植物蛋白酶抑制剂及其在抗虫植物基因工程中的应用

基因工程实验技术介绍

一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置

由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。（2）琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。（3）琼脂糖凝胶的染色电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液

植物基因工程实验技术

植物基因工程实验技术
编者: 赵燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月

前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1

目
实验一实验二实验三实验四实验五实验六实验七实验八实验九实验十附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
2

农杆菌介导的植物转基因技术实验指导

农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。实验一培养基配制一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。二、实验方法第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose

（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。

植物基因工程的重要意义

植物基因工程的重要意义关键词：植物基因工程技术，转基因正文：作为21世纪科技的重要发展项目，基因工程技术在植物方面应用的意义主要体现在以下五个方面。 1．植物基因工程技术可以实现超远缘育种,克服不亲和障碍我们知道，在作物育种中最早应用的是植物组织培养技术，这种技术已在花卉、药材、森林和农作物育苗得到广泛的应用，我国已在甘蔗、人参和马铃薯等方面收到显著经济效益。此外，还可从培养细胞或再生植株选择所需要的突变体。如Shepard(1983)从马铃薯培养物中选出一种能抗腹疫病(Phytophthorainfectans)的抗性植株以及利用培养细胞生产诸如喜树碱等化合物。但以上方法只是同类植株的基因改变。此外人们还对植物原生质体融合进行了研究。但是植物细胞融合后性状的表达，取决于它在以后有丝分裂时染色体是否发生交换或丢失情况。[1]但到目前为止，由融合的细胞而能培养成植株者容寥寥无几，这可以说是克服远缘杂交不亲和障碍的最早例子。如果说细胞融合可以克服种属之间不亲和性，而基因重组则可在更大范围内进行了。动物基因如萤火虫的发光蛋白基因,寒带鱼的抗冻蛋白基因,蛇、蝎的毒液基因等也已转移给作物,分别获得能发光的转基因烟草,抗寒的转基因甜菜、转基因番茄和抗虫的转基因棉花等。[2]由此可见，外源基因导入植物细胞后引发的改变是巨大的。 2．植物基因工程技术可以增强作物改良力度,促进品种更新换代作物改良基本有两方面，其中提高作物品种的光合与养分效率、病害与虫害抗性正在成为植物基因工程的研究重点,促使作物品种适应低温、干旱、雨涝、土壤瘠薄和盐碱以及温室效应等新旧灾害从而提高作物产量，也已成为基因工程育种的主要内容。农业生产中，增加粮食产量无非依靠两种途径:一是提高作物品种的生产能力;二是减轻环境因素对作物生长的不利影响。据报道，全世界每年因虫害、病害、草害以及寒冷、干旱、盐碱等灾害对粮食生产所造成的损失令人惊叹：全球每年因虫害与病害所造成的作物减产达30%以上，因杂草所损失的粮食至少在10%以上，再加上低温、干旱和盐碱等各种因素，全世界每年至少要损失粮食产量的一半以上。[3～5] 同时，为了防治病虫害及杂草等，还要施用大量的化学农药，这不仅消耗大量的能源，更严重的是对生态环境造成了极大的甚至是不可逆的破坏。为了摆脱上述困境，从20世纪80年代起，人们开始研究和利用转基因抗性植物来预防病虫害和杂草等，并收到了良好的效果。与传统作物育种技术相比，利用基因工程技术进行遗传育种有其自身的优势，一方面由于它可以将特定的抗性基因定向转移，因而成功率较高，可大大提高选择效率，在很大程度上避免了传统育种工作的盲目性；另一方面是其基因来源打破了种属的界限，除了植物基因以外，动物和微生物的抗性基因都可以作为外源基因转人植物基因组中，并获得表达。[6] 3．植物基因工程技术可以拓宽应用研究,扩大生产领域随着转基因植物技术日益成熟,利用植物的生物反应器作用,进行贵重药品、人畜疫苗和精细化工等的生产,因具有成本低,竞争力强的吸引力,正在成为高技术及其产业化的新兴热门领域。现已成功地将干扰素、胰岛素、多肽抗体、人血清白蛋白等基因转给植物进行这些药物的生产。美国现已得到多肽抗体转基因烟草,美国还在通过转基因植物研制麻疹、乙肝、艾滋病等疫苗,甚至成功地获得了口服植物疫苗。现国际上正在出现研制营养药物的新思路。此外,现还大量进行用于塑料、染料、涂料、洗涤、香料、润滑剂等的转基因植物研究。据

植物基因工程真题资料

植物基因工程真题(2011-2013) 一、名词解释 1. Southern blotting：是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的大分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些大分子物质的过程。 2. cis-acting elemen t顺式作用元件，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。 3. subcloing: 4. Gene libray 5. Yeast Two-Hybrid Assays: 6. qRT-PCR 7. Shuttle plasmid vector 8. insert in activati on 9. cDNA library 10. RNAi 11. Gene kn ockout 12. Tran sducti on and tran sfect ion 13. DNA probe 14. En zyme-li nked immuno sorbe nt assay 15. Tran spositi onal recomb in ati on 16. EST

17. Fluoresce nee in situ hybridizati on 18. q-per 19. SNP 1. Per 反应原理和步骤；基本反应过程有哪些；反应体系与反应条件？简要介绍温度和时间设臵间的关系? PCR 反应原理：DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现， DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物， DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。步骤：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至（90-96C ）左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火（复性）：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至（ 25-65C ）左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在（70-75C ）、DNA 聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的？半保留复制链？，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2?4分钟，2?3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。标准的反应体系： 10 X 扩增缓冲液 4种dNTP 混合物引物模板DNA Taq DNA 聚合酶 Mg2+ 加双或三烝水至 5ul 各 200mol/L 各 10?100pmol 0.1 ?2 ig 1?2 U 1.5?2.0mmol/L 50 il 反应条件：为温度、时间和循环次数。温度和时间设臵间的关系：基于PCR 原理三步骤而设臵变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在90?95 C 变性，再迅速冷却至 40?60 C,引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70?75 C,在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100?300bp 时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94 C 变性，65 C 左右退火与延伸（此温度Taq DNA 酶仍有较高的催化活性）。 ① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下，93 C ?94 C lmi 足以使模板DNA 变性，若低于93 C 则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或致PCR 失败。 ② 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速简单题 PCR 产物完全变性，就会导

植物分子生物学实验技术

植物分子生物学实验技术班级：研122班专业：作物生物技术姓名：陕建国学号：20122419 授课教师：红英老师

实验一：植物DNA和RNA提取方法的讨论一、提取植物DNA和RNA的用处提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。（一）提取植物DNA的用处 DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA 的提取效率直接决定着后续实验的成败。另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。（二）提取植物RNA的用处提取RNA 可以进行 Northern 杂交、原位杂交、RT-PCR 以及 cDNA 文库构建等很多分子生物学实验。提取RNA也是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础。二、植物组织DNA的提取方法提取植物DNA的试验原理：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl 溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。（一）植物DNA的SDS提取法：（来自You are so late的新浪空间）试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L 的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。 4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。 5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6 氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7、 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol／L HCl。 10、0.2mol/L NaOH。 11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。

植物基因工程操作论文.

瓜叶菊Mlo基因片段的克隆摘要瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）是菊科（Compositea）多年生草本植物，是元旦、春节重要的观赏盆栽早春花卉，具有广阔的开发前景和现实意义。近年来，白粉病（Powdery Mildew）逐渐成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。瓜叶菊白粉病的传统生物防治方法不仅使病原产生抗药性，还会造成成本增加和环境污染等问题。因此，利用基因工程手段培育具有广谱抗白粉病的瓜叶菊种质资源具有非常重要的意义。 Mlo基因是一种新型的抗病基因，可能参与瓜叶菊白粉病的调控过程。它与显性R基因控制的抗病基因不同，它是由单基因控制的隐性抗病基因，具有非小种专化的持久抗性，其功能类似于G蛋白偶联受体。Mlo基因可能对细胞坏死具有负调控作用，即抑制细胞坏死，类似于其它突变体基因以寄主死亡来抵抗病原菌的入侵，Mlo基因突变为mlo基因后，对细胞死亡的负调控作用被解除，被侵染细胞可能更易死亡，由此引发广谱的抗病性。任何感病的野生型都可以通过对Mlo基因进行诱变而获得抗性。这种抗性，即便是在粗放的栽培管理条件下，也可以在田间得到持久保存，即便没有病原菌的侵染，突变的mlo植物也表现出自身细胞壁加固（cell wall appositions，CW As）和叶细胞的自发死亡现象。因此，对该基因的克隆以及结构和功能的研究，为瓜叶菊的抗病育种奠定了基础并提供了新思路。本研究以瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）为试材，通过PCR方法克隆了Mlo基因片段的cDNA序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo 基因的功能和表达情况提供了理论依据。关键词: 瓜叶菊；Mlo基因片段；PCR扩增；

五种常用的植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植

物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-

常用的植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti 质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA 是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA 转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期

植物基因工程

一从现代农业到基因工程 (一)粮食安全现状 1、食物总量供给已成为全球的焦点之一：从2000年开始，全球出现了当年粮食生产量比消费量低的情况，2003年全世界粮食的消费量超过生产量0.93亿吨，世界粮食储备也降低到30年来的最低水平。 1999年以来，我国粮食连续四年减产。1999-2002年，我国粮食总产量累计减少800亿公斤左右。自2000年以来，我国粮食年消费需求大致在4.8-4.9亿吨之间，产需缺口约400亿公斤。 (二)农业发展的一个主要矛盾——科技支撑能力不强农业生产的规模化、专业化和多样化对科技提出了更高的要求，大幅度提高农业劳动生产率需要通过先进适用技术的广泛应用，而目前我国科技进步贡献率只有45%左右，与发达国家的70-80%有很大的差距。一个农业劳动力养活的人口数：美国：70人；日本：约25人；中国：4-5人。农业发展的根本出路是现代农业，而其核心支撑条件是现代农业科技的进步。 (三)现代农业的内涵现代农业是以现代工业和科学技术为基础，重视加强农业基础设施建设，充分汲取中国传统农业的精华，根据国内外市场需要和WTO规则，建立起采用现代科学技术、运用现代工业装备、推行现代管理理念和方法的农业综合体系(引自卢良恕院士)。 (四)建设农业科技创新体系是现代农业的一个根本任务国家级农业科研工作应具有较强的关键性、全局性、基础性、战略性和前瞻性的特点，为加快现代农业建设提供科技支撑。省级有关农业的科研机构应逐步实行联合，重点开展应用研究和开发研究(也可根据需要适当开展应用基础研究)，重视科技成果转化，更好地为发展生产服务(引自卢良恕院士)。到2030年，我国人口的持续增长将要达到高峰期，预计达到16亿人口，解决这个庞大人口的口粮是一个新的挑战。随着人民生活水平的提高，肉蛋奶和水产品的消费不断增加，粮食作为饲料的比重将越来越大，人均粮食占有量的标准应有所提高。 2、食品安全性也成为全球的焦点之一：农业综合措施、现代农业技术尤其是转基因技术的应用，使老百姓对当前食品尤其是转基因食品安全性问题十分关心。 (五)农业科技创新的一个核心内容：良种创新农业科技创新的核心：良种+良法。良种对增产的作用所占的比重越来越大，良种是一个先进技术的集合体。良种创新：植物良种创新、动物良种创新。植物食品占总食品的93%，动物食品占7%，但也间接来自植物食品，所以良种创新的首要任务是植物良种创新。 (六)传统育种面临的挑战以杂交育种为核心的传统育种技术取得了丰硕的成果，目前仍然是主要作物的主要育种手段。目前传统育种技术在改良作物性状方面遇到了一些挑战，如缺乏特别性状的种质资源，育种周期长，难以克服不良性状的连锁或负相关，易受杂交不亲和及杂种不育的限制，远缘物种间不能进行遗物物质交流和性状转移。 (七)基因工程带来的机遇与竞争 20世纪50年代以来，DNA双螺旋模型和基因操纵子学说的提出，以及DNA限制性内切酶的发现，导致了DNA体外重组技术?a?a基因工程技术的发展，推动了分子生物学和基因工程本身在广度和深度方面以空前的速度蓬勃发展，生物技术相关产业和生命科学已经出现划时代的

高等植物基因工程

高等植物基因工程 HEWenxingUNIVERSITYOFJinan第二节植物基因工程方法一、植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：（一）生物介导的转化方法主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高广泛应用于双子叶植物的遗传转化。（二）直接基因转移技术包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等其中基因枪转化法是代表。第二节植物基因工程方法一植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：（一）生物介导的转化方法主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高广泛应用于双子叶植物的遗传转化。（二）直接基因转移技术包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等其中基因枪转化法是代表。 HEWenxingUNIVERSITYOFJinan、农杆菌的Ti质粒与TDNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（Atumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。（一）生物介导的转化（一）生物介导的转化农杆菌的Ti质粒与

TDNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（Atumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮这些酚类物质可以诱导Vir （Virulenceregion)基因的启动表达Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T －DNA结合形成复合物转化植物根部细胞。 HEWenxingUNIVERSITYOFJinanTi质粒（Tumorinducedplasmid）Ti质粒（Tumorinducedplasmid）环状dsDNA,kb具六个功能区致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解Ti质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移毒性区（Vir）（Virulenceregion)：直接参与TDNA的转移和插入植物染色体DNA复制区（Re织、细胞、细胞器内完成整合并表达的基因转化的方法。最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。年美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS系统。基因枪的组成部分由点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。基因枪法基因枪法（particlegun）又称微弹轰击法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。

基因工程的基本操作步骤

水寨中学生物自主探究学案内容：基因工程的基本操作程序课时：2课时年级：高二编号64 一、教学目标 1．知识目标：了解基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标：尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标：（1）了解基因工程的发展。（2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。二、教学重点和难点 1、教学重点基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点（1）从基因文库中获取目的基因（2）利用PCR技术扩增目的基因第一课时三、教学过程（一）复习上节内容 1、什么是基因工程？DNA重组技术的基本工具有哪些？运载体需要具备哪些条件？以上问题可以不展示（二）讲授新课 1、基因工程的基本步骤包括那四步？ 2、第一步：目的基因的获取（１）为什么要有目的基因的获取这一步骤？（２）目的基因的获取方法有哪些？（3）为什么要建立基因文库？怎么建立的？

（4）如何从基因文库中获取目的基因？（5）为什么要建立cDNA文库？如何获取cDNA？（5）PCR技术的原理是什么？利用PCR技术扩增目的基因的前提是什么？（6）如何获取引物？（7）请你用文字和箭头描述PCR技术扩增的过程？ 3、第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤）（1）在基因工程的操作过程中，为什么要构建基因表达载体？单独的DNA片段能不能稳定遗传？（2）参考课本P11页图1—10基因表达载体模式图，在学案上绘出基因表达载体的模式图，并标出其组成部分。并了解什么是启动子、终止子？他们位于哪里？有什么作用？标记基因的作用是什么？

思考:1、作为基因工程的表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么 2、完成教材P11页的“寻根问底” 第二课时 4、第三步：将目的基因导入受体细胞（1）为什么要把目的基因导入受体细胞而不是在外界培养让其维持稳定和表达？（2）什么是转化？（3）将目的基因导入植物细胞的方法有哪些？最常用的方法是哪种？（结合示意图，了解农杆菌转化法的基本过程）（4）将目的基因导入动物细胞的基本操作程序是怎样的？要用到什么技术？（5）早期的基因工程为什么选择原核生物作为受体细胞？大肠杆菌细胞最常用的转化方法是？

植物转基因原理与技术

植物转基因原理与技术植物转基因原理与技术转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程。微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。原理根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同，可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系。植物转基因流程图如下所示。外植体）愈伤组织瞬时表达外源基因植物受体细胞原生质体生殖细胞稳定表达获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定（PCR, Southern blot ,Northern blot,生理指标鉴定等）技术就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术，直接转化技术和种质转化技术。下面分别叙述。一载体转化技术载体转化技术是指通过农杆菌的Ti 或Ri质粒，植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌。它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti（tumour-induced）质粒。它利用Ti质粒控制植物细胞来生产自己独特的“食品”- 冠瘿碱，从而将植物细胞转变成特定营养的安全避难所和工厂。Ti质粒长200-250kb，上面分布着四个区：T-DNA(transferred DNA) ,Vir(virulence gene) ,控制结合转移的区域和与冠瘿碱利用有关的基因区。毒力基因即Vir基因控制着转移DNA 即T-DNA向植物细胞转移，T-DNA是唯一整合进植物基因组的区域，它编码植物激素和冠瘿碱合成酶。T-DNA转化植物的过程如下：植物受伤后释放酚类化合物信号分子被位于细胞膜的VirA蛋白感受，VirA蛋白是受配基刺激自身磷酸化的受体，并将磷酸基团转移给Vir区基因调控蛋白因子VirG。VirG 调控着下游基因的表达来完成T-DNA的切割，包装和转移。天然的Ti质粒因为太大，酶切位点多又诱导产生肿瘤，所以不适合作为载体。经过改造后可以作为基因工程载体，主要是通过破坏或缺失癌基因成为安全载体，太大不适合操作可以通过同源重互换或功能互补来解决。T-DNA整合进植物基因组与其边界序列相关，而与内部序列无关，因此可以将内部控制植物激

转基因植物的检测与鉴定

收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #