制起始点OriC和ampr基因，用于在原核细胞中复制及筛选；另一部分（用于真核细胞）来源于病毒，包括PCMV（巨细胞病毒启动子）、新霉素抗性基因(neo)及polyA加尾信号序列，用于在真核细胞中复制、筛选及表达。

11、核酸探针标记的主要方法有哪些？简述DNA切口平移标记法、随机引物标记法和3′末端标记的基本原理？

答：主要方法有：DNA切口平移标记法、DNA随机引物标记法、3′DNA末端标记法。

(1) DNA切口平移标记法：当双链DNA一条链上有切口时，E.coli DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’的外切酶活性能从切口的5’端除去核苷酸；同时，5’→3’聚合酶活性可将核苷酸连接到切口的3’羟基末端；使切口沿着DNA链移动。用一种标记核苷酸代替原料dNTPs中对应的非标记核苷酸，使标记核苷酸掺入到合成新链中。（2） DNA随机引物标记法：使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针；用一种标记核苷酸代替原料核苷酸中对应的非标记核苷酸，使标记核苷酸掺入到合成新链中。（3）3′DNA末端标记法：用一种标记核苷酸代替原料核苷酸中对应的非标记核苷酸，使标记核苷酸掺入到合成新链中。

12、简述采用Biotin标记探针进行North-South杂交原理和操作流程。

答：原理：首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的Biotin标记探针杂交来检测目的片段。流程：（1）电泳，转膜，紫外交联固定。（2）洗膜封闭。（3）杂交：生物素标记的探针与靶DNA 结合。（4）HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合。（5）底物在HRP催化下，反应发光。

13、列表对照下列蛋白激酶的中文名、激活剂及功能：PKA, PKC, PKG, PKB, MAPK, PTK(TPK)。

答：PKA(蛋白激酶A)：被cAMP激活，催化多种蛋白质丝/苏氨酸磷酸化。

PKC(蛋白激酶C):多种同工酶受二酰甘油 (DAG)、Ca2+、磷脂酰丝氨酸（PS）的激活，丝/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞多项生理活动。

PKG(蛋白激酶G):被cGMP激活，丝/苏氨酸蛋白激酶。

PKB(蛋白激酶B):可被PIP3、PDK激活，丝/苏氨酸蛋白激酶，与细胞代谢、凋亡、癌变有关。

MAPK(丝裂原激活蛋白激酶):被MAPKK激活，MAPK是多条信号通路的交汇点,与调节细胞生长、分化、凋亡有关。

PTK(TPK)，蛋白酪氨酸激酶（酪氨酸蛋白激酶）:被许多生长因子受体或src、abl、FAK等激活，与细胞生长、增殖、分化、癌变等有关。

14、比较几种膜受体的结构、作用机理和相应配体。

答：⑴G蛋白偶联受体

结构和作用机理：受体内有一些高度保守的半胱氨酸残基，对维持受体的结构起到关键作用。受体的N端可有不同的糖基化，C端的半胱氨酸在肾上腺素能α、β受体(α-AR, β-AR)和视紫质受体中可被棕榈酰化。受体的C-末端和胞内第三环含有多个 Thr和Ser残基可被磷酸化。胞内的第二和第三个环能与G-蛋白相偶联。相应配体：激素和神经递质。（2）单（个）跨膜α螺旋受体

结构和作用机理：与配体结合即具有酪氨酸蛋白激酶活性，可催化自身或其他底物蛋白磷酸化。相应配体：许多生长因子(EGF、PDGF、IGF-1)。

（3）鸟苷酸环化酶活性受体

结构和作用机理：胞外受体结构域、跨膜区域、膜内蛋白激酶样结构域、鸟苷酸环化酶催化结构域。相应配体：心钠肽（ANP）和鸟苷蛋白等。

（4）配体门控离子通道受体（分为阴离子通道受体、阳离子通道受体、）

15、G蛋白循环（分析G蛋白的活化、非活化状态）

答：⑴G蛋白的活化状态：当G蛋白的α亚基与GTP结合时，并且α亚基与β、γ亚基分离，G蛋白此时处于活化状态。⑵G蛋白的非活化状态：当G蛋白发挥水解酶的活性后，将GTP变成GDP并释放Pi，重新形成三聚体结构，此时G蛋白又变成非活化状态。

16、请用所学的信号转导知识简述霍乱的发病机制（生化机制）PS：附桥本病、Graves病。

答：霍乱是由霍乱弧菌导致的，霍乱弧菌产生霍乱毒素（CT），CT由A亚基和B亚基组成。其中A亚基具有酶活性，它能催化小肠粘膜上皮细胞上的Gs蛋白α亚基与NAD+反应，

生成ADP-核糖化的G蛋白α亚基,从而维持G蛋白α亚基活性状态，然后AC被激活，继而活化cAMP,最后激活PKA，它具有磷酸化的功能，使得小肠粘膜上皮细胞膜通透性改变，导致水、Na+、Cl-大量丢失，剧烈腹泻。

17、列表对比几条胞内信号转导通路的过程。

答：⑴cAMP-蛋白激酶A途径：受体和配体结合，引起受体变构，从而Gs蛋白被激活，然后激活AC，它在ATP的参与下变为cAMP，最后激活PKA，导致蛋白质磷酸化，产生生理学效应。

⑵Ca2+-依赖性蛋白激酶途径：①Ca2+磷脂依赖性蛋白激酶途径：受体和配体结合，引起受体变构，从而Gq蛋白被激活,然后激活PLC，它使得PIP2分解为IP3和DAG。IP3促使细胞钙库内的Ca2+释放入胞浆，而DAG在磷脂酰丝氨酸和Ca2+协同下激活PKC,最后发挥靶基因转录或靶蛋白磷酸化功能。②Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径：受体和配体结合，引起受体变构，从而Gq蛋白被激活,然后激活PLC，它使得PIP2分解为IP3和DAG。IP3促使细胞钙库内的Ca2+释放入胞浆（前面步骤和①一样），当Ca2+浓度较高时，会激活Ca2+-CaM,它从而激活CaM-PK，最后引起生物学效应。

⑶cGMP-蛋白激酶途径（不需要激活G蛋白）：①膜受体（可被心钠肽、脑钠肽等激活）：激素和受体结合后，然后激活GC（膜受体），它在GTP的协助下，使得cGMP被激活，最后激活PKG，使有关蛋白质或酶类的丝、苏氨酸残基磷酸化。②可溶性受体（可被NO、叠氮钠等激活）:NO与GC（可溶性受体）结合，使得cGMP被激活，最后激活PKG，使有关蛋白

质或酶类的丝、苏氨酸残基磷酸化。（和①前面一样）