氨基酸测定
茚三酮显色法测定氨基酸的含量
一．原理：
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：
721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：
（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液
（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
1
2
3
4
5
6
0.3 mmol 标准氨基酸溶液0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
2mol/L醋酸缓冲液
1
1
1
1
1
1
茚三酮显色液
1
1
1
1
1
1
OD570
混匀，盖住试管口后在100°水浴加热15min，然后用自来水冷却。放置5min 后，加入3ml 60%的乙醇稀释，充分摇匀。
2．氨基酸样品的测定取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。
4.1光度分析法
β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发
现很多因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。
4.1.1试剂的配制：
缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc－HAc缓冲溶液
β-氨基丙酸标准溶液的配制：
用电子天平准确称取1.020 gβ-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L标准溶液。
茚三酮试剂的配制：称取0.5g茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。4.1.2标准曲线的确定
分别准确移取0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml再加入1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。
4.1.3样品的测定
稀释待测液于0.24mg/ml—0.73mg/ml,调pH值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。
4.1.4 标准曲线的测定结果
β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1：
4.1.5样品的测定分析
将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的
反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=6.00的缓冲液稀释到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,
4.1.6 浓度对显色反应的影响:
实验表明，β-氨基丙酸与茚三酮水溶液在表3所注的条件反应的最低浓度为0.24mg/ml，随着β-氨基丙酸的浓度变大显色逐渐变深。当浓度大于0.73mg/ml时，所显颜色过深或生成紫色化合物影响其吸光度。当β-氨基丙酸的浓度在0.24mg/m—0.73mg/ml时，颜色变化明显而且稳定，因此，我选定此浓度范围作为测定范围。得到的数据如表4：
4.1.7 pH值对显色反应的影响[8]
以1.5mg/ ml的标准溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加热10min,观察到的颜色变化如表5：
显色反应随着pH值得不同，颜色有着明显的变化。当pH值小于3.42时几乎无色，而在pH 值在3.78—7.44时颜色变化明显。pH值为6.00，加热不到二分钟即显色；pH值为9.05，加入茚三酮溶液后不加热30s左右即显红棕色；茚三酮水溶液在强碱的条件下带有明显的淡黄色。因此pH值为6.00左右最好。故我选定pH值为6.00。此时显色明显无干扰且稳定。4.1.8温度和反应时间的影响：
实验表明：温度和反应时间对此显色反应的影响很大。温度太低，反应太慢导致显色时间长，而且显色效果不好。而温度过高，反应时间长对此反应影响也很大，会生成紫色化合物影响其吸光度。在显色反应中，反应时间主要根据具体的颜色变化而定。一般来说，β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml时，在
沸水中加热10min即可，时间太短，反映不完全颜色梯度不明显。时间过长，溶液挥发严重也影响其吸光度。故我把反应时间定在10min左右。
4.1.9其他因素的影响
不同溶剂的茚三酮溶液对显色反应也有一些影响。为了区别它们对显色反应的影响，我做了
如下实验：分别称取0.2002g茚三酮三份，分别溶于乙醇、水、丙酮各100ml中，可以观察到：丙酮溶解茚三酮的速度最快，乙醇次之。移取β-氨基丙酸标准溶液(4.080g/l)1ml三份,用pH值为6.00的NaAc－HAc缓冲溶液稀释到5ml再依次加入1ml茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加热。实验表明：在加热2min时，乙醇溶液开始显色；丙酮溶液的显红棕色；水溶液无色。在加热6min时，丙酮溶液的颜色加深；水溶液显浅蓝色；乙醇溶液的所显颜色最深。
乙醇易挥发，在加热的条件下挥发更严重。基于这一点的考虑，我采用茚三酮水溶液。而茚三酮的用量对此显色反应的影响不大，可以选择5ml的被测液与1ml(5g/l)的茚三酮水溶液反应。测定时，最好选择标样与待测液在同一水浴。这样可以减少误差提高测定的准确度。另外，当被测液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以与茚三酮发生显色反应，影响测定结果。总之，茚三酮比色法作为一种β-氨基丙酸的定量检测方法具有操作简单、成本低的优点。只要控制好反应条件就能得到较好的测量结果。
三．茚三酮比色法：
1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色
法定量测定。
2试剂：
（1）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下：
称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml
称NAH2PO4·12H2O 11.9380g分别溶解定容500ml
取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液
（2）2%茚三酮溶液：
称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡（SnCl2·H2O）搅拌过
滤（作防腐剂）→于冷暗处过夜→定容50ml
①氨基酸标液
称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于
另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml标液
3操作方法：
（1）绘制标准曲线：
取7个25ml容量瓶，吸取标液0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7个25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml，静置15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。
（2）样品测定：
取样品5.00~10.0g（液体样5-10ml）→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5g→加热过滤→用30—40ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟，冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。
氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100
C——从标准曲线上查得得氨基酸的量（Ug）
W——测定得样品溶液相当于样品的量（g）
注意事项：
茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。茚三酮显色法测定氨基酸含量
氨基酸态氮的测定
FSPTWPJY003 酱油 氨基酸态氮的测定 中和滴定法 F_SP _TWP_JY _003 酱油—氨基酸态氮的测定—中和滴定法 1 范围 本方法采用滴定法测定酱油中氨基酸态氮的含量。 本方法适用于各种类型酱油中氨基酸态氮含量的测定。以g/100mL 报告其结果，测定值保留两位小数。 2 原理 利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。 3 试剂 3.1 甲醛溶液，体积百分数为37~40。 3.2 氢氧化钠标准溶液，c (NaOH)＝0.1mol/L 3.2.1 配制 将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。量取5mL 氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL 不含二氧化碳的水中，混匀。 3.2.2 标定 称取0.6g 于105～110℃烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001g 。溶于50mL 不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。同时做空白试验。 3.2.3 计算 按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度： C ＝2042 .0)(1×?V V m 式中：C —氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L ； m —基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g ； V —滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL ； V 1 —空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL ； 0.2042—与1.00mL 氢氧化钠标准溶液[c (NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的 邻苯二甲酸氢钾的质量。 3.3 氢氧化钠标准滴定溶液，c (NaOH)＝0.05mol/L 将配制的0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液准确稀释一倍。 4 仪器 4.1 分析天平，感量0.1mg 。 4.2 酸度计，附磁力搅拌器； 4.3 碱式滴定管，25mL 。 5 操作步骤 5.1 仪器校准 按仪器使用说明书校正pH 计，并注意校正温度使其与测定时保持一致。 将玻璃电极和甘汞电极事先用pH 9.22标准缓冲溶液校准。 5.2 样品的测定 吸取酱油样品5.0mL 置于100mL 容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL ，置于200mL 烧杯中，加水60mL ，插入玻璃电极和甘汞电极，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准滴定溶液
日立L-8900全自动氨基酸分析仪简易标准操作规程重点讲义资料
日立L-8900全自动氨基酸分析仪标准操作规程 一. 目的 为规范日立L-8900全自动氨基酸分析仪的基本操作、维护保养、异常处理程序，防止人为操作失误，确保氨基酸分析仪正常运转，特制定本程序。 二. 适用范围 本程序适用于日立L-8900全自动氨基酸分析仪。 三．责任 1. 本程序的实施者为氨基酸分析仪操作者，各实验室负责人对本程序的实施情况进行监 督。 2. 日常运行及维护、定期维护、定期点检及保养由氨基酸分析仪操作者负责。 四. 内容 1．联机 （1）打开电脑。 （2）打开L-8900主机电源。 （3）双击桌面的图标，进入1-1画面，双击图标，进入程序。 1-1 （4）在菜单栏中依次点击和，出现1-2画面，单击
联机。大约两分钟，初始化完毕。中Uninitialized 变成Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。初始化完毕后，分离柱的温度逐渐上升，分离柱的温度会升到50℃。如果打开反应柱的柱温控制，则温度大约20分钟升到135℃。 1-2
1-3 2、手动各组件控制操作 （1）泵1和泵2 点击，出现2-1的画面。设置泵1，流量0.1ml/分钟，B6 100%。点击 打开泵1。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-1 点击，出现2-2的画面，设置泵2，流量0.1ml/分钟，R3 100%。点击 打开泵2。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。 2-2 （2）自动进样器 点击，出现2-3的画面，设置Sampler Wash不少于3次。
2-3 （3）分离柱柱温箱 点击，出现2-4画面，设置柱温50℃，设置ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。 2-4 （4）反应柱柱温箱 点击，出现2-5画面，设置柱温135℃，设置ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。 2-5
氨基酸测定方法
4.1 光度分析法[5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 4.1.1试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc －HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取1.020 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取0.5g 茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。 4.1.2标准曲线的确定 分别准确移取0.30ml 、0.40ml 、0.50ml 、0.60ml 、0.70ml 、0.80ml 、0.90ml 、1.00ml 标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml 再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 4.1.3样品的测定 稀释待测液于0.24mg/ml —0.73mg/ml,调pH 值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 4.1.4 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml —0.73mg/ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 0.20.30.40.50.60.70.80.9 1.0 1.1 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 吸光度加入标液体积(ml) B 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH=6.00 4.1.5样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的
酱油中氨基酸态氮含量的测定
酱油中氨基酸态氮含量的测定 摘要：本次实验用甲醛值法来测定酱油中氨基酸态氮的含量，甲醛值法滴定的终点容易判断。 关键词：酱油氨基酸态氮空白实验 前言：酱油是中国传统的调味品。主要由大豆、小麦、食盐经过制油、发酵等程序酿制而成的，色泽红褐色，有独特酱香，滋味鲜美。酱油的鲜味和营养价值取决于氨基酸态氮含量的高低，一般来说氨基酸态氮越高，酱油的等级就越高，也就是说品质越好。按照我国酿造酱油的标准，配制酱油每100ml中氨基酸态氮含量应≥0.4g 实验目的：1.掌握氨基酸态氮的测定原理2.了解酸碱滴定法在食品分析中的应用和学会判断有色溶液终点确定的方法 实验原理：氨基酸有氨基及羧基两种基团，具有酸碱两性，他们相互作用形成中性的内盐。加入甲醛溶液，氨基与甲醛作用，碱性消失，使羧基的酸性显现出来，用氢氧化钠标准溶液进行中和滴定，根据滴定用的氢氧化钠标准溶液的体积可计算出氨基酸态氮的含量。甲醛与氨基酸的反应如下： 实验仪器和药品：酸度计，电磁搅拌器，100ml容量瓶，5ml、20ml移液管，10ml 酸式滴定管，100ml量筒，100ml烧杯，250ml烧杯，NaOH固体（A.R.），邻苯二甲酸氢钾（A.R.），酚酞指示剂，分析天平，洗耳球，500ml橡胶或软木塞细口试剂瓶，250ml
锥形瓶（3个），50ml碱式滴定管，铁架台，酒精灯，石棉网，滴定管，温度计，玻璃棒，甲醛溶液w=36%，标准缓冲溶液（pH=6.86和pH=9.18），酱油，蒸馏水 1.0.05mol/LNaOH溶液的粗配：用天平迅速称量约0.6g固体NaOH放到烧杯中，用适量的新制的蒸馏水溶解稀释至300ml，盛于带橡胶塞或软木塞的试剂瓶中。 2.NaOH溶液的标定：用直接称量法准确称取邻苯二甲酸氢钾1.0～1.1g（称准至0.1mg）于洁净的250ml烧杯中，加入20～30ml蒸馏水，温热使之溶解，冷却至室温，定量转移定容于100ml容量瓶中，用移液管移取20ml于250ml锥形瓶中，加酚酞指示剂2滴，用NaOH溶液滴定至溶液呈现粉红色，30s内不褪色为终点，平行滴定3次。 酸度计的准备：酸度计先开机预热30分钟，将开关拨至PH位置，按“温度”键，调到室温，30分钟后，将电极插入PH=6.86的缓冲溶液中，调“定位”，用蒸馏水清洗并用纸吸干，再将电极插入PH=9.18的溶液中，调“斜率”，用蒸馏水清洗并吸干实验操作步骤：1. 准确吸取酱油5.0ml置于100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀后吸取20.0ml置于100ml烧杯中，加水60ml，插入酸度计，开动磁力搅拌器，用配好的NaOH标准溶液滴定酸度计指示pH=8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积V（ml）2. 向上述溶液中准确加入甲醛溶液10.0ml，摇匀，继续用NaOH标准溶液滴定至pH=9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml），供计算氨基酸态氮含量用。3. 试剂空白试验：取蒸馏水80ml置于另一200ml洁净烧杯中，先用的氢氧化钠标准溶液滴定至pH=8.2，再加入10.0ml甲醛溶液，继续用NaOH标准溶液滴定酸度计指示pH=9.2，第二次所用的氢氧化钠标准溶液的体积V0为测定氨基酸态氮的试剂空白试验。 结果与计算： (V-V0)C×0.014×V2 X= ×100 1000×V3×V1 V——测定用的样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml； V1——样品稀释液取用量，ml
氨基酸测定
食物中氨基酸的测定方法 测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。 一、氨基酸自动分析仪法 1.原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。 2.适用范围 GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。 本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定 3.仪器和设备 3.1真空泵 3.2恒温干燥箱 3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。用去离子水冲洗干净并烘干。 3.4真空干燥器（温度可调节） 3.5氨基酸自动分析仪。 4.试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 4.1浓盐酸：优级纯 4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。 4.3苯酚：需重蒸馏。 4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L 4.5缓冲液： 4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2 4.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。 4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 4.6茚三酮溶液 4.6.1 pH 5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。 4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml
电位滴定法测定酱油中氨基酸态氮的含量
实验九 电位滴定法测定酱油中氨基酸态氮的含量 一、实验原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极（或复合电极）插入被测液中构成电池，用碱液滴定，根据酸度计指示的pH 值判断和控制滴定终点。 二、仪器与试剂 1、仪器 电位滴定仪 磁力搅拌器 烧杯（250mL ） 微量滴定管 2、试剂 pH=6.18标准缓冲溶液；20%中性甲醛溶液；0.05mol/L 左右的NaOH 标准溶液 三、实验操作方法 （1）样品处理 先根据实验四测出待测酱油的比重，然后吸取酱油10.00mL 于100mL 容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL 于250mL 烧杯中,加水60mL ，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。用pH6.18的标准缓冲液校正好仪器，然后将电极清洗干净，再插入到上述酱油液中，用NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2,记下消耗的NaOH 溶液体积。 （2）氨基酸的滴定 在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00 mL 的中性甲醛溶液，再用NaOH 标准溶液滴定至pH9.2,记下消耗的NaOH 溶液体积V 1。 （3）空白滴定 吸取80mL 蒸馏水于250mL 的烧杯中，用NaOH 标准溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL 中性甲醛溶液，再用NaOH 标准溶液滴定至pH9.2,记下加入甲醛后消耗的NaOH 溶液体积V 2。 四、实验计算 式中： V 1——酱油稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH 标准溶液的100100 20V 014.0C V V %21?÷???-=酱油）（氨基酸态氮
氨基酸自动分析仪
氨基酸自动分析仪 1.实验目的 ①了解氨基酸自动分析仪的分析原理； ②掌握氨基酸自动分析仪的操作技巧。 2.实验原理 测定原理是利用样品各种氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同，在阳离子交换柱上将它们分离，采用不同pH值离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来，再逐个以另一流路的茚酮试剂混合，然后共同流至螺旋反应管中，于一定温度下（通常为115～120℃）进行显色反应，形成在570nm有最大吸收的蓝紫色产物。其中的羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色产物，其最大吸收在440nm。这些有色产物对570nm、440nm光的吸收强度与洗脱出来的各氨基酸的浓度（或含量）之间的关系符合比耳定律，可与标准氨基酸比较作定性和定量测定。 3.实验仪器与耗材 实验仪器： 耗材： 4．实验步骤 ①样品处理： 测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进行分析。 测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才上柱进行分析。 ②样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵 敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1μmol 左右（水解样品干重为0.3mg 左右）。测定必须在pH5～5.5、100℃下进行，反应进行时间为10～15min，生成的紫色物质在570nm 波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm 波长下进行比色测定。做一个氨基酸全分析
一般只需1h 左右，同时可将几十个样品一起装入仪器，自动按序分析，最后自动计算给出精确的数据。仪器精确度在±1～3%。用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所的如下图 自动分析仪氨基酸分离图谱 5.结果计算 带有数据处理机的仪器，各种氨基酸的定量结果能自动打印出来，否则，可用尺子测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面积进而计算出氨基酸的精确含量。另外，根据峰出现的时间可以确定氨基酸的种类。 6.说明 ①显色反应用的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低，故在较长时间测样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。 ②近年出现的采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪，可使蛋白质水解出的17 种氨基酸在12min 内完成分离，且具有灵敏度高（最小检出量可达1pmol）、重现性好以及一机多用等优点。
PITC法氨基酸的测定
氨基酸的测定（） 检验标准：□ GB/T 5009.124-2003 □其他 检验日期：年月日温度：℃湿度： % 仪器名称和编号：电子天平（编号：） 高效液相色谱仪（编号：） 氨基酸对照品溶液和供试品溶液的配制： 正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸 mg，加0.02mol/L盐酸溶液100ml溶解。（每1ml 相当于 1.0 mg） 对照品溶液：取氨基酸贮备溶液（含各种氨基酸μmol/ml，公司、批号） 0.6 ml，加色氨酸对照品溶液〔取色氨酸（中检所，批号）mg置50ml量瓶中，加0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀〕 0.2 ml，加正亮氨酸内标溶液加 0.1 ml，再加 0.1 ml0.02 mol/L盐酸溶液, 混匀，得对照品溶液。 供试品溶液：取本品，按下述方法试验：□方法1 □方法2。取样量（单位：□g□ml） □方法1：置顶空瓶中，加入6mol/L盐酸溶液 ml，抽真空或充氮气，封管，放入110℃烘箱中，水解24小时，冷却，打开封口，将水解液转移到 ml量瓶中，用水洗涤顶空瓶，合并洗涤液至量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用0.02 mol/L盐酸溶液溶解并定容至 ml。 □方法2：置 ml量瓶中，再加正亮氨酸内标溶液 ml，用0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。 溶液配制： （1）三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4ml，加乙腈（色谱纯）8.6ml，混匀（1mol/L三乙胺乙腈溶液）。 （2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25μl，加乙腈（色谱纯）2ml，混匀（0.1mmol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液）。 氨基酸对照品溶液和供试品溶液的衍生：
酱油中总酸与氨基酸态氮含量的快速测定
酱油中总酸与氨基酸态氮含量的快速测定 酱油中的氨基酸态氮是氨基酸含量的特征指标，含量越高酱油的鲜味越强，质量越好。国家标准GB18186-2000规定，高盐稀态发酵酱油（含固稀发酵酱油）的氨基酸态氮（以氮计）每100ml酱油中的含量：特级、一级、二级和三级分别应≧0.8g、0.7g、0.55g和0.4g。低盐固态发酵酱油中的含量：特级、一级和二级分别应≧0.8g、0.7g和0.6g。配制酱油（SB 10336-2000）每100ml中氨基酸态氮含量应≧0.4g。 在所有酱油的卫生指标中，总酸（以乳酸计）含量每100ml中应≦2.5g。 方法一： 取1.0ml样品到10 ml比色管中，加水到10.0ml刻度，盖塞后混匀，从中取1.0ml放入100ml 三角烧瓶中，加入60ml蒸馏水，加1号显色剂4滴，摇匀，用滴瓶直立式一滴一滴地滴加总酸和氨基酸态氮测定液，每滴1滴都要摇匀，待溶液初显粉红色（可做一个对照样品便于观察），按每滴测定液相当于0.45 %克的总酸计算其含量（如果测定液消耗了5.5滴还未初显粉红色，表示总酸超标，应送实验室精确定量），向溶液中加入10.0ml36%的甲醛溶液和2号显色剂4滴，摇匀后继续滴定至蓝紫色，按每滴测定液相当于0.078 %克的氨基酸态氮计算其含量，同时做试剂空白试验（即不加样品所消耗测定液的滴数），比如样品消耗了11滴测定液，试剂空白消耗了7滴测定液，样品实际消耗为4滴测定液，这份样品中氨基酸态氮的含量为4×0.078%=0.31%克，为不合格产品。本方法测定的结果与国家标准规定量或标签标示量仅一滴（测定液）之差时，应慎重处理，可送实验室精确定量。 方法二： 取1.0ml样品到10 ml比色管中，加水到10.0ml刻度，盖塞后混匀，从中取1.0ml放入200ml 烧杯中，加入60ml蒸馏水，将校准过的便携笔式酸度计(使用前应用水浸泡3分钟)插入杯中，
四种常见蛋中的氨基酸成分对比分析
四种常见蛋中的氨基酸成分对比分析 陈巧玲,郑艺梅，王兵丽，张泽宏 （闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000） 摘要：采用氨基酸自动分析仪检测样品，得出土鸡蛋、鸭蛋、皮蛋、洋鸡蛋均含有17种水解氨基酸。必须氨基酸与总氨基酸比值为鸭蛋%>洋鸡蛋%>土鸡蛋%>皮蛋%，必须氨基酸与非必须氨基酸的比值为鸭蛋>洋鸡蛋>土鸡蛋>皮蛋。根据FAO/WHO 提出的理想蛋白质条件，可知这四种蛋品均属于理想蛋白质范畴。氨基酸总含量分别为土鸡蛋%>鸭蛋%>洋鸡蛋%>皮蛋%。鸭蛋、皮蛋、土鸡蛋、洋鸡蛋的第一限制氨基酸分别为苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸、缬氨酸。因此根据分析结果，可以在日常饮食中根据食物的优缺点合理搭配饮食，实现营养最大化。 关键词：蛋；氨基酸；营养分析 Determination of amino acid in four kinds of eggs using amino acid analyzer CHEN Qiao-ling, ZHENG Yi-mei, Wang Bi-li, ZHANG Ze-hong (School of Biological Science And Biotechnology, MinNan Normal University，Zhangzhou 363000, Fujian China) Abstract:This paper finded out that 17 kinds of amino acid were content in the four kinds of eggs by using amino acid auto-analyzer. Essential amino acid /Total amino acid of this four kinds of eggs were duck eggs %>eggs %>farm eggs %>preserved % and the essential amino acid /nonessential amino acids of this four kinds of eggs were duck eggs >eggs >farm eggs >preserved eggs high quality?protein as their essential amino acid /Total amino acid and essential amino acid /nonessential amino acids numerical value close to the reference value of WHO/FAO model. The total content of amino acid were duck eggs % >eggs % >farm eggs % >preserved eggs %. The first limiting amino acids of duck eggs\ preserved eggs\ farm eggs\ eggs were threonine\ isoleucine\ methionine& cysteine\ valine.
氨基酸含量测定
茚三酮比色测定氨基酸含量 一、实验原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。 二、实验试剂 （1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2?H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。 （2）pH 8.04磷酸缓冲液： Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。 Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。 Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。 （3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。 三、实验方法及步骤 （1）标准曲线绘制 准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为
酱油中氨基酸态氮含量的测定
前言 中国的酱油在国际上享有极高的声誊。三千多年前，我们的祖先就会酿造酱油了。最早的酱油是用牛、羊、鹿和鱼虾肉等动物性蛋白质酿制的，后来才逐渐改用豆类和谷物的植物性蛋白质酿制酱油用豆、麦、麸皮酿造的液体调味品。色泽红褐色，有独特酱香，滋味鲜美，有助于促进食欲。是中国的传统调味品。酿造酱油又可分为生抽和老抽：生抽——以优质黄豆和面粉为原料，经发酵成熟后提取而成。“色泽淡雅，酯香、酱香浓郁，味道鲜美。老抽——是在生抽中加入焦糖，经过特别工艺制成的浓色酱油，适用于红烧肉、烧卤食品及烹调深色菜肴。色泽浓郁，具有醋香和酱香。此次试验主要测定普通酱油、生抽、老抽中氨基酸态氮的含量。氨基态氮是酱油的营养指标，是酿造酱油中大都蛋白水解率高低的特征性指标，是酱油的质量指标，是酱油中氨基酸含量的特征指标，含量越高酱油的鲜味越强，质量越好。配制酱油（SB 10336-2000）每100ml 中氨基酸态氮含量应≥0.4g 【本任务应掌握知识点及技能】 【实验目的】 ⒈学习及掌握电位滴定法测氨基酸态氮的基本原理及操作要点。 ⒉会电位滴定法的基本操作技能。 【实验原理】 氨基酸含有羧基和氨基，利用氨基酸的两性作用，加入甲醛固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后进行测量，以酸度计测定终点。此反应的化学方程式为： COOHRCHCNH OH NHCH RCH HCOH COOH NH RCH )()(22=+
O H OH NHCH RCH NaOH COOH OH NHCH RCH 222)()(+=+ PH=7.0是溶液中游离氢离子与氢氧化钠标准溶液完全反应后的PH 值，即有效酸度 PH=8.2是溶液中除有效酸度以外的物质与氢氧化钠标准溶液完全反应后的PH 值，即总酸 PH=9.2是溶液中氨基态氮中的羧基与氢氧化钠标准溶液完全反应后的PH 值 本实验用的是PH 为8.2和9.2数据。由于酱油还含有总酸度，即使不测定总酸度，也有将总酸中和。用PH=8.2时氢氧化钠消耗的体积与PH=9.2时氢氧化钠消耗的体积 的差计算出样品中氨基态氮含量。 【仪器和试剂】 1.仪器 酸度计PHS-3C 型、磁力搅拌器JB-1A 、碱式滴定管（50ml ）、容量瓶（250ml ） 2.试剂 0.04515mol/L 氢氧化钠标准溶液、（1+1）甲醛溶液 【实验步骤】 氢氧化钠溶液的配制：称取0.5014g 氢氧化钠试剂溶解，稀释后定容于250ml 容量瓶中。 氢氧化钠溶液的标定：称取邻苯二甲酸氢钾2.5530g ，溶解，稀释后定容于250ml 容量瓶中。首先用25ml 移液管移取氢氧化钠溶液放入锥形瓶中，加入三滴酚酞指示剂，用邻苯二甲酸氢钾溶液滴定氢氧化钠溶液，溶液由红变为无色为滴定终点，计录用去邻苯二甲酸氢钾的体积，重复三次。 准确吸取酱油5.0ml 置于100ml 容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0ml ，置于200ml 烧杯中，加水60ml ，插入酸度计复合电极，开动磁力搅拌器，用0.04515mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示PH=8.2，记录氢氧化钠标准溶液的体积（按总酸计算公式，可以算出酱油的总酸含量）。 向上述溶液中，准确加入（1+1）甲醛溶液20ml ，混匀。继续用0.04514mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至PH=9.2，计入用去氢氧化钠标准溶液的体积，供计算氨基酸态氮含量用。 试剂空白试验：取水80 ml ，先用0.04514mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至PH=8.2（记录用去氢氧化钠标准溶液的体积，此为测总酸的试剂空白试验）。再加入20ml 甲醛溶液，继续用0.04514mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示PH=9.2。第二次所用氢氧化钠标准溶液的体积为测定氨基酸态氮的试剂空白试验。 2.结果计算 ()100100 50141.03 21????-=V C V V ρ 式中 ρ—样品中氨基酸态氮的含量，g/100 ml; V 1—测定用的样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠 标准溶液的体积，
食物中氨基酸的测定方法
食物中氨基酸的测定方法 测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。 一、氨基酸自动分析仪法 1.原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。 2.适用范围 GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。 本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定 3.仪器和设备 3.1真空泵 3.2恒温干燥箱 3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。用去离子水冲洗干净并烘干。 3.4真空干燥器（温度可调节） 3.5氨基酸自动分析仪。 4.试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 4.1浓盐酸：优级纯 4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。 4.3苯酚：需重蒸馏。 4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L 4.5缓冲液： 4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2
4.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。 4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 4.6茚三酮溶液 4.6.1 pH 5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。 4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml加入4g 水合茚三酮（C9H4O3.H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6.2H2O）搅拌至完全溶解。 4.7高纯氮气：纯度99.99%。 4.8 冷冻剂：市售食盐与冰按1：3混合 5.操作步骤 5.1样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。 5.2称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品防于水解管中。 5.3水解：在水解管内加6mol/L盐酸10～15ml（视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。 打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50ml 容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1ml于5ml容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2ml水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mlpH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。 5.4测定：准确吸取0.200ml混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5ml，此标准稀释浓度为5.00nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标
《氨基酸测定》
《氨基酸测定》 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用氨基酸自动分析仪测定食物中氨基酸的方法。 本标准适用于食物中的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十六种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。 本标准不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的氨基酸测定。 2 原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 3 试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 3.1 浓盐酸：优级纯。 3.2 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。 3.3 苯酚：须重蒸馏。 3.4 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L。 3.5 缓冲液 3.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na 3C 6 H 5 O 7 ·2H 2 O)和 16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。 3.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。 3.5.3 pH 4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水 稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 3.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 3.6 茚三酮溶液 3.6.1 pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H 2 O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2。 3.6.2 茚三酮溶液：取150mL二甲基亚砜(C 2H 6 OS)和乙酸锂溶液 (3.6.1)50mL加入4g水合茚三酮(C 9H 4 O 3 ·H 2 O)和0.12g还原茚三酮(C 18 H 10 O 6 ·2H 2 O) 搅拌至完全溶解。 3.7 高纯氮气：纯度99.99%。 3.8 冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。 4 仪器和设备 4.1 真空泵。 4.2 恒温干燥箱。 4.3 水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。用去离子水冲洗干净并烘干。 4.4 真空干燥器(温度可调节)。 4.5 氨基酸自动分析仪。
氨基酸态氮的测定
氨基酸态氮的测定 1概述 2氨基酸态氮的测定 一、概述 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然源中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，而在构成的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。 随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。 二、氨基酸态氮的测定 （1）双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算 （2）电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算 1、双指示甲醛滴定法 （1）原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。 （2）方法特点及应用 此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。普氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;溶液中若有存在也可与甲醛反应，往往使结果高。 （3）试剂 ①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂， 用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 ②0.1%百里酚酞乙醇溶液 ③0.1%中性红50%乙醇溶液 ④0.1%mol/L氢氧化钠标准溶液 （4）操作步骤 1）含氨基酸溶液20-30mg→250ml锥形瓶中→中性红指示剂2-3滴，滴0.01mol/lNAOH 滴定终点（红→琥珀色） 2）含氨基酸溶液20-30mg→250ml锥形瓶中→百里红酚酞3滴/中性甲醛20ml→摇匀，滴0.01mol/lNAOH滴定终点（淡蓝色） 3）分别记录两次消耗碱液的用量 （5）结果计算
氨基酸检测
氨基酸检测 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，在食品、医药、 饲料添加剂、化妆品及工农业等诸多方面有着广泛 的应用。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为21 世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越 大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。 科标检测中心在氨基酸检测方面具有资深经验，为 广大客户提供专业、全面的检测服务，并出具权威的检测报告。 1、脂肪族氨基酸：丙、缬、亮、异亮、蛋、天冬、谷、赖、精、甘、丝、苏、半胱、天冬酰胺、谷氨酰胺 2、芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸 3、杂环族氨基酸：组氨酸、色氨酸 4、杂环亚氨基酸：脯氨酸 检测对象 豆类谷物、药材、鱼类、肉类、饲料、食用菌类、保健品、化妆品等等。 检测项目 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸、胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺。 相关标准 标准代号标准名称 GB/T14924.10-2008实验动物配合饲料氨基酸的测定 GB/T15399-1994饲料中含硫氨基酸测定方法--离子交换色谱法 GB/T15400-1994饲料中色氨酸测定方法--分光光度法 GB/T17419-1998含氨基酸叶面肥料 GB/T18246-2000饲料中氨基酸的测定 科标检测致力于推动检测行业的规范化、科学化发展，秉承“敢为人先、开拓创新、同心协力、勇承重载”
GB/T18654.11-2008 养殖鱼类种质检验第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定 GB/T23296.12-2009 食品接触材料高分子材料食品模拟物中11-氨基十一酸的测定高效液相色谱法 GB/T28722-2012氨基酸中铁和铅的测定原子吸收光谱法GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的测定 GB/T8314-2013茶游离氨基酸总量的测定 NY1429-2010含氨基酸水溶肥料 NY/T1618-2008鹿茸中氨基酸的测定氨基酸自动分析仪法NY39-1987饲料级L-赖氨酸盐酸盐 NY/T56-1987谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法 QB/T2409-1998化妆品中氨基酸含量的测定 QB/T4356-2012黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法 SN/T0930-2000 进出口花粉中全氨基酸的测定方法氨基酸自动分析仪法 YC/T282-2009烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法 YC/T448-2012 烟草及烟草制品游离氨基酸测定离子色谱-积分脉冲安培法 科标检测致力于推动检测行业的规范化、科学化发展，秉承“敢为人先、开拓创新、同心协力、勇承重载”
测定食品中的氨基酸态氮(实验报告)
酱油中氨基酸态氮的测定 姓名：*** 一、实验原理： 氨基酸态氮是酱油鲜味的重要来源,是决定酱油质量及营养价值的重要指 标。我国食品卫生标准规定不得低于0.4%。 氨基酸是同时具有氨基与羧基的两性化合物,它们会互相作用生成分子内盐,故不能用氢氧化钠标准溶液直接滴定,而采用加入甲醛,使氨基的碱性被掩蔽,羧基游离,显示出酸性,再以氢氧化钠标准溶液滴定,用酸度计判别终点。 二、实验仪器： 酸度计磁力搅拌器碱式滴定管 三、实验试剂： (1) 0.05mol/L NaOH标准溶液 (2) 36%甲醛溶液 四、实验步骤： PH计的准备 ①开机预热15分钟，调节至PH值钮； ②侧得室内温度18℃补偿值（6.86---6.88,、9.18---9.23），PH计温度补偿钮到测 定值20℃； ③检查PH电极用蒸馏水洗净插好； ④斜率开到最大（14）； ⑤用6.86缓冲溶液调节定位，用9.18缓冲溶液调节斜率，反复直至稳定。 中和游离酸: 准确吸取酱油5ml, 置于100ml容量瓶中,加入至刻度,混匀。准确吸取此稀释液20ml 于200ml烧杯中,加水60ml,插入酸度计的复合电极,并调整至适当高度,开动磁力搅拌器,用0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至PH=8.2,记录用去的氢氧化钠标准溶液的体积 ,作为 计算酱油的总酸。 氨基酸态氮的测定：向上述溶液中,准确加入甲醛溶液10ml,混匀,继续用0.05 mol/L氢氧
五、实验结果 计算公式：（V1-V2）×0.014×C X=──────────×100 V3×5／100 X----样品中氨基态氮的含量，g/100mL V1---测定用试样稀释液加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液体积，ml V2---试剂空白试验加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液体积，ml V3---试样稀释液取用量，ml C---NaOH标准滴定溶液的浓度，mol/L 0.014---与1.00mlNaOH标准滴定溶液相当的氮的质量，g 实验数据： 平行样1 平行样2 平行样3 空白加甲醛前消 耗的氢氧化 钠体积 3.71 3.75 3.85 0 加甲醛后消 耗氢氧化钠 总体积 12.50 12.53 12.81 1.21 加甲醛消耗 的氢氧化钠 体积 8.79 8.78 8.96 1.21 稀释液取用 量 20 X% 0.5306 0.5299 0.5425 平均值% 0.5343 平均偏差0.0543 相对平均偏差% 10.16 空白试验:取水80ml,先用0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至PH=8.2,记录用去的氢氧 化钠标准溶液的体积V0,此为总酸的试剂空白试验。再准确加入甲醛溶液10ml,继续用氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示PH=9.2,记录用去的氢氧化钠溶液的体积V2,此为测定氨基酸态氮的试剂空白试验。