黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定
黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定
王字玲 邓健蓓 韩 骅 陈梅红 苏成芝
(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室 西安710033)
摘 要 目的:克隆黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因.方法:从培养的可分泌人黑色素瘤特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞HB8760提取总RNA,反转录成c DNA,用合成的一对寡核苷酸引物从中扩增了抗体可变区基因,并克隆入pU C19,挑选出阳性克隆后进行了核苷酸序列分析.结果:所克隆基因分别长360bp和330bp,编码120个和110个氨基酸,含三个CDR区和四个FR区,并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸.计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性.结论:所克隆基因可编码小鼠抗体可变区.
关键词 黑色素瘤 单克隆抗体 基因 克隆 核苷酸序列
中图号 Q78
Am p lificati on,clon ing and sequencing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a sp ecific m onoclonal an tibody
W ang Z iling,D eng J ianbei,H an H ua,Chen M eihong,S u Cheng z h i
D ep artm en t of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logy,Fou rth M ilitary M edical U n iversity, X i’an710033
Abstract Objective:C lon ing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a specific monoclonal an ti-body.M ethods:To tal RNA w as iso lated from a cu ltu red hyb ridom a cell line HB8760w h ich secretes hum an m elanom a specific monoclonal an tibody,and fo llow ed by reverse tran scri p ti on in to c DNA.T hen PCR w as u sed to amp lify the i m m unoglobu lin variab le regi on genes of the an tibody.T he PCR p roduct w as cloned in to pU C19p las m id and sequenced.Results:T he cloned genes con sist of360bp and330bp respectively and en2 code120and110am ino acids.T here are th ree CDR s,fou r FR s and the charicteristic cystein residues w ith in the genes.T he genes are homo logues to the mou se Ig genes pub lished in E M BL gene bank1995.Conclu2 sion s:T he data indicate that the cloned genes encode the variab le regi on of the mou se an tibody.
Keywords m elanom a an tibody gene nucleo tide sequence
单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑.单克隆抗体在生物学基础研究和疾病的诊断、治疗和预防等方面显示出重要的作用和应用前景. L evy等[1]建立了一株人黑色素瘤特异性单克隆抗体XMMM E2001(商品名HB8760).该抗体可特异结合携有黑色素瘤相关抗原的肿瘤细胞,而不与对照的成淋巴细胞系或缺乏黑色素瘤相关抗原的瘤细胞结合[1],这对黑色素瘤的诊断及治疗有重要意义.但由于该抗体为鼠源性,在临床应用中存在诸多问题,而基因工程抗体则有免疫原性低,不被细胞受体结合,在体内成象定位检查时本底低,图象清晰,能进入实体瘤周围微循环,在治疗实体
王字玲,女,29岁,博士生瘤时比完整抗体分子效能高等优点[2],我们从HB8760中克隆了这一抗体的轻、重链可变区基因,并测定了其核苷酸序列,为其进一步应用打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 小鼠杂交瘤细胞系HB8760为本校免疫学教研室保存并培养,该细胞可分泌抗人黑色素瘤特异性小鼠IgG2a.
1.1.2 克隆载体及菌种 为本室保存.所用试剂除特殊提到外均为德国Boeh ringer M annhei m公司和华美公司产品.
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取 按文献[5]进行.将从107细胞所提取的胞浆总RNA溶解于50Λl水中,紫外定量.
1.2.2 反转录 取10Λg胞浆总RNA在20Λl 体积中用美国P rom ega公司反转录试剂盒进行.反应液于-20℃保存.
1.2.3 PCR 反应及其产物克隆根据已发表的抗体可变区序列的保守性,合成了针对重链和轻链可变区的通用引物[9],PCR引物如下:
V h21(正向)GT GAA T TCA T GCA GGT GCA2 GCT GT T GGA GTCT GG,V h22(反向)A T G2 TCGA CT GA GGA GA CGGT GA CCA GGGT GCC, VL21(正向)GT GAA T TCA T GGA CA T T G2 T GA T GA CCCA GTCTCC,VL22(反向)CA2 GTCGA CT TA CGT T T GA TCTCCA GCT T GGT2 CCC.
在M J R ESEA RCH公司的PCR反应仪上进行.取10Λl PCR产物经EcoR I和SalI消化,低熔点琼脂糖凝胶回收扩增的片段,克隆入pU C19中,酶切选出含插段的克隆.
1.2.4 核苷酸序列分析 双脱氧链终止法,用美国Pharm acia公司的T7Sequencing k it进行.
2 结果
2.1 HB8760可变区基因的扩增 用通用引物扩增HB8760的c DNA分别得到一条约360bp和330bp的片段(F ig1).
图1 HB8760可变区基因的扩增
F ig1 Amp lificati on of variab le regi on genes of HB8760 V H:H eavy chain variable regi on gene;VL:L igh t chain variable regi on gene;M:M o lecular w eigh t m arker.
2.2 扩增片段的克隆 PCR产物经酶切后克隆入pU C19中,并转化JM109,得到约100个白色克隆,随机挑选8个,经酶切鉴定均含插段.
2.3 核苷酸序列测定 挑选一个含插段的阳性克隆大量提取质粒,经FPL C纯化后测序,核苷酸序列结果见F ig2.其特点为:①序列两端含PCR引物及正确的酶切位点.重、轻链分别为360bp和330bp,与PCR结果相同.②重、轻链基因分别编码120个和110个氨基酸,含三个CDR区和四个FR区,并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸.③序列经计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性.
V H:
A T G CA G GT G CA G CT G T T G GA G TCT GGG GCA GA G CT T GT G AA G CCA GGG
GCC TCA GTC AA G T T G TCC T GC A CA GCT TCT GGC T TC AA C A T T AAA GA C
A CC TA T A T G CA C T GG GT G AA G CA G A GG CCT GAA CA G GGC CT G GA G T GG
A T T GGA A GG A T T GA T CCT GCG AA T GGT AA T A CT AAA TA T GA C CCG AA G
T TC CA G GGC AA G GCC A CT A TA A CA GCA GA C A CA TCC TCC AA C A CA GCC
TA C CT G CA G CTC A GC A GC CT G A CA TCT GA G GA C A CT GCC GTC TA T TA C
T GT GCT A GA TA C TA T A GG TA C CCT TA C TA T GCT A T G GA C TA C T GG GGC
CAA GGC A CC A CG GTC A CC GTC TCC TCA GTC GA C
VL:
A T G GA C A T T GT G A T G A CC CA G TCT CCA GCC A TC CT G TCT GT G A CT CCA
GGA GAA A CG GTC A GT CT T TCC T GT A GG GCC A GC CA G A CT A T T TA C AA G
AA C CTA CA C T GG TA T CAA CA G AAA TCA CA T CGG TCT CCA A GG CT T CTC
A TC AA G TA T GGT TCT GA T TCC A TC TCT GGG A TC CCC TCC A GG T TC A CT
GGC A GT GGA TCA GGG A CA GA T TA C A CT CTC AA T A TC AA C A GT T T G AA G
CCC GAA GA T GAA GGA A TA TA T TA C T GT CT T CAA GGT TA C A GT A CA CCT
T GG A CG T TC GGT GGA GGG A CC AA G CT G GA G A TC AAA CGT TA G
图2 HB8760轻、重链可变区基因的核苷酸序列
F ig2 N ucleo tide sequence of V H and VL gene of HB8760
3 讨论
单克隆抗体技术自问世以来,无论对生物医学基础研究还是医学临床实践都是一种极为重要的手段,尤其在肿瘤的诊断,治疗,预防等方面有广阔的应用前景.然而一般制备的单克隆抗体均为鼠源性,应用于临床会引起副作用,大大降低其诊断治疗价值.而人源性抗体的制备目前还有很大困难,因此人们除了对原有技术进行改造,还努力从基因水平上对鼠抗体进行人源化改造,减少鼠抗体蛋白的免疫原性,克服鼠单抗在人体应用的局限性.迄今为止已构建了多种基因工程抗体,如嵌合抗体[6],重构型或人源化抗体[7,10],小片段抗体[8]等.单区抗体为最小的抗体单位,虽然只具有完整抗体十分之一的抗原结合活性,但它制备方法简便,在血清中清除快,成像时背景低,而且还可作为构建有治疗意义的人mA b或Fv片段的元件.所以我们采用PCR技术从杂交瘤中克隆其可变区基因,为其进一步应用奠定基础.
黑色素瘤是一种常见于皮肤的恶性肿瘤,也可见于视网膜或转移至其它深部组织,而且近年来我国黑色素瘤发病呈上升趋势.我们应用一对通用引物成功地从培养的杂交瘤细胞中克隆了抗体可变区基因.序列分析表明与已发表的小鼠抗体可变区基因序列有较高的同源性[2～4],可编码正确的小鼠抗体可变区.该单链抗体基因的表达及基因工程改造正在进行中.
致 谢 金伯泉教授,张新海硕士提供及培养杂交瘤细胞.赵中良博士,高辉实验师在论文写作中给予帮助.
参考文献
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(收稿1996-05-03 修回1996-08-29)
编辑 黄良田
文 摘
抗凋零基因B cl22产物在口腔粘膜相关性淋巴瘤中的表达及意义
[高玉好,杨连甲,黄高升et a l.中华口腔医学杂志,1996;31(5):278～280]
抗凋零基因Bcl22可抑制细胞凋零,促进细胞增殖,与部分肿瘤的发生相关.作者利用免疫组织化学技术观察了26例口腔粘膜相关性淋巴瘤中Bcl22基因产物的表达,以探讨Bcl22表达与该肿瘤组织类型、免疫表型等之间的关系.结果表明,26例口腔粘膜相关性淋巴瘤中,73%的病例Bcl22产物阳性.在三种主要组织类型中,小裂细胞样淋巴瘤阳性率最高(83%),其次为浆细胞样淋巴瘤(71%)和浆细胞性淋巴瘤(51%),相互间差异有显著性(P<0.01).在可进行免疫分型的20例中,B 细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤及不可分类淋巴瘤的Bcl22产物阳性率依次分别为69%,75%和83%(P<0.01).结果提示,细胞自然凋零过程的抑制可能是部分口腔粘膜相关性淋巴瘤的发生原因之一.(王小仲)
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
单克隆抗体原理.docx
单克隆抗体原理 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性 单克隆抗体制备过程 杂交瘤细胞的制备 1)．提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。 2)．应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性 3)．对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，并进行克隆化培养，得到稳定的杂交瘤细胞，再进行大规模培养获得单克隆抗体。 单克隆抗体的提纯 工业发酵主要类别,乙醇发酵、食品发酵、微生物发酵 发酵工程的一般过程可分为三个步骤：第一，准备阶段；第二，发酵阶 段；第三，产品的分离提取阶段。 为什么说基因工程发酵工程和酶工程之间存在着交叉渗透现象？ 1. 比如想获得某种可以治疗疾病的蛋白酶——这种酶的制备、纯化等过程就属于酶工程。 2. 这种蛋白酶是某生物的某基因的产物，把这个基因克隆构建到载体上——这就属于基因工程。 3. 把基因整合到细胞里面表达，得到这种酶——这就属于细胞工程。 4. 把细胞放到发酵罐中大规模生产——这就属于发酵工程。 利用固定化生物催化剂的优点有很多： ①酶成份可以重复利用； ②适合于连续操作； ③产品中不会掺杂入酶； ④可以更加精确地控制催化过程； ⑤酶的稳定性得到改善或提高； ⑥可发展成多酶反应系统；
人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆
人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆 吕勇刚1,窦科峰1,吴昱彤2,赵爱志1,刘 杰4,陈 刚5,陶开山1,药立波3 (1.第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安 710033;2.唐都医院信息科,陕西西安 710038; 3.基础部生物化学教研室; 4.基础部药理学教研室,陕西西安 710032; 5.西安交通大学第一医院血液科,陕西西安 710061) 摘要:目的 扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因,将其克隆到T 载体来构建T 载体文库。方法 收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例,TRIzol 法提取总RNA 、纯化mRNA ,行RT 2PCR 扩增,制备T 载体,用于PCR 产物的克隆。结果 总RNA 纯度高,完整性好,mRNA 获得率为1%。经RT 2PCR ,V H 、V λ、V κ的每一条5’端引物均与其相应的3’端引物成功地扩增出了可变区基因片段,轻、重链T 载体库分别为1.7×108和3.5×108。结论 所采用的引物能够 100%扩增目的片段,T 载体过渡能显著提高克隆效率,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。 关键词:聚合酶链式反应;乳腺癌;抗体基因;T 载体 中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:167128259(2004)0620558204 Amplif ication of all human V genes of breast carcinoma from peripheral lymphadens L üY onggang ,Dou Kefeng ,Wu Yutong ,Zhao Aizhi ,Liu Jie ,Chen G ang ,Tao Kaishan ,Yao Libo (Department of Hepatobiliary Surgery ,Xijing Hospital ,Fourth Military Medical University ,Xi πan 710033,China ) ABSTRACT :Objective To amplif y all human V genes of breast carcinoma by R T 2PC R.The p roducts of PC R were cloned int o T 2vect or t o const ruct clone library.Methods Perip heral lymp hadens of 30p atients wit h breast carcinoma were collected ,f rom w hich t otal RNA was ext racted by TRIzol Reagent ,and m RNA was p urified wit h Oligotex m RNA kit.Then cDNA was derived t hrough reverse t ranscrip tion.PC R p roducts were amplified and cloned int o T 2vect or t o const ruct clone libraries. Re sults Total RNA was ext racted p urely and intactly ,so was m RNA w hich accounts f or 1%of t he f or mer.By R T 2PC R ,every p air of p rimers amplified t he V gene efficiently.Rep ert oires of V H and VL were 3.5×108 and 1.7×108 resp ectively.Conclusion The set of p rimers adop ted are able t o recognize 100%of f unctional V genes wit h high efficiency.T 2vect or will f acilitate t he digestion ,w hich lays a f oundation f or const ruction and selection of p hage library. KE Y WOR DS :p olymerase chain reaction ;breast carcinoma ;antibody gene ;T 2vect or 收稿日期:2004204214 修回日期:2004205211基金项目:国家自然科学基金资助(No.30371399)通讯作者:药立波,T el :83374547211;E 2mail :bioyao @https://www.360docs.net/doc/6f469944.html, 作者简介:吕勇刚(19742),男(汉族),医师,在读博士. 噬菌体抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展,能够绕开免疫途径,直接制备全人源化的抗体片段。它将选择能力和扩增能力偶联起来,较好地模拟了体内B 细胞产生特异性抗体的过程。传统的单克隆杂交瘤技术与之相比,已经显得“迟缓和笨拙”,有被逐渐取代的趋势1。PCR 技术的发展,使得人们可以用一组引物扩增全套抗体的可变区基因,是抗体库技术出现的先决条件之一2。我们采用一组高效引物,以乳腺癌患者的外周淋巴结为原料,扩增抗体的全套可变区基因,并将其首先克隆入T 载 体,构建各自的T 载体文库,有助于提高PCR 产物的酶切和高效克隆,为抗体库的构建打下基础,并在方法学上进行了探讨。1 材料与方法 1.1 酶和化学试剂 TRIzol 提取液购自Invitrogen 公司;DEPC 为Sigma 产品;r Taq DNA 聚合酶、dN TP 购自大连宝生物制品公司;mRNA 纯化试剂盒 为Q IA GEN 产品;反转录试剂盒为Promega 产品;DNA 凝胶纯化试剂盒、大提质粒试剂盒购自上海华 舜生物工程有限公司。 1.2 组织总RNA 的提取 术中剥离乳腺癌患者外 周淋巴结30例(标本均经病理证实),迅速冻于液氮, 第25卷第6期2004年12月西安交通大学学报(医学版) J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Sciences )V ol.25N o.6Dec.2004
动物细胞融合和单克隆抗体
单克隆抗体导学案2.2.2 班级姓名 问题生成阶段 【温故知新】 免免 结分泌的，能和抗原 1．抗体的化学本质是，是由合。诱导融合细胞2.动物细胞融合：不同DNA的两种细胞 筛选杂交细胞 3.动物细胞培养：分散的单个细胞制成原代培养 培养 【新知预学】 1．传统抗体的获得 (1)方法：①向动物体内反复注射某种，使动物产生；②从
动物 中分离所需抗体。 (2)特点：、纯度低、。 2．单克隆抗体的制备原理 细胞特点 能产生，但不能B淋巴细胞 能，但不能骨髓瘤细胞 既能融合细胞，又能 单克隆抗体的制备过程3. (1)制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的，然后从小鼠 获得相应的B淋巴细胞。 1 (2)细胞融合：融合的方法常用聚乙二醇、、电激等，这时得到的融合细胞除了杂交瘤细胞，还有相互融合的细胞和相互融合的细 胞。 (3)筛选：用特定的培养基筛选出杂交瘤细胞。这时候的杂交瘤细胞既能 同时又能。 (4)克隆化培养和抗体检测：从杂交瘤细胞群中选出能产生的特异性杂交瘤细胞。 相关资料：先在多孔培养皿上培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是由单个杂交瘤
细胞克隆来的，所以产生的抗体一定是化学性质单一、特异性强的单克隆抗体。 (5)培养杂交瘤细胞获得单克隆抗体：将杂交瘤细胞在条件下做大规模培养或注射到小鼠内增殖，从 ______或小鼠的 ______ 中提取单克隆抗体。 4．由上述抗体的产生过程我们可将单克隆抗体的定义归纳为：由 大量繁殖所产生的、的抗体。 5．单克隆抗体的应用 (1)优点：、、并可能大量制备。 (2)应用 ①作为诊断试剂，具有准确、、简易、的优点。 ②用于和。 问题解决阶段 【合作探究】单克隆抗体的制备 B淋巴细胞？如何得到已免疫的1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？2.如何诱导效应 融合过程中会出现几种类型的细胞？3. 怎样淘汰我们不需要的细胞？上述过程得到的细胞哪种是我们需要的？其特 点是什么？4. 淘汰后的细胞所产抗体是单一的吗？如何检测？5. 如何获得大量“单克隆抗体”？6. 2 注意：制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法及目的
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，
黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定
黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定 王字玲 邓健蓓 韩 骅 陈梅红 苏成芝 (第四军医大学生物化学与分子生物学教研室 西安710033) 摘 要 目的:克隆黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因.方法:从培养的可分泌人黑色素瘤特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞HB8760提取总RNA,反转录成c DNA,用合成的一对寡核苷酸引物从中扩增了抗体可变区基因,并克隆入pU C19,挑选出阳性克隆后进行了核苷酸序列分析.结果:所克隆基因分别长360bp和330bp,编码120个和110个氨基酸,含三个CDR区和四个FR区,并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸.计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性.结论:所克隆基因可编码小鼠抗体可变区. 关键词 黑色素瘤 单克隆抗体 基因 克隆 核苷酸序列 中图号 Q78 Am p lificati on,clon ing and sequencing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a sp ecific m onoclonal an tibody W ang Z iling,D eng J ianbei,H an H ua,Chen M eihong,S u Cheng z h i D ep artm en t of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logy,Fou rth M ilitary M edical U n iversity, X i’an710033 Abstract Objective:C lon ing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a specific monoclonal an ti-body.M ethods:To tal RNA w as iso lated from a cu ltu red hyb ridom a cell line HB8760w h ich secretes hum an m elanom a specific monoclonal an tibody,and fo llow ed by reverse tran scri p ti on in to c DNA.T hen PCR w as u sed to amp lify the i m m unoglobu lin variab le regi on genes of the an tibody.T he PCR p roduct w as cloned in to pU C19p las m id and sequenced.Results:T he cloned genes con sist of360bp and330bp respectively and en2 code120and110am ino acids.T here are th ree CDR s,fou r FR s and the charicteristic cystein residues w ith in the genes.T he genes are homo logues to the mou se Ig genes pub lished in E M BL gene bank1995.Conclu2 sion s:T he data indicate that the cloned genes encode the variab le regi on of the mou se an tibody. Keywords m elanom a an tibody gene nucleo tide sequence 单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑.单克隆抗体在生物学基础研究和疾病的诊断、治疗和预防等方面显示出重要的作用和应用前景. L evy等[1]建立了一株人黑色素瘤特异性单克隆抗体XMMM E2001(商品名HB8760).该抗体可特异结合携有黑色素瘤相关抗原的肿瘤细胞,而不与对照的成淋巴细胞系或缺乏黑色素瘤相关抗原的瘤细胞结合[1],这对黑色素瘤的诊断及治疗有重要意义.但由于该抗体为鼠源性,在临床应用中存在诸多问题,而基因工程抗体则有免疫原性低,不被细胞受体结合,在体内成象定位检查时本底低,图象清晰,能进入实体瘤周围微循环,在治疗实体 王字玲,女,29岁,博士生瘤时比完整抗体分子效能高等优点[2],我们从HB8760中克隆了这一抗体的轻、重链可变区基因,并测定了其核苷酸序列,为其进一步应用打下基础. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞系 小鼠杂交瘤细胞系HB8760为本校免疫学教研室保存并培养,该细胞可分泌抗人黑色素瘤特异性小鼠IgG2a. 1.1.2 克隆载体及菌种 为本室保存.所用试剂除特殊提到外均为德国Boeh ringer M annhei m公司和华美公司产品. 1.2 方法
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。 载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是 pBR322。 基因库的建造 含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。 cDNA库的建造 是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。 特异基因的筛选 常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。 核酸序列测定 DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
高中生物选修三教案 动物细胞融合与单克隆抗体
2020年4月16日磨课教案 第二单元动物细胞工程 2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体 一、学习目标 1．知识目标： ⑴掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。 ⑵简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。 ⑶了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说其应用实例。 2．能力目标： 让学生尝试设计单克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。 3．情感、态度和价值观目标： 通过向学生介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。 二、教学重点难点单克隆抗体的制备过程。 三、流程 1、小结植物细胞工程涉及的技术，让学生回顾有关植物体细胞杂交技术的基本知识 2、探究一：动物细胞的融合 教师提出思考问题，布置学生进行讨论探究，四人一组，探讨交流。 多媒体展示探究思考题。 1）、植物体细胞杂交和动物细胞融合的区别 2）、植物体细胞杂交和动物细胞融合的主要区别是什么？ 3）、为什么可以使用灭活的病毒促进动物细胞融合？ 4）、不灭活的病毒能作为诱导剂吗？ 3、探究二：单克隆抗体制备的原理 多媒体展示探究问题。 1）、传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？
2）、B淋巴细胞有什么特点？ 3）、若要想获得大量的单一抗体，如何做呢？ 4）、在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，那么，怎样解决这一问题的呢？ 5)、小结以下内容： ◆利用____________________产生特异性抗体的功能。 ◆利用____________________无限增殖的特性 ◆利用____________________技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。 ◆利用____________________技术大量培养杂交瘤细胞 4、探究三：单克隆抗体制备的过程 教师通过多媒体展示单克隆抗体的制备过程，同时提出问题，教师展示讨论问题，学生分组讨论。 1）、如何获得B淋巴细胞？ 2）、如果把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式（类型）？ 3）、选择杂交瘤细胞的两步筛选的目的各是什么？ 4）、如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？（教师讲解为主） 5、探究四：单克隆抗体的应用 教师引导学生阅读课本进行回答，多媒体展示问题 1）、单克隆抗体的应用有哪些？ 2）、生物导弹的组成及优点 四、二次备课
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理 标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法 单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限
动物细胞融合与单克隆抗体(讲课教案)
动物细胞融合与单克隆抗体(讲课教案) 黄冈中学 屈泽兵 一、教学重点 1．细胞融合的概念及原理 2．单克隆抗体的制备过程及原理 3．单克隆抗体在实际生活中的应用 二、教学难点及突破 1．杂交瘤细胞的筛选。课文中的相关介绍语言简洁，但是此处也是学生理解单抗制备的最大难点，教师可以将该过程分解，设置一些小问题，带领学生仔细阅读，从课本寻求答案，最终准确理解该知识点。 2．“生物导弹”中单克隆抗体的作用。抗体本身具有清除抗原的作用，学生在这里容易形成误解，认为“生物导弹”中治病的是抗体，此处教师也应该设置问题，引导学生仔细读书，准确理解课本语言，避免形成错误的认识。并可以组织一场短时间的讨论，讨论在什么样的情况下，应该采取这种治疗手段。 三、教学过程 导入：在植物细胞工程的内容中，我们学习了植物体细胞杂交，从而克服了植物种间杂交生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，我们能不能用类似的方法，对动物体细胞进行融合，从而获得新的动物类型呢？今天，我们就来学习一下动物细胞融合技术。 1．动物细胞融合（也称细胞杂交） 概念分解：两个或多个动物细胞 → 人工诱导 → 一个细胞（即杂交细胞） 杂交细胞：融合后形成的具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。 融合原理：细胞膜具有流动性 诱导方法：物理、化学、生物方法。 2．单克隆抗体 单克隆：用一个细胞作为祖细胞，通过分裂得到很多相同的细胞，称之为单克隆。 克隆则指的是获得相同的物质，有时候DNA 的复制也可以称为克隆。在抗体的生产中，用于生产抗体的细胞起源于一个杂交细胞，所以称之为单克隆抗体。 （1）制备 带问题去看书： ① 总结单克隆抗体制备的生物学原理基础。 ② 诱导动物细胞融合之后，我们会得到哪些种类的细胞？ ③ 单抗制备过程中用到了哪些筛选手段？ ④ 单克隆抗体在“生物导弹”中的基本作用？ 原理：一个B 细胞分泌一种抗体，瘤细胞能无限增殖 过程： 分解筛选步骤，设置小问题引导学生思考： ① 第一次筛选我们获得的是什么细胞？ ② 第二次筛选是怎样实施的？获得的是什么细胞？ B 淋巴细胞 小白鼠 注射抗原 骨髓瘤细胞杂交细胞 能产生特定抗体的细胞 筛选 杂交瘤细胞 抗体鉴定 筛选 培养
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都
基因克隆技术的研究进展_钟军
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.360docs.net/doc/6f469944.html,
选修三专题二2.2.2《动物细胞融合与单克隆抗体》导学案
学校：临清二中 学科：生物 编写人：黄丽平 审稿人：于振玲 专题二细胞工程一一.动物细胞工程 2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体 课前预习学案 一、预习目标 预习动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程， 应用实例。 “二、预习内容 ㈠、动物细胞融合 1概念： _________ 或 ________ 动物细胞结合形一个细胞的过程，也称细胞杂交。 2、 结果：形成 。 灭活的病毒或 PEG 3、 过程：两个或多个细胞 ________________________________________ 4、 意义：克服了 ___________ 的不亲和性，成为研究 _________________ 、 ____________ 、肿瘤和 _________________ 培育的重要手段。 ㈡、单克隆抗体 1抗体 ⑴产生细胞： ____________________ 。 ⑵成分： ____________ 。 ⑶特点：从 ___________ 中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。 2、单克隆抗体的制备 (1)过程 一 给小鼠注射特 从 ________ 中分、 r 未融合细胞 定的抗原蛋白 f 离B 淋巴细胞 灭活病毒融合 -------------- 培养骨髓瘤细胞 I V ___________ f 骨髓瘤细胞 \ 体外培养 ⑵杂交瘤细胞的特点： _________________________ 、 _______________________ 。 ⑶单克隆抗体的优点： _______________ 、 _______________ 、 _____________ 。 ㈢、单克隆抗体的应用 1、 作为诊断试剂，具有 _____________ 、 ___________ 、 ___________ 、 ____________ 的优点。 2、 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗 _____________ 、可制成 _____________ 。 三、提出疑惑 同学们，通过你的自主学习，你还有哪些疑惑，请把它填在下面的表格中 了解单克隆抗体在医学实践中的应用， 并说其 选择培养基 小鼠体内培 ＜养 抗体
基因克隆技术攻略：让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾
基因克隆技术攻略：让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾 一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来，让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益，因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题，经过较长时间的总结和实践，我的题组现在的基因克隆都是一次到位的，基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒，不过我对科研非常热爱，我喜欢买实验用的各种酶啊，好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱，所以我看起来穿的及其普通，可是我的实验花费有点奢华，呵呵，可能像我这样的人不多吧，哈哈，反正无所谓开心就好。下面言归正传 （1）是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶，这极大的丰富了我们的选择，所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同，最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧，其实不然，Takara几乎每年9月都有一次促销活动，在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶，这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用，而且长期五折，我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的，我一般不批量买了，在NEB买的一般都是不常用的酶，比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。 （2）PCR引物的设计这一点我不想多说，虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等，大家设计的时候要参考各种原则，我认为不然，因为做过实验的战友都清楚，有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的，比如我要扩增一个完整的基因的ORF框，那么它的起始密码子，终止密码子部分都要克隆出来的，不能多也不能少一个碱基，即使起始部位或者终止部位的AT含量很高，高到你难以忍受，那怎么办呢，基本我们没有选择，如果实在是没办法的条件下，只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位，我不知道说清楚没有，如果引物序列OK，可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的，那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。（3）PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同，我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题，我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增，所以其实我的条件并不是最佳的，但当时把基因扩出来了我也没有在意，直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签，这样的PCR引物长度差异很大，一支引物100多bp，一支引物只有30bp，于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功，各种温度都试过了也不成。于是我静下心来，把PCR的实验条件进行了全方位优化，在PCR 反应体系中，把引物调整到各种浓度的，把模板调整到各种浓度的，有的加Mg2+，有的加BSA，还使用梯度PCR的条件，试了各种扩增温度的，结果让我很开心，最后我的基因被扩增出来了，而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧！在这次试验中我找到了最佳的PCR条件，这是三年前的事了，这个条件让我在三年中屡试不爽，几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单，50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平，混匀，离心一下，进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存，吸取少量稀释十倍后用于PCR反应，这个浓度是最佳的。所以PCR 体系中引物并不是越多越好，同样的模板的量也很关键，一般我都在10ng-100ng之间，太少或太多都会抑制PCR反应。当然，不同的基因其退火温度差异较大，建议第一次做直接做梯度PCR，设置的温度范围宽些，总会有扩出来的。反正把反应体系加好，把温度控制好应该就万事大吉了，如果这样仍然扩不出来，那就直接调整DNA模版的量吧，其他的因素应该不是原因（当然得保证引物，以及酶的质量得前提下）。 （4）PCR产物的酶切，这是最简单的一步，一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要，毕竟保护性碱基只有几个。