植物组织培养

烟草的再生

前言：广义上的植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义上的植物组织培养指用植物各部分组织，如形成层。薄壁组织。叶肉组织。胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。目前广泛应用于科研及生产上的一种技术手段。

实验目的：对植物组织培养原理及过程有一个初步的了解，学习实验过程中的各种操作和方法。

实验原理：一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称这为细胞的全能性（Cell totipotency）。换句话说，细胞全能性是指植物细胞具有全套遗传信息，不管是性细胞还是体细胞，在特定环境下仍能进行表达，而产生一个独立完整的个体。

细胞一旦脱离了母体植株，拜托了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织，即指在人工培养基上外植体长出来的一团无序生长的薄璧细胞。

脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。

当试管苗在瓶内长满并长到瓶塞，或培养基利用完时就要转接，进行继代，可迅速得到大量试管苗，以便到一定数量时进行移栽。能否保持试管苗的继代培养，是能否得到大量试管苗和能否用于生产的重要问题。

因此，按培养过程可分为初代培养和继代培养两种类型：

（1）初代培养（Primary culture）：指外植体的最初培养。

（2）继代培养（Subculture ）： 将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。 若按照组织培养的材料可分为：

（1）组织、器官或细胞培养：指利用生物体各部分组织、器官或细胞进行离体培养，使之形成愈伤组织或完整有机体的技术。

（2）原生质体培养：指将微生物或植物细胞游离成原生质体，在适宜培养条件下，依据细胞全能性使其再生细胞壁，并进行细胞分裂分化，形成完整个体的技术。

植物组织培养过程为：

实验材料介绍：

烟草(Nieotiana tabacum L ．)，属茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)一年生草本植物．烟草含有尼古丁，是一种生物碱，具有神经毒性，尤其对昆虫是致命的，但可以刺激人类神经兴奋，有很强的成瘾性．有的烟草也可以用来制造杀虫剂，提取烟碱、苹果酸、柠檬酸?等．烟草是重要的经济作物和工业原料作物 ，其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料。最近证实可利用烟草细胞悬浮培养物获得细胞分裂素类物质。

目前，烟草一般采用有性繁殖，但繁殖的烟苗不均衡，易发生变异，而且易感病菌，造成多种病害发生，品质退化，从而影响经济收入．而通过组织培养技术，可以保持烟草优良品种的优良性状，减少病虫害，从而达到高产优质的目的．有关烟草组织培养已有不少报道，主要体现在以烟草叶片作为外殖体，近几年研究重属对烟草中片组织培养的影响也有部分报道”．

实验材料和仪器：

脱分化

再分化

材料：烟草叶片，MS培养基所需的各类药品，蔗糖，固体琼脂，1mol/L的NaOH，70%酒精，升汞溶液，蒸馏水

仪器：无菌操作台，锥形瓶，镊子，解剖刀，酒精灯，电子天平，烧杯，高压蒸汽灭菌锅，刀片，培养皿，量筒，培养箱，牛皮纸，玻璃棒，漏斗

实验方法与步骤：

1.母液的配制

准备好配制MS培养基所需要的各种药物和器材，计算好各种药品所需的量，准备足量的蒸馏水。

MS培养基配方（单位：mg）

大量元素（母液Ⅰ）

微量元素（母液Ⅱ）

铁盐（母液Ⅲ）

有机物（母液Ⅳ）

钙盐（母液V）

按照以上配方进行称取药品，母液一和五需配制200ml，母液二三四需配制

100ml。

配制母液一时可一起溶解，需要看清楚所用药品名称仔细对待。

CuSO

4·5H

2

O和CoCl

2

·6H

2

O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之

一，可先配成调整液。分别称取CuSO

4·5H

2

O 0.05g，CoCl

2

·6H2O 0.05g。各自

配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。且需注意添加的顺序以免产生沉淀。

配制有机溶液时需依次添加，即按顺序一个一个加。

配制铁盐时先将两种事迹混合均匀然后在火上加热至成为黄色澄清液体为止。

各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸

溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2.培养基的配制

我们组共配制了1L培养基，由于用的是固态的琼脂条，所以为了最后培养基内琼脂均匀故必须先加热溶解或每个小瓶中放置相同重量的琼脂条，加入一半左右的蒸馏水后加入20ml的母液一和五，分别加入5ml的母液二三四，加入1ml

的6-BA溶液，搅拌均匀，定容至一升,将pH值调至5.8到6.0之间。将每个锥形瓶中加入0.5g琼脂条，将配好的溶液进行分装每个锥形瓶中加入50ml。将锥形瓶瓶口用牛皮纸包住，扎紧。将后面将用到的镊子，解剖刀，培养皿等分别用报纸包住，与培养基，组培瓶一起进行灭菌。由于我们组的培养基中琼脂条是在灭菌时进行溶解的，故在灭菌完取出时需进行摇匀，不然会出现培养基上部与下部凝固程度不同，对以后实验产生阻碍。

3．接种

前期对接种室进行消毒，所需器具放在超净工作台上，紫外灯照射20min。

关掉紫外灯，采集一片烟草叶片先用酒精浸泡数秒，然后用0.1%升汞溶液浸泡3min，消毒后用无菌水漂洗3次。将漂洗好的叶片置于无菌滤纸上，吸干水分，

用解剖刀将叶片边缘和两端切去，将剩余叶肉切成0.5cm*0.5cm大小的小片备用。

左手拿装有培养基的锥形瓶底部，右手轻轻取下包头纸，将绳子放在大腿上，锥形瓶的瓶口靠近酒精灯火焰，瓶口倾斜，以免空气中的微生物落入瓶中。然后用灼烧后冷却的镊子将外植体移入瓶中，轻轻按压使植物能紧贴培养基。材料在培养容器内的分布要均匀，以保证必要的营养面积和光照条件。接完三个瓶后将镊子放回消毒酒精中，包好瓶口，做好标记。将瓶子放入组培架上，整理台面卫生。

定期观察烟草叶片的生长状况，及时记录并拍照，并移走霉变的锥形瓶。

实验结果：

烟草叶片的初代培养

实验分析及讨论：

由于实验时间的限制不能得到一株完整的植株，但至少我们看到了被培养的叶片小块有了很大的变化。在培养两周的时候已经看到有些叶片变白变薄了，这是由于在接种操作中的失误而使得一些叶片死去。活下来的叶片四角微微上翘还有点卷曲的情况出现，这说明叶片正在被诱导的过程之中。到了第四周的时候感觉叶片已经换了一层新绿，感觉生长的更加活跃产生了很大的卷曲，到了10月17号的时候已经明显有新芽出现。这些就是我观察到的实验结果。

实验体会：

每次实验课上完总感觉收获会比理论课多很多。像组织培养这种需要无菌操作的实验最能考察一个人的实验素养，一些细节上的问题往往是致命的。像在培养基母液配置的过程中如果出现一些错误也许就会使自己一个月的时间都白费了，还有由于我们的培养基在灭菌之前是没有化过的，本来这样操作会比较简便，但由于最后灭菌不是由自己负责的导致了最后得到的培养基上面很稀，叶片甚至会悬浮在里面，然而在底层却是异常的硬，给最后的清洗过程带来了极大的不便。这就是一些细节的问题，却让自己苦不堪言。其实在实验室我跟着研究生也是在做组培，但老是我做时被污染率是研究生的好几倍，总是会出现不规范动作。上完了组培，虽然和实验室组培的目的并不一样，但还是对这门技术有了另外的认识。

实验注意事项：

1.看清楚药品名称，不要加错。

2.灭菌前琼脂条未融的培养基灭完菌取出时进行摇晃均匀

3.前期实验准备过程之中要有全局意识，灭菌前应准备好所有后来无菌操作需

用的物品和培养基一起进行灭菌

4.在超净工作台上无菌操作时避免身体部位从瓶口或滤纸口划过，不对着超净

台讲话，防止细菌掉落

5.在升汞中浸泡叶片时需要小心翻动，防止叶片被破坏

6.进行无菌操作时需要冷静的头脑，注意用火安全

7.接种时镊子夹取叶片时当以对于叶片伤害最小为宜