高效毛细管电泳及其在蛋白质_多肽分析中的应用
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高效毛细管电泳及其在蛋白质、多肽分析中的应用
孔 毅, 吴如金, 吴梧桐
(中国药科大学,江苏南京210009)
摘 要:高效毛细管电泳(HPCE)是一种分离效率高、检测灵敏度高、样品用量少的分析技术。本文简述HPCE的研究进展及基本原理,着重介绍了它在蛋白质及多肽的分离、纯度鉴定、性质研究、结构分析、临床检测、药代动力学研究等方面的应用。
关键词:高效毛细管电泳;蛋白质;多肽
中图分类号:O658.9;Q51 文献标识码:A 文章编号:1001-5094(2000)04-0204-05
High Performance C apillary Electrophoresis and Its Application
in Analysis of Protein and Peptide
K ON G Yi, WU Ru jin, WU W u tong
(China Phar maceutical University,N anj ing210009,China)
Abstract:H ig h performance capillary electrophoresis(HPCE)is characterized as an analysis method, w hich show ed high selectiv ity and high sensitivity,but needed only little sample.In this article,the de velopment of HPCE and its foundamental principle were briefly introduced,and its applications to sepa ration,purity determ ination,characterization study,structural analysis,clinical monitoring and phar macokinetics of protein and peptide were emphasized.
Key words:H PCE;protein;peptide
蛋白质、多肽是生命科学中一类重要的生物大分子物质,是生物体实现其功能的物质基础。在医药领域,有许多疗效很好的蛋白质、多肽类药物,如促红细胞生成素、干扰素、白介素、重组人生长激素等都是近年开发的蛋白质类药物。在后基因组时代,蛋白质组学成为一门重要的新兴学科,其任务就是研究细胞内所有蛋白质的组成及其活动规律[1]。因此,许多研究机构和大财团都在投入人力物力对蛋白质及多肽进行研究,这些复杂的研究工作对分析手段提出了更高的要求。
高效毛细管电泳(HPCE)是近十几年发展起来的一项新的分析技术,它将电泳技术和色谱技术结合,是继高效液相色谱(H PLC)出现之后,分析科学领域的又一次革命。研究与实践表明HPCE具有以下特点:分离效率高(理论塔板数达106~107/ m);快速(20~30min内完成一次电泳操作);样品用量少(仅为纳升级,可对单细胞液进行分离分析);灵敏度高(用激光诱导荧光检测器,可达1 10 24
收稿日期:1999 10 14; 修回日期:1999 12 20
mol的超低检测限)[2]。Jorg enson和Lukacs研究发现,毛细管的柱效与分子的扩散系数呈反比,而蛋白质、多肽正具有扩散系数小的特点,这意味着毛细管电泳非常适合于蛋白质及多肽的分析研究。本文就HPCE的研究进展及其在蛋白质、多肽分析中的应用作一概述。
1 HPCE的研究进展
HPCE是在传统电泳的基础上发展起来的。1867年,H jerten采用内径3mm的石英管,内涂甲基纤维素,在旋转下分离,紫外检测,实现了自由区带电泳,这是毛细管分析实践的最初尝试。1981年,Jorgenson和Lukacs使用内径75 m的毛细管和灵敏的荧光检测器,在+30kV下电泳分离丹酰化氨基酸,标志着毛细管电泳分析方法的建立。进入90年代,以毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管色谱(MECC)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管电色谱(CEC)、非水毛细管电泳(NACE)、亲合毛细管电泳(ACE)等为代表的H PCE分离模式的发展拓宽了毛细管电泳的分离能力。运用紫外吸收、激光诱导荧光、电化学、质谱等检测手段使得H PCE 逐渐成为一种不可替代的分离分析方法,确立了其在分析科学领域的重要地位。
最早的商品化毛细管电泳仪诞生在1989年[3],之后在短短的10年中,仪器的性能不断改进,自动化程度不断提高。现在的H PCE仪大都能保证测量结果的重现性和高检测灵敏度,其主要生产厂家有Beckm an、Bio Rad、Waters、Spectra Physics等公司,它由高压电源、电极、检测器、毛细管柱系统、进样系统和数据处理系统组成。在HPCE中,离子或荷电粒子以电场(电压可达30kV)为驱动力,在毛细管(内径25~75 m,柱长14~75cm)中按淌度或/和分配系数不同而进行高效分离。目前最常用的分离模式为CZE和MECC。
CZE,当毛细管内缓冲溶液pH大于4时,柱内表面因带负电而吸引缓冲溶液中的正离子,形成带正电的双电层。给毛细管两端加电压时,缓冲溶液向负极流动,形成电渗流(EOF),溶液中带正电粒子的流动方向与EOF方向一致,首先流出。中性粒子随缓冲溶液流动,带负电粒子的运动方向与EOF方向相反,最后流出毛细管。离子迁移的速度还与离子电荷多少、离子半径大小等因素有关,稍有差异的离子,流出毛细管的顺序便出现变化,从而达到分离。但是CZE对中性粒子不具分离能力。
MECC,在缓冲溶液中加入表面活性剂,当表面活性剂的浓度超过临界胶团浓度时,形成胶束。当缓冲溶液中加入阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠时,在毛细管中形成带负电的胶束,其在电场中向正极移动。在中性或碱性条件下,EOF速度大于胶束流速,故实际上胶束的方向与EOF的方向是一致的,待测粒子依据疏水性的不同在水相和胶束相之间进行多次分配,其中疏水性强的中性粒子与胶束结合牢固,洗脱时间长,就会与水溶性中性粒子分离。在MECC中,中性粒子的分离机制是它与胶束间的疏水相互作用,而对于带电离子则有电泳迁移、静电作用、疏水相互作用等多种机制。
2 HPCE在蛋白质、多肽分析中的应用
2.1 蛋白质、多肽的分离
蛋白质、多肽尤其是结构相似的蛋白质、多肽的分离是对其进行分析研究的基础,H PCE在蛋白质、多肽分离中显示出独特的优势,目前这一领域的研究十分活跃。林炳承等[4]应用CZE在16分钟内完成了九个多肽类组分(舒缓激肽、血管紧张肽、促黑色素细胞激素、促甲状腺激素释放激素、促黄体生成激素释放激素、亮内啡肽、Bombesin、蛋白啡肽和催产素)的分离,分离条件为:涂层毛细管28cm 50 m、操作电压11kV、pH2.5的0.1mol/L磷酸缓冲液、检测波长200nm。Pessi等[5]采用CZE技术对MAP8(PGTH LPALP)2和MAP8(PGTH LP SLP)2这两种结构相似的肽进行分离,当只用磷酸缓冲液时不能分开,而加入40%乙腈后则达到完全分离。不同亚型的免疫球蛋白G(IgG)在免疫反应中扮演不同的角色,Kelly等[6]使用CZE分离了不同亚型的IgG,检测手段为毛细管柱后亲和检测法。MECC是H PCE中的一种强效分析方法,它不仅可以分离带电组分,对不带电组分也可实现分离, Yashim a等[7]运用该方法,利用含有SDS(十二烷基磺酸钠)或CTAB(溴棕三甲铵)的缓冲液分离了[Let13]胃动素和[M et13]胃动素,这种分离在CZE 中没能实现。由此看来,通过对分离模式的选择和分离条件的优化,H PCE可对结构相似的蛋白质、多肽进行分离。在一般的毛细管电泳介质中加入特殊添加剂,可获得令人满意的分离效果,Rathore等[8]在50mmol/L、pH 2.5的磷酸钠溶液中加入20mmol/L CMBCD(羧甲基 环糊精),实现了血管紧张素异构体的分离。
2.2 蛋白质、多肽的纯度鉴定
20世纪末,生物制药业如雨后春笋蓬勃发展,许多生物技术药物已在临床上发挥重要作用,由于生物药品所特有的复杂性和质量要求的严格性,其纯度鉴定需要更强有力的手段。目前,常用的纯度鉴定手段有凝胶电泳和HPLC。凝胶电泳费时,自动化程度低,分辨率差;H PLC则具较高的分辨率,检测灵敏度也有所提高,并有自动化程度高等优点,因而,现在纯度鉴定多用H PLC法。而与HPLC相比,HPCE具有更高的分辨率和灵敏度,上样量也更少,仅为纳升级,这对珍贵的蛋白质样品分析非常有利,它是一种灵敏的蛋白质纯度鉴定方法。有些纯化的蛋白质在凝胶电泳和H PLC上鉴定纯度为100%,但用HPCE分析时纯度仅为90%[5],也就是说H PLC中的单峰在HPCE中出现多个峰;而用HPCE鉴定纯度为100%的样品,经H PLC鉴定其纯度往往也是100%。在蛋白质、多肽类药物的制备过程中,为优化工艺需对每一步的纯度进行测定, HPCE快速、高效的特点则能满足此要求。Willim 等[9]应用HPCE对乙肝疫苗的纯化步骤进行了监测。人生长激素(hGH)是一重要的蛋白质类药物,在该产品的研究、生产和质量控制中,HPLC起到了重要作用。但此蛋白质的少许脱氨基变异很难被检测出来,Frenz等[10]利用H PCE(CIEF、CZE)分析了hGH和脱一个氨基、脱二个氨基的hGH,获得良好的分离,使纯度鉴定结果更为可靠。糖蛋白类药物大多是由一组不同糖型的糖蛋白组成,糖型不同,疗效也不同,因此在生产过程的质量控制中,监测其不同的糖型很是重要。利用H PCE对重组人红细胞生成素[11]、重组人干扰素[7]、酪蛋白糖大肽[12]等糖蛋白的监测也已有报道。
2.3 蛋白质、多肽的性质研究
2.3.1 等电点测定 应用CIEF技术可准确测定蛋白质的等电点。先对一系列已知等电点的蛋白进行电泳,用等电点值作纵坐标,相对迁移值作横坐标,可得直线;再通过电泳测得未知物的相对迁移值,即可求得其等电点。也有报道,利用蛋白质通过检测窗时的电流值对等电点作图,经测未知物的电流值求得其等电点,这种方法不需内标,且准确度高,只有0.03个pH单位的误差[13]。
2.3.2 分子量测定 利用SDS CGE可以测定糖蛋白的分子量。由于多糖基团不结合SDS,糖蛋白的质荷比较相应的蛋白质低。用经典的SDS PAGE 电泳估测分子量偏差较大,通常须在不同浓度的凝胶上进行分析,得到糖蛋白迁移率对数值相对于凝胶浓度的线性关系图(Ferguson图),该直线的斜率称为此蛋白质的排阻系数Kr,Kr与蛋白质半径的平方成正比,而蛋白质的半径与其分子量的对数成线性,因此推得标准蛋白质分子量的对数相对于Kr 平方根的线性关系图,故测得糖蛋白的Kr值即可推测其分子量。运用传统的SDS PAGE电泳需多次灌胶多次电泳,而CGE应用溶液状的分离介质,只需对高浓度甲基纤维素的分离溶液进行一系列稀释,按照设定的程序自动分析即可得到Ferguson 图[14]。
2.3.3 稳定性研究 Alex ander等[7]用M ECC考查了chimeric BR96的热稳定性,对与抗体有关的链和碎片进行了分析,辅以基质辅助激光解吸质谱法,可对多肽的降解产物进行分析确认。对此,Hughes 和Richberg等[7]也进行了研究,分离了抗体的重链和轻链。蛋白质的折叠及其折叠程度与其功能密切相关,因此研究蛋白质的折叠非常重要。Slellw agen 等[15]以细胞色素C为例,运用H PCE研究了蛋白质的折叠行为。
2.4 蛋白质、多肽的结构分析
蛋白质、多肽经酶解后,用HPCE分离所得 指纹图谱 可提供蛋白质及多肽的结构信息。Frenz 等[10]分别利用RP H PLC和HPCE对胰蛋白酶降解的rhGH进行分析,H PLC大约用时150min, HPCE用时12min;在HPLC色谱图中没出现的峰在H PCE中出现了,收集H PLC中的单峰,再在HPCE中运行,出现了两个峰。此研究结果表明, HPCE是肽图分析中更有效的工具。蛋白质、多肽的氨基酸序列测定往往需酶解或化学降解,然后经HPLC分离,进入氨基酸自动分析仪进行序列测定;而采用CE,可快速扫描RP HPLC分离后的肽段是否为纯肽段,保证了序列测定的准确性。CE M S联用仪在大型实验室已被广泛应用,这种联用技术可得到产品和消化产品的分子量和特征信息,甚至可以测定蛋白质的一级结构。
微量蛋白质N 端顺序测定方法学一个引人注目的发展便是CE技术的应用。该方法所需样品量极微(10nl或更低),灵敏度比HPLC高二个数量级,可在1 10 6nmol水平上检测PTH(苯乙内酰硫脲)氨基酸。但目前商业提供的自动蛋白质测序仪每个循环所产生的PTH氨基酸样品液体积为100 l 左右,这与毛细管进样量不兼容,因而需要研制更加微型化的测序仪。最近已有几家实验室进行了很有
希望的尝试,加拿大Alberta大学的研究人员研制的微型测序仪,用注射泵输送毛细管反应室的试剂,不经任何阀门直接与反应室相连,可以精确输送数微升的试剂。这种微型测序仪与毛细管电泳联用的微量蛋白测序方法已呈现良好前景[16]。
2.5 蛋白质、多肽类药物的药代动力学研究
蛋白质、多肽类药物的药代动力学是药代动力学研究中的难点之一。此类药物用量小,体液浓度低,给检测带来困难。另外,体液中存在多种蛋白质,有些蛋白质与药物结构非常相似,更是给分离带来困难。HPCE具有高的分辩率和灵敏度,在蛋白质、多肽类药物的药代动力学研究中有独特优势。Chen等[17]研究了大鼠血浆中[D Pen2,5]脑啡肽的HPCE定量方法,由于[D Pen2,5]脑啡肽紫外吸收很弱,他们采用荧光试剂TRIT C对其进行衍生化,并对衍生化过程与结果进行了详尽的研究;经H PCE 分离,并用激光诱导荧光检测器进行检测,最低检测限可达1 10 18mol,这种低检测限满足了药代动力学测定的要求。
2.6 临床上监测体内蛋白质、多肽的动态变化
体内蛋白质、多肽含量的变化与人的疾病密切相关,H iraoka等[18]运用MECC分析了脑脊液中低分子量蛋白质 M G(Mr11700)、 T P(Trace pro tein)(M r12300)、骨磷脂碱性蛋白(M r18000)、 TP(Mr23000~30000)和 1酸性蛋白(Mr 42000),并对其中 MG和 T P进行了定量测定,与某些疾病的发生进行相关分析。结果表明,脑脊液中 M G和 T P的水平随中枢神经系统病理条件的变化而变化。
3 结 语
近几年,HPCE发展迅速,仪器愈来愈自动化,大多设置了恒温装置,使其重现性大大提高,不仅可以定性,而且能定量。在生命科学领域,CE尽显优势,应用于蛋白质、多肽研究的方方面面,从简单的纯度鉴定到复杂的序列测定。但是,CE也有其缺陷,如处理样品少和不能进行大量收集,而H PLC 可进行较大规模的制备,这两种技术应取长补短共同发展,而不是相互代替。CE与二维电泳(2D)的结合,有可能大大加速蛋白质组学的研究发展。
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甲状腺素与心肌离子通道关系及抗心律失常药的开发
张广钦, 戴德哉
(中国药科大学药理研究室,江苏南京210009)
摘 要:综述甲状腺素与心肌离子通道关系,包括其对心肌细胞Na+,K+,Ca2+通道的动力学影响。提示,甲状腺素急性给药对离子通道的调控是通过作用于细胞核外机制,慢性给药是通过作用于细胞核内受体蛋白,增加DNA的转录。指出阻断多种离子通道应成为开发抗心律失常药的主要方向,简介抗心律失常药的开发近况。
关键词:甲状腺素;心肌离子通道;抗心律失常药
中图分类号:R977.1+4;R972+.2 文献标识码:A 文章编号:1001-5094(2000)04-0208-04
The Relation of Thyroid Hormone to Ion C hannels in Cardiac Myocytes
and Development of Antiarrhythmic Dru gs
ZHA NG Guang qin, DA I De zai
(Research Division of Phar macology,China Phar maceutical Univer sity,N anj ing210009,China)
Abstract:In this article,the relation of thyroid hormone to ion channels in cardiac myocyte w as re view ed,including its effects on kinetics(activation,inactivation and recovery)of Na+,K+and Ca2+ channels,and it was indicated that the acute effects of thyroid hormone on ion channels in the heart w ere mediated by extranuclear mechanisms and its chronic actions were mediated by binding to specific nuclear receptor proteins and inducing DNA transcription in the nucleus.Recent developments of an tiarrhy thmic drugs w ere briefly introduced,with the antiarrhythmic agent blocking multiple ion chan nels promising.
Key words:Thyroid hormone;M yocardial ion channel;Antiarrhythm ic drug
甲状腺素(尤指T3和T4)在心肌电生理中起着重要作用,它有利于心脏的收缩性和节律性[1]。临床上,甲状腺素可为心麻痹、心肺分流术及心脏移植病人提供急性心肌收缩力支持和改善缺血后心肌功能。但甲亢状态下,甲状腺素能使心率加快,心肌兴奋性增高,尤其长期作用可诱发多种动物心肌肥厚,明显缩短心肌动作电位时程(APD),从而容易诱发心律失常[2~4];对大鼠心肌细胞,APD却是延长的,且诱发动物模型心律失常明显增加[5],这可能是动物种属差异所致。甲减状态下,APD延长,且对心律失常具有保护作用。这一现象在临床及实验动物模型中得到证实:甲减病人很少发生心律失常,而甲减动物对实验诱发的致死性心律失常有保护作用[6]。近年来,利用膜片箝技术研究发现,甲状腺素能调控心肌细胞膜上的离子通道,通过调节几种不同类型离子通道的功能,影响心肌电生理特征。本文就甲状腺素对心肌离子通道的影响及作用于不同离子通道的抗心律失常药的研究进展作一综述。
1 甲状腺素对离子通道的作用
1.1 Na+通道
Na+离子主要参与心肌去极化,Na+通道的改变直接影响心肌的自律性及APD。Huang[7]报道了甲状腺素对新生大鼠心肌细胞钠电流(I Na)的急性
收稿日期:2000 01 16
生物化学蛋白质的结构与功能试题及答案
第一章蛋白质的结构与功能 [测试题] 一、名词解释：1．氨基酸 2．肽 3．肽键 4．肽键平面 5．蛋白质一级结构 6．α-螺旋 7．模序 8．次级键 9．结构域 10．亚基 11．协同效应 12．蛋白质等电点 13．蛋白质的变性 14．蛋白质的沉淀 15．电泳 16．透析 17．层析 18．沉降系数 19．双缩脲反应 20．谷胱甘肽 二、填空题 21．在各种蛋白质分子中，含量比较相近的元素是____，测得某蛋白质样品含氮量为15.2克，该样品白质含量应为____克。 22．组成蛋白质的基本单位是____，它们的结构均为____，它们之间靠____键彼此连接而形成的物质称为____。 23．由于氨基酸既含有碱性的氨基和酸性的羧基，可以在酸性溶液中带____电荷，在碱性溶液中带____电荷，因此，氨基酸是____电解质。当所带的正、负电荷相等时，氨基酸成为____离子，此时溶液的pH值称为该氨基酸的____。 24．决定蛋白质的空间构象和生物学功能的是蛋白质的____级结构，该结构是指多肽链中____的排列顺序。25．蛋白质的二级结构是蛋白质分子中某一段肽链的____构象，多肽链的折叠盘绕是以____为基础的，常见的二级结构形式包括____，____，____和____。 26．维持蛋白质二级结构的化学键是____，它们是在肽键平面上的____和____之间形成。 27．稳定蛋白质三级结构的次级键包括____，____，____和____等。 28．构成蛋白质的氨基酸有____种，除____外都有旋光性。其中碱性氨基酸有____，____，____。酸性氨基酸有____，____。 29．电泳法分离蛋白质主要根据在某一pH值条件下，蛋白质所带的净电荷____而达到分离的目的，还和蛋白质的____及____有一定关系。 30．蛋白质在pI时以____离子的形式存在，在pH>pI的溶液中，大部分以____离子形式存在，在pH 简单蛋白质：完全由氨基酸构成的蛋白质 结合蛋白质：由AAs和其他非蛋白质化合物所组成 球状蛋白质：多肽链能够折叠，使分子外形成为球状的蛋白质。 纤维状蛋白质：能够聚集为纤维状或细丝状的蛋白质。主要起结构蛋白的作用，其多肽链沿一个方向伸展或卷曲，其结构主要通过多肽链之间的氢键维持。 单体蛋白质：仅含有AAs 寡聚蛋白质：由两个以上、十个以下亚基或单体通过非共价连接缔合而成的蛋白质。 等电点：蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质在电场中的迁移率为零。符号为pI。 氨基酸残基：在多肽链中的氨基酸，由于其部分基团参与了肽键的形成，剩余的结构部分则称氨基酸残基。它是一个分子的一部分，而不是一个分子。氨基酸的氨基上缺了一个氢，羧基上缺了一个羟基。简单的说，氨基酸残基就是指不完整的氨基酸。一个完整的氨基酸包括一个羧基（—COOH)，一个氨基(—NH2)，一个H，一个R基。缺少一个部分都算是氨基酸残基,并没有包括肽键的。 钛键：氨基和羧基脱去一分子水形成的化学键。 钛键平面：肽键所在的酰胺基成为的刚性平面。由于肽键具有部分双键性质，使得肽基的六个原子共处一个平面，称为肽平面。 同源蛋白质：在不同有机体中实现同一功能的蛋白质。（结构和功能类似的蛋白质。） 蛋白质一级结构：蛋白质多肽链的氨基酸通过肽键连接形成的线性序列。 蛋白质二级结构：指多肽链借助H键折叠盘绕成沿一维方向具有周期性结构的构象。 构象：分子的三维结构即分子中的所有原子在空间的位置总和。 构型：分子中的原子在空间的相对取向。 α-螺旋：它是蛋白质当中最为常见、最丰富的二级结构。多肽主链沿中心轴盘绕成右手或左手螺旋；每个螺旋周期有3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm，螺旋直径0.5nm；氨基酸残基侧链伸向外侧；同一肽链上的每个残基的酰胺氢原子和位于它后面的第4个残基上的羰基氧原子之间形成氢键，并且与螺旋轴保持大致上的平行。此外，肽键上的酰胺氢和羰基氧既能形成内部氢键，也能与水分子形成外部氢键。 β-折叠：常见的蛋白质的二级结构之一。呈片状,肽链主链取锯齿状折叠构象；肽链走向可能是平行的，也可能是反平行的。两条或多条肽链之间侧向聚集在一起，相邻多肽链羰基氧和酰胺氢之间形成氢键，氢键与肽链的长轴几乎呈直角；侧链R基交替分布于片层平面两侧。 β-转角：它大多分布在球状蛋白质分子表面，以改变肽链。它是一个发夹式转折，其特点是在于多肽链中第n个残基的一CO基与第n+3个残基的-NH基形成氢键。因此，一个多肽链的走向可以得到很好的扭转。因此，β-转角在球状蛋白质中是重要的二级结构，起到连接其他二级结构的作用。 超二级结构：蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，以充当三级结构的构件。 结构域：对于较大的蛋白质分子（或亚基），多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构，这种独立的折叠单位称为结构域。 蛋白质三级结构：指多肽链在二级结构的基础上借助各种次级键进一步盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。 蛋白质四级结构：具三级结构的球状蛋白质以非共价键缔合在一起，形成的聚集体称为蛋白质的四级结构。其中每个球状蛋白质称为亚基。 疏水相互作用：非极性的基团在极性溶液中相互靠近的相互作用。 别构蛋白质：是指除了具有结合底物的活性部位，还具有结合调节物别构部位的蛋白质。别构蛋白的活性部位和别构部位可以分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位与调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。 高效毛细管电泳实验 一、实验目的 1. 进一步理解毛细管电泳的基本原理； 2. 熟悉毛细管电泳仪器的构成； 3. 了解影响毛细管电泳分离的主要操作参数。 二、实验原理 1．电泳淌度 毛细管电泳（CE ）是以电渗流 (EOF)为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相微分离技术。离子在自由溶液中的迁移速率可以表示为： ν = μE （1） r 6 q πημ= （2） 式中ν是离子迁移速率，μ为电泳淌度，E 为电场强度。η为介质粘度，r 为离子的流体动力学半径，q 为荷电量。因此，离子的电泳淌度与其荷电量呈正比，与其半径及介质粘度呈反比。 2．电渗流和电渗淌度 电渗流（EOF ）指毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。 在水溶液中多数固体表面根据材料性质的不同带有过剩的负电荷或正电荷。就石英毛细管而言，表面的硅羟基在pH 大于3以后就发生明显的解离，使表面带有负电荷。为了达到电荷平衡，溶液中的正离子就会聚集在表面附近，从而形成所谓双电层，如图1所示。这样，双电层与管壁之间就会产生一个电位差，叫做Zeta 电势。但毛细管两端施加一个电压时，组成扩散层的阳离子被吸引而向负极移动。由于这些离子是溶剂化的，故将拖动毛细管中的体相溶液一起向负极运动，这便形成了电渗流。 电渗流的大小可用速率和淌度来表示： ()E EO F ηεξν/= （3） 或者 ηεξμ/=EO F （4） 式中νEOF 为电渗流速率，μEOF 为电渗淌度，ξ为Zeta 电势，ε为介电常数。 3．毛细管电泳的分离模式 CE 有6种常用的分离模式，其中毛细管区带电泳（CZE ）、胶束电动毛细管色谱（MEKC ）和毛细管电色谱（CEC ）最为常用。本实验的内容为CZE 。 4．毛细管电泳的基本参数 生物化学 第一章蛋白质化学 第一节蛋白质的重要性 ?蛋白质是机体最丰富的有机分子，占人体重量的16~20%，占干重的45%，肺组织高达80%。 ?蛋白质的生物学功能：生物催化作用、调节作用（激素，基因表达调控作用）、免疫防御与保护作用（细胞因子、补体、抗体）、转运和储存作用（转运蛋白）、结构功能（保护和维持细胞、组织、器官的正常生理形态，细胞骨架）、运动与支撑作用、信息接收 传递作用（受体蛋白）、生物膜功能 ?蛋白质组学：蛋白质组指的是基因组编码的全部蛋白质，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质；蛋白质组学本质上指的是在机体整体水平上系统地研究蛋白质的 特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白 质水平上的关于疾病发生、细胞代等过程的整体而全面的认识。 第二节蛋白质的化学组成 ?蛋白质含氮量平均为16%，蛋白质的含量=含氮量x6.25。 ?天然存在的氨基酸约180种，组成蛋白质的氨基酸只有20余种（基本氨基酸）。 ?基本氨基酸的共同特点：①除脯氨酸为α-亚氨基酸外，其他组成蛋白质的基本氨基酸均为α-氨基酸；②除甘氨酸外，其他氨基酸的α-碳原子为手性碳原子，且天然蛋白质中基本氨基酸皆为L-型；③不同的氨基酸的R链不同，对蛋白质的空间结构和理化性质有重要影响。 ?20种常见氨基酸的名称和结构式（见书P11） ?氨基酸的分类非极性R基氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸；极性不带电R基氨基酸（易溶于水）：甘氨酸、丝氨酸、 氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；带负电的R基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；带正电的R基氨基酸：赖氨酸、组氨酸、精氨酸。 ?氨基酸的物理性质：①高熔点，200℃以上，以离子状态存在；②一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂；③氨基酸一般有味；④除甘氨酸外均有旋 光性。 ?氨基酸的化学性质：①两性解离与等电点：pH高于等电点带负电，低于等电点带正电。 等电点时主要以两性离子存在，极少量以中性分子存在。中性氨基酸的pI在微酸性围，践行氨基酸的pI在碱性围，酸性氨基酸的pI在酸性围。②紫外吸收性质：色氨酸（280nm）、酪氨酸（275nm）和苯丙氨酸（257nm）含有苯环共轭双键系统，具有紫外吸收特性。③茚三酮反应：与大多数α-氨基酸加热反应产生蓝紫色物质，与脯氨酸、羟脯氨酸反应呈黄色，与天冬酰胺反应呈棕色；④α-羧基的反应：与碱、醇、硼氢化锂反应；⑤R基的反应：Million反应（Tyr-红色）、Folin反应（Tyr-蓝色）、坂口反应（Arg-红色）、Pauly反应（His、Tyr-橘红色）、乙醛酸的反应（Trp-紫红色环）。 ?氨基酸的功能：①寡肽、多肽、蛋白质的基本结构单位；②多种生物活性物质的前体； ③作为神经递质或神经营养素；④参与生物体的物质代和能量代。 第三节蛋白质的分子结构 ?蛋白质的一级结构包括：①组成蛋白质的多肽链的数目；②多肽链的氨基酸顺序；③多肽链或链间二硫键的数目和位置。 ?体多肽和蛋白质生物合成时，均是从氨基端开始，延长到羧基端终止，因此N末端被定为多肽链的头。 ?蛋白质一级结构的概念：蛋白质是由不同种类、数量和排列顺序的氨基酸，通过肽键而构成的高分子有机含氮化合物。它是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性和生物学 单元测试一：蛋白质化学 班级：姓名：分数： 一．填空题（每空1.5分，共30分） 1.当溶液pH等于某种氨基酸的等电点时，其带_ 零 _电荷；当溶液pH大于某种氨基酸的等电点时，其带_ 负 _电；溶液pH小于某种氨基酸的等电点时，其带_ 正电。 2.盐浓度低时，盐的加入使蛋白质的溶解度_ 增大 _，称为_ 盐溶__现象。当盐浓度高时,盐的加入使蛋白质的溶解度降低，称为盐析现象。 3.由甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸6种氨基酸残基组成的肽链 有 5 个肽平面，有 3 个游离羧基。 4.蛋白质分子结构包括一级结构和二级结构。 蛋白质的一级结构是由氨基酸通过肽键连接而成的多肽链。 6.蛋白质分子的基本组成单位是氨基酸。蛋白质的一级结构维持作用力是肽 键。蛋白质的分子结构决定蛋白质的性质和功能。 7.蛋白质二级结构主要有 a螺旋和B折叠形状，维持其稳定结构的化学键是 氢键。 判断题 1．用凝胶过滤(Sephadex G-100)柱层析分离蛋白质时，总是分子量大的先被洗脱下来，分子量小的后下来。对 2．变性后，蛋白质的溶解度增加（减小），这是因为电荷被中和（空间结构被破坏），以及水化膜破坏所引起的。错 3．变性后（物理变性不可逆，化学变性可逆，可复性）的蛋白质在一定条件下，有些还能复性，恢复其生物学功能。对 4．有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质的优点是有机溶剂容易蒸发除去，且不会使蛋白质变性。错 5.蛋白质分子的种类和差别，是由其空间结构决定的。错（一级结构） 6．蛋白质主要是由C、H、O、N四种元素组成。对 7．氨基酸通过肽键连接而成的化合物称为肽。对 8．天然蛋白质的基本组成单位主要是L-α-氨基酸。对 9．肽键(-CO-NH-)中的C-N键可自由旋转，使多肽链出现多种构象。错（不可旋转） 10．维持蛋白质二级结构的化学键是氢键及范德华力（不是）。错 11．蛋白质一级结构对空间结构起决定作用，空间结构的改变会引起功能的改变。对 12．维持蛋白质二级结构稳定的主要作用力是氢键。对 13．蛋白质必须具有四级结构才具有生物活性。错（肌球蛋白是三级结构可存活） 14．蛋白质四级结构中的每个亚基单独都具有生物活性。错（不具有活性） 15．具有四级结构的蛋白质分子一定是由两条或两条以上的多肽链组成的。对 16．溶液中带电粒子在电场中向电性相同（相反）的电极移动，这种现象称为电泳。错 17．溶液pH值等于7时，蛋白质不带电荷。错 18．加热、紫外线、X射线均可破坏蛋白质的空间结构。对 毛细管电泳分析方法在食品安全监控中的应用 （华东师大化学系叶建农） 食品安全是指食品中不应含有可能损害或威胁人体健康的有毒、有害物质或因素，从而导致消费者急性或慢性毒害或感染疾病、或产生危及消费者及其后代健康的隐患。近年来，世界范围内食品安全方面的恶性和突发事件不断发生。据美国疾控中心研究报告估计，美国每年因食品中毒而死亡的人数约5000人左右。日本也先后发生出血性大肠埃希菌O157食品中毒事件，以及导致上万人中毒的雪印牛奶事件。目前我国食品安全形势不容乐观，食品中毒事件时有所闻。据不完全统计，我国每年实际发生的食物中毒例数在200万人次以上，其中有相当比例是由违禁食品添加剂引起，如2005年“苏丹红”事件，2006年“瘦肉精”事件，2008年“三聚氰氨”事件等。这类事件不仅严重危害人们身体健康，而且也对经济发展和国家形象产生及其负面的影响。客观而言，目前我国食品安全仍处于风险高发期和矛盾凸显期，有必要进行全方位的整治。其中的一个环节，就是要切实做好食品安全监控工作。 食品分析大致可分为两大类，即食品中营养成分分析，以及食品中化学添加剂、化学污染物的分析。由此可见，食品安全监控的主要内容，本质上是指能够准确分析和严格控制食品中化学添加剂及化学污染物的种类和含量。其中食品添加剂属限用品。根据我国卫生部2008年新修订的“食品添加剂使用卫生标准” (GB2760-2007）规定，在一定前提下可合法使用的食品添加剂总数为1812种，共分为22大类。这一千多种食品添加剂虽然已经卫生部认可，但对其允许的添加范围及添加量却有严格的规定和限制。至于化学污染物则属违禁品，有时又叫禁用品，即在任何条件下均不得人为添加，如苏丹红、瘦肉精、孔雀石绿、三聚氰氨等。 从理论上讲，现有的化学分析方法都有可能在某种程度上应用于食品安全监控。如比色法、滴定法、水解法、蔡氏砷斑法、凯氏定氮法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、色谱－质谱联用法、毛细管电泳法等。 毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）是近二十来发展最快的一种分离分析技术，具有分离效率高、所需样品量少、分析成本低等优点。毛细管电泳分析法是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度的差异而实现分离的一种液相分离技术。由于食品组成的复杂性，检测前的各组分之间的分离是必不可少的。食品中各组分经毛细管分离后，即可选用合适的检测器进行检测，如紫外吸收检测（UV）、激光诱导荧光检测（LIF）、电化学检测（EC）等。 近年来，国内外化学工作者开展了大量的研究工作，探索和开发毛细管电泳分析方法在食品安全监控中的具体应用。众所周知，有机磷农药是目前使用量最大的杀虫剂，占全部农药用量的80％以上，广泛用于谷物、棉花、果树等农作物。有机磷农药 高效毛细管电泳-非接触式电导检测法的应用 ——瓶装矿泉水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+的分离检测 摘要本实验采用毛细管电泳–非接触式电导检测法，以8mmol?L-1Tris 和6mmol?L-1酒石酸为电泳运行液，分离电压为+15 kV，采用标准加入法，对瓶装矿泉水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+四种阳离子同时进行直接分离和检测。实验测得逸仙泉矿泉水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+的含量分别为2.57mg·L1、13.46mg·L-1、4.99mg·L-1、1.82mg·L-1，发现K+、Mg2+含量均大大超出厂家提供的含量范围。 关键词高效毛细管电泳非接触电导检测法中大逸仙泉水分离检测标准加入法 1 引言 Na+、K+、Ca2+、Mg2+是人体内重要的无机阳离子，这些离子含量的高低直接影响人体的生理功能。Mg2+是人体细胞内的主要阳离子，浓集于线粒体中，是体内多种细胞基本生化反应的必需物质，在神经肌肉的机能正常运作、血糖转化等过程中扮演着重要角色。K+在人体内的主要作用是维持酸碱平衡，参与能量代谢以及维持神经肌肉的正常功能。人体中的钙元素主要以羟基磷酸钙晶体的形式存在于骨骼和牙齿中。Na+是细胞外液中带正电的主要离子，参与水的代谢，保证体内水的平衡，调节体内水分与渗透压，此外，糖代谢、氧的利用、维持正常血压也需要钠的参与。矿物质水中这些离子含量的高低决定了水质是否符合标准。因此，研究快速分离测定这些离子的含量很有实际的意义。 由于要同时测量四种离子含量，因此传统的对单一离子测量的方法不能用，毛细管电泳–非接触式电导检测法，可以同时对K+、Na+、Ca2+、Mg2+四种阳离子同时进行直接分离并且检测含量，相比已有的实验方法，本实验具有灵敏度高，操作简便，而且可以同时测定四种不同离子的含量，离子之间不存在相互干扰，极大地提高了实验效率，实验结果令人满意。 高效毛细管电泳的检测器中，非接触式电导检测（Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detection, 简称C4D）是近年来发展起来一种新型的电导检测方法。非接触式电导检测法的电极与待测溶液隔离，避免了因电极与溶液接触而造成的诸多问题，有效地消除了电极中毒的问题，电极寿命长，抗干扰能力强，可检测物质的范围广。HPCE–C4D具有通用性好、灵敏高、分析成本低和环境友好的优点，在日常分析中具有广阔的应用前景。 2 实验部分 2.1仪器试剂 蛋白质化学复习总结 1、蛋白质概念：是由20种α-氨基酸通过肽键相互连接而成的具有特定空间构象和生物学活性的高分子有机化合物。几乎所有的酶都是蛋白质。 2、各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮16%（凯氏定氮），粗蛋白质含量=蛋白氮（样品含氮量）×6.25。 3、氨基酸(amino acids)是蛋白质的基本组成单位。组成蛋白质的标准氨基酸有20种，19种氨基酸具有一级氨基(-NH2)和羧基(-COOH)结合到α碳原子(Cα)，同时结合到(Cα)上的是H原子和各种侧链；Pro具有二级氨基(α-亚氨基酸)，各种氨基酸的差别在于侧链R基的不同。 4、20种氨基酸都属于L-构型。20种氨基酸平均分子量为138。 5、氨基酸的分类：⑴根据R的化学结构：①脂肪族氨基酸；②芳香族氨基酸；③杂环氨基酸；④杂环亚氨基酸。⑵根据R的极性：①非极性氨基酸；②极性、不带电荷氨基酸；③酸性氨基酸；④碱性氨基酸。 6、一般物理学性质：①形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。②溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀碱中溶解性好。③熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于200℃，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。④旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。⑤光吸收：氨基酸在可见光范围内无光吸收，在近紫外区含苯环氨基酸有光的吸收。⑥紫外吸收：蛋白质在280nm波长下的紫外吸收性质绝大部分是由色氨酸和酪氨酸所引起的。色氨酸：279nm苯丙氨酸；259nm；酪氨酸：275nm。 7、氨基酸的化学性质： ⑴两性解离(amphoteric ionization)：氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以两性离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的-NH3+正离子和能接受质子的-COO-负离子，所以氨基酸为两性电解质。 氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境中，主要以阴离子的形式存在。在某一pH环境下，以两性离子（兼性离子）的形式存在。该pH称为该氨基酸的等电点。所以氨基酸的等电点可以定义为：氨基酸所带正负电荷相等时的溶液pH。 ⑵等电点( isoelectric point，pI )：在一定的pH条件下，氨基酸分子中所带的正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点(isoelectric point)，用pI 表示。氨基酸在等电点时溶解度最小。当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。pH tion of ceriv astatin in mice,rats,and do gs in vivo[J]. Dr ug M etab D ispos,1998,26(7) 640 652. [19]L indon JC,Nicholson JK,Sidelman U G,et al.Directly coupled HPL C N M R and its application to drug metabolism[J].Dr ug M etab Rev,1997,29 705 746. [20]Sidemann UG,Braumann U,Hofmann M,et al.Direct ly coupled800MHz HPLC N MR spectroscopy of ur ine and its application to the identification of major phase metabolites o f tolfenamic acid[J].A nal Chem,1997,69 607 612. [21]William JE,Joseph M W,T odd M B,et al.L iquid chro matography/nuclear magnetic resonance spectrosco py and liquid chr omatog raphy/mass spectrometry identification of novel metabolites of the mult idrug resistance modulator LY335979in rat bile and human L iver microsomal incu bat ions[J].Dr ug metab D isp os,1998,26(1) 42 51. 高效毛细管电泳及其在蛋白质、多肽分析中的应用 孔 毅, 吴如金, 吴梧桐 (中国药科大学,江苏南京210009) 摘 要:高效毛细管电泳(HPCE)是一种分离效率高、检测灵敏度高、样品用量少的分析技术。本文简述HPCE的研究进展及基本原理,着重介绍了它在蛋白质及多肽的分离、纯度鉴定、性质研究、结构分析、临床检测、药代动力学研究等方面的应用。 关键词:高效毛细管电泳;蛋白质;多肽 中图分类号:O658.9;Q51 文献标识码:A 文章编号:1001-5094(2000)04-0204-05 High Performance C apillary Electrophoresis and Its Application in Analysis of Protein and Peptide K ON G Yi, WU Ru jin, WU W u tong (China Phar maceutical University,N anj ing210009,China) Abstract:H ig h performance capillary electrophoresis(HPCE)is characterized as an analysis method, w hich show ed high selectiv ity and high sensitivity,but needed only little sample.In this article,the de velopment of HPCE and its foundamental principle were briefly introduced,and its applications to sepa ration,purity determ ination,characterization study,structural analysis,clinical monitoring and phar macokinetics of protein and peptide were emphasized. Key words:H PCE;protein;peptide 蛋白质、多肽是生命科学中一类重要的生物大分子物质,是生物体实现其功能的物质基础。在医药领域,有许多疗效很好的蛋白质、多肽类药物,如促红细胞生成素、干扰素、白介素、重组人生长激素等都是近年开发的蛋白质类药物。在后基因组时代,蛋白质组学成为一门重要的新兴学科,其任务就是研究细胞内所有蛋白质的组成及其活动规律[1]。因此,许多研究机构和大财团都在投入人力物力对蛋白质及多肽进行研究,这些复杂的研究工作对分析手段提出了更高的要求。 高效毛细管电泳(HPCE)是近十几年发展起来的一项新的分析技术,它将电泳技术和色谱技术结合,是继高效液相色谱(H PLC)出现之后,分析科学领域的又一次革命。研究与实践表明HPCE具有以下特点:分离效率高(理论塔板数达106~107/ m);快速(20~30min内完成一次电泳操作);样品用量少(仅为纳升级,可对单细胞液进行分离分析);灵敏度高(用激光诱导荧光检测器,可达1 10 24 收稿日期:1999 10 14; 修回日期:1999 12 20 无样品峰出现 A、检查电流是否稳定： ①没有电流。 可能原因——毛细管堵塞或断裂。解决方法——用水冲洗毛细管，并观察是否有水流出，若无水流出请拆下卡盒检查毛细管两端和窗口是否断裂；毛细管没有断裂的话可以用水反向高压冲洗以试图解决此问题。缓冲溶液需要过滤，将样品过滤或者离心去除其中的颗粒。 ②电流波动很大，直至几乎消失。 可能原因——缓冲溶液中有气泡产生或者区带中样品析出。解决方法——将缓冲溶液超声脱气，如果还有此现象发生，则可能是样品区带有析出，可以通过降低样品浓度/ 延长ramp time 来试图解决这一问题；对于在缓冲溶液中溶解度不高的样品则需要在缓冲溶液中加入添加剂以解决此问题。 ③电流初始值较小，后逐渐增大。可能原因——样品进样量过大。解决方法——减少进样量，通常进样参数设置在0.5psi,5sec 左右。 ④电流正常。 可能原因：a 样品浓度过低：使用高浓度样品测试，如果无法解决则有可能是以下其他原因。b 检测波长设置不正确：请确认被分析物的特征吸收，检查方法中的检测波长设置。c 分离 极性错误：对于蛋白样品，请注意蛋白在分离条件下其PI及所带 电荷；对于核酸样品，通常条件下会带负电荷。d样品在 毛细管内壁吸附：对于蛋白及核酸样品应尽量采用涂层毛细管分 离，或采用极端pH条件或动态涂层防止样品吸附。e光学检测器或光纤损坏：进行标准样品的测试，如果没有对应的结果出现，则有可能存在硬件问题，请联系工程师。 B、检查毛细管窗口，是否有透明窗口： 可能原因一一忘记开毛细管窗口或窗口位置不正。 解决方法一一重新开毛细管检测窗口，或将窗口调整到正确位置。 二、样品峰出现拖尾 可能原因一一样品在毛细管内壁吸附。 解决方法一一对于蛋白及核酸样品应尽量采用涂层毛细管分离，或 采用极端pH条件或动态涂层防止样品吸附。 三、样品峰形不对称 A、检查毛细管入口： 可能原因一一毛细管入口切口不平齐。 解决方法一一重新切割毛细管入口，注意毛细管切割方法，不可以 用力过猛或反复刮擦。 高效毛细管电泳色谱仪的介绍 高效毛细管电泳色谱仪（CE）是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，利用荷电粒子之间的淌度差异和分配系数差异进行分离。由于CE溶质区带的超小体积特性导致光程太短，圆柱形毛细管作为光学表面不够理想，对检测器灵敏度要求相当高。CE常用检测器有紫外检测器、激光诱导荧光检测器、质谱检测器和电化学检测器等。 一、紫外检测器： 紫外检测器是基于物质对紫外吸收进行检测，是成熟的检测器，在CE中应用广。 1、原理： 入射紫外光通过样品时，被吸收的多少符合朗伯－比耳定律。 检测点在毛细管的末端，检测点的毛细管的外涂层要烧掉。 2、检测方法： （1）固定波长： 光源为低紫外氘灯，用滤光片获得固定波长的光。 （2）可变波长： 光源为氘灯或钨灯，用单色器（棱镜或光栅）获得连续可调波长的光。 （3）快速扫描： 1）利用线性二极管阵列快速捕获紫外光。 2）利用硅光电倍增管作快速扫描。 3、特点： （1）通用性好，特别是对蛋白质的适用性很强。 （2）灵敏度不足。 4、提高灵敏度的方法： 由于CE检测池的光路长度为毛细管内径，一般不超过100μm，小内径的毛细管限制了紫外检测器的灵敏度，可采用以下几种方法来提高灵敏度。 （1）优化测定波长： 通过测定不同波长下的信噪比来选择测定波长，以提高灵敏度。 （2）减少检测噪音： 1）提高光源强度。 2）采用聚焦和狭缝等减少背景光的影响。 3）采用良好的信号放大系统。 （3）扩展吸光光路长度： 1）为了克服圆柱形毛细管表面引起的散射、失真等不利的光学特性和增加光路长度，可采用矩形、扁形、Z形和泡型等特殊毛细管。当然柱效会有所下降。 2）对于普通毛细管，可采用轴向照射和多次反射来增加光路长度。 ①轴向照射：将激光光束从毛细管末端沿管轴方向入射，在毛细管侧面进行检测。 ②多次反射：在毛细管壁镀上银，分别开入射窗和出射窗。当入射光以特定角度入射后，在毛细管内反射30～40次后从出射窗口射出。 二、激光诱导荧光检测器： 激光诱导荧光检测器采用激发光源使检测物质产生荧光进行检测。 检测下限为10ˉ12～10ˉ10mol/L。 三、质谱检测器： 在CE－MS联用中，毛细管区带电泳为常用。电子喷雾离子源可检测多种高质量的带电分子，从CE分离出来的分子经过接口后直接进入MS，是MS的离子源。 检测下限为10ˉ9～10ˉ7mol/L，通用性好，可获得溶质的结构信息，但接口复杂。 四、电化学检测器： 电化学检测器可避免光学类检测器遇到的光程太短的问题，是CE中灵敏的检测器之一。 1、电导检测器： 柱上电导检测是在毛细管壁上用激光钻两个孔，插上两根铂电极，再将孔封住进行检测。 检测下限为10ˉ7～10ˉ5mol/L，通用性好，但需专门装置和毛细管处理。 2、安培检测器： CE中微量样品可使库仑效率大大提高，可达40%以上，而在HPLC中很少超过10%。 检测下限为10ˉ9～10ˉ8mol/L，灵敏度高，选择性好，但仅适用于电活性物 毛细管电泳的基本原理及应用 摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC 分析高效、快速、微量。 关键词：毛细管电泳原理分离模式应用 1概述 毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。 毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。C E只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。 毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点，因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2]。 单元二蛋白质 一. 单项选择题 1. 下列不含有手性碳原子的氨基酸是 A. Gly B. Arg C. Met D. Phe E. Val 2. 那一类氨基酸在脱去氨基后与三羧酸循环关系最密切 A. 碱性氨基酸 B. 含硫氨基酸 C. 分支氨基酸 D. 酸性氨基酸 E. 芳香族氨基酸 3. 一个酸性氨基酸，其pH a1＝2.19，pH R ＝4.25，pH a2 ＝9.67，请问其等电点是 A. 7.2 B. 5.37 C. 3.22 D. 6.5 E. 4.25 4. 下列蛋白质组分中，那一种在280nm具有最大的光吸收 A. 酪氨酸的酚环 B. 苯丙氨酸的苯环 C. 半胱氨酸的巯基 D. 二硫键 E. 色氨酸的吲哚环 5. 测定小肽氨基酸序列的最好办法是 A. 2,4-二硝基氟苯法 B. 二甲氨基萘磺酰氯法 C. 氨肽酶法 D. 苯异硫氰酸酯法 E. 羧肽酶法 6. 典型的α-螺旋含有几个氨基酸残基 A. 3 B. 2.6 C. 3.6 D. 4.0 E. 4.4 7. 每分子血红蛋白所含铁离子数为 A. 5 B. 4 C. 3 D. 2 E. 1 8. 血红蛋白的氧合曲线呈 A. U形线 B. 双曲线 C. S形曲线 D. 直线 E. Z形线 9. 蛋白质一级结构与功能关系的特点是 A. 氨基酸组成不同的蛋白质，功能一定不同 B. 一级结构相近的蛋白质，其功能类似可能性越大 C. 一级结构中任何氨基酸的改变，其生物活性即消失 D. 不同生物来源的同种蛋白质，其一级结构相同 E. 以上都不对 10. 在中性条件下，HbS与HbA相比，HbS的静电荷是 A. 减少＋2 B. 增加＋2 C. 增加＋1 D. 减少＋1 E. 不变 11. 一个蛋白质的相对分子量为11000，完全是α-螺旋构成的，其分子的长度是多少nm A. 11 B. 110 C. 30 D. 15 E. 1100 12. 下面不是空间构象病的是 A. 人文状体脊髓变性病 B. 老年痴呆症 C. 亨丁顿舞蹈病 D. 疯牛病 E. 禽流感 13. 谷胱甘肽发挥功能时，是在什么样的结构层次上进行的 A. 一级结构 B. 二级结构 C. 三级结构 D.四级结构 E. 以上都不对 14. 测得某一蛋白质样品的含氮量为0.40g，此样品约含蛋白质多少克 高效毛细管电泳的发展及应用 摘要：高效毛细管电泳（即HPCE）是在传统电泳基础上继现代高效液相色谱技术之后发展起来的一种新型高效分离技术，由于效率更高、速度更快、样品和试剂消耗量特少的特性，逐渐受到越来越多科学家们的青睐。本文结合HPCE的发展史、基本原理、分离模式以及在现实中的实际应用，对毛细管电泳做了系统的分析，并提出合理的展望。 关键字：毛细管电泳；发展史；原理；分离模式；应用 高效毛细管电泳（即HPCE）是在传统电泳基础上继现代高效液相色谱技术之后发展起来的一种新型高效分离技术，它是在熔融的石英毛细管（内径为25～100μm）中进行电泳，其管内填充缓冲液或凝胶，是近年来进展最快的分析方法之一。 毛细管电泳可以说是电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，它具有效率更高、速度更快、样品和试剂消耗量特少的特性，因而也受到越来越多科学家们的青睐。 一、毛细管电泳的发展史 1967年在高电场作用下，以3mm直径的毛细管内进行自由溶液的区带电泳，1974年报道了以200-500μm内径玻璃毛细管内进行的区带电泳分析，早期的研究受当时检测灵敏度的影响，未获预期的高效分离效率，但为毛细管电泳分离的发展奠定了基础。 1981年人们第一次展示了毛细管区带电泳，使用75微米内径的玻璃毛细管和荧光检测器进行在线检测，在30KV电压下，分离了氨基酸和多肽类物质，塔板数高达40万，这一工作被认为是现代毛细管电泳发展的里程碑。1983年将聚胶柱制备困难的缺点。1984年使用含有表面活性剂的背景电解质，开辟了毛细管电泳另一个重要分支——胶束毛细管电动力学色谱。1987年又结合传统的等电聚焦电泳和凝胶电泳原理，并移到毛细管内进行电泳，1988年实现了微量制备的可能性，提取和分离了50μmol的蛋白质、肽和寡核苷酸等。80年代未， 一、填空题 1．构成蛋白质的氨基酸有种，一般可根据氨基酸侧链（R） 的大小分为侧链氨基酸 和侧链氨基酸两大类。其中前一类氨基酸侧链基团的共同特怔是具有性；而后一类氨基酸侧链（或基团）共有的特征是具有性。碱性氨基酸（pH6～7时荷正电）有两种，它们分别是氨基酸和氨基酸；酸性氨基酸也有两种，分别是氨基酸 和氨基酸。 2．紫外吸收法（280nm）定量测定蛋白质时其主要依据是因为大多数可溶性蛋白质分子中含有氨基酸、氨基酸 或氨基酸。 3．丝氨酸侧链特征基团是；半胱氨酸的侧链基团 是；组氨酸的侧链基团是。这三种氨基酸三字母代表符号分别 是、、、4．氨基酸与水合印三酮反应的基团是，除脯氨酸以外反应产物的颜色是；因为脯氨酸是a—亚氨基酸，它与水合印三酮的反应则显 示色。 5．蛋白质结构中主键称为键，次级键 有、、 、、；次级键中属于共价键的是键。 6．镰刀状贫血症是最早认识的一种分子病，患者的血红蛋白分子b亚基的第六位 氨酸被氨酸所替代，前一种氨基酸为性侧链氨基酸，后者 为性侧链氨基酸，这种微小的差异导致红血蛋白分子在氧分压较低时易于聚集，氧合能力下降，而易引起溶血性贫血。 7．Edman反应的主要试剂是；在寡肽或多肽序列测定中，Edman反应的主要特点 是。 8．蛋白质二级结构的基本类型 有、 、 和 。其中维持前三种二级结构稳定键的次级键为 键。此外多肽链中决定这些结构的形成与存在的根本性因 与、、 有关。而当我肽链中出现脯氨酸残基的时候，多肽链的a-螺旋往往 会。 9．蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，其稳定性主要因素有两个，分别是 和 。 10．蛋白质处于等电点时，所具有的主要特征 是、。 11．在适当浓度的b-巯基乙醇和8M脲溶液中，RNase（牛）丧失原有活性。这主要是因为RNA酶的被破坏造成的。其中b-巯基乙醇可使RNA酶分子中的键破坏。而8M脲可使键破坏。当用透析方法去除b-巯基乙醇和脲的情况下，RNA酶又恢复原有催化功能，这种现象称为。 12．细胞色素C，血红蛋白的等电点分别为10和7.1，在pH8.5的溶液中它们分别荷的电性是、 。 13．在生理pH条件下，蛋白质分子中氨酸 和氨酸残基的侧链几乎完全带负电， 而氨酸、氨酸 或氨酸残基侧链完全荷正电（假设该蛋白质含有这些氨基酸组分）。14．包含两个相邻肽键的主肽链原子可表示 为，单个肽平面及包含的原子可表示 为 。 15．当氨基酸溶液的pH＝pI时，氨基酸（主要）以离子形式存在；当pH＞pI时，氨基酸（主要）以离子形式存在；当pH＜pI时，氨基酸（主要）以离子形式存在。生物化学名词解释——蛋白质
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