DNA基因克隆及序列分析,英语翻译

热和酸应力条件下脂环酸芽孢杆菌Dnak基因克隆和序列分析

DNA基因克隆及序列分析。通过兼并PCR基因组扩增获得了大约1300bp的基因片段，然后子克隆到PMD-18T载体上测序。BLAST基因组数据库搜索表明，此PCR产物的序列共享原核热休克蛋白70 DNAK基因，与来自脂环酸芽孢杆菌LAA1伴侣蛋白的DNAK基因的同源性是最高的（92%）。通过基因组步移技术测定DNAK 基因（基因组数据库登录号HQ893543），包含1854bp完整的开放阅读对话框（ORF），编码617个氨基酸。推知的氨基酸序列与来自A. acidocaldarius LAA1 (86%)的DNAK基因表达的伴侣蛋白的相似性最高，与来自Bacillus tusciae,Paenibacillus sp.Y412MC10,Thermosinus carboxydivorans, Brevibacillus brevis 的 A. acidocaldarius 的相似性分别为83%, 77%, 76%,75%。没有检测到信号肽。预测分子量是(Mw)是66.2KDa，等电点（pI）是4.82.

氨基酸序列比对和主题搜索结果显示，在这个基因中有3个域：N末端核苷酸结合域(NBD, aa 1–360)类似于肌动蛋白ATP酶结构域，它包括三个保存位点(-I-D-L-G-T-T-N-S-, -V-F-D-L-G-G-G-T-F-D-V-S-I-L-,和V-I-L-V-G-G-S-T-R-I-P-A-V-Q-E) ，它可能与ATP绑定和激活有关；aa 360–517组成C-末端底物结合域(SBD);aa- 484–617组成的C-末端子域，它可能和底物的结合和释放有关。

脂环酸芽孢杆菌在不同的培养温度下DNAK基因的表达。脂环酸芽孢杆菌生长的温度范围从20°C - 60°C，最适生长温度为45-50°C。在这项研究中，脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T在45°C中活跃培养16小时，分别在20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C和60°C繁殖生长。根据观察脂环酸芽孢杆菌在温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C和55°C正常生长。在55°C和30°C生长时，分别繁殖8小时和10小时时达到对数生长期。然而，在培养温度为20°C，25°C或者60°C时，芽孢生长及其缓慢，与其他处理组像比较很难进入指数生长期。值的注意的是，在繁殖温度为20°C，25°C和60°C 时没法收集到足够的细菌ＲＮＡ用于分离和表达分析。

如图２所示，ＤｎａＫ在培养温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C 和55°C的基本表达情况。在脂环酸芽孢杆菌最适生长温度(40–55°C),其表达水平相对稳定。在较低的温度下，30°C和35°C,Ｄｎａｋ的表达大幅升高。这表明Ｄｎａｋ可能参与脂环酸芽孢杆菌对不良环境的适应。

在热应力条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK的表达。在实验中，热应力加在45°C 繁殖生长到指数生长期摇瓶菌悬液内的细菌上，然后置于温度分别为70°C, 80°C, 90°C的恒温浴内。在80°C和 90°C时，开始10分钟内，细菌正常生长，15分钟后细胞开始破裂。随着热应力的继续，有明显的细胞裂解和细胞凋亡的进一步加剧。在80°C,和90°C时仅仅热应力持续5分钟和10分钟，提取的RNA适合做进一步分析，热冲击15分钟或更长时间，提取的RNA严重退化，不能用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。当孵育温度70°C热冲击，所有的时间范围内细菌维持正常生长，全部的RNA被分离用于ＲＴ－ＰＣＲ检测。

正如图３所示，以70°C的热冲击温度，与对照在不孵育的脂环酸芽孢杆菌相比，ＤＮＡＫ的表达水平在孵育５分钟增加了４０％，长时间的热冲击，表达水平下降，与对照的相比２５分钟孵育的细菌ＤＮＡＫ表达水平提高了３０％，当热休克在80°C和90°C时，与对照相比，在5分钟内细菌的DNAK表

达水平高速增加70%和15%。有人指出，随着热冲击温度的上升，DNAK表达水平上升，这显示了脂环酸芽孢杆菌对耐热性可能与DNAK有关。

酸性条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK基因的表达。正如图所示，在酸胁迫条件下，Dnak的表达水平在1小时内迅速增加，直到5小时大幅下降。DnaK的表达水平高于开始在酸胁迫条件下（对照组），在半小时和一小时内表达为对照组的2.5倍和3.3倍。随着酸胁迫的继续，Dnak的表达水平在2小时内下降到40%，在3小时时为对照组最小量的8%，这表明，Dnak基因可能调节脂环酸芽孢杆菌的的耐酸性。

讨论

Hsp70是已知的进化上最保守的蛋白质。包括Dnak，Hsc66， Hsc62。热休克蛋白70家族被发现在原核生物体内,Dnak被广泛的分析。作为一个组成型的伴侣蛋白，可以上调热休克在高温条件下，他对蛋白质的折叠和细胞存活，生长至关重要。像其热休克蛋白70家族中的蛋白质，Dnak包含两个域：弱ATP酶活性N-末端域，底物结合域，可以结合肽和其他热休克蛋白调节ATP酶活性。Dnak 响应温度能力涉及的合作伴侣蛋白为GrpE，在热休克温度下，它经过可逆的结构性变化，改变Dnak成为高亲和力状态。虽然在几个物种中Dnak已经被测序，但在其表达水平和耐热性的关系上还没有在所有这些全部细节中直接测试。蛋白质组学分析显示，在酸应激反应方面，Dnak是Lactobacillus casei Zhang.细菌中几个蛋白之一，这些蛋白质的mRNA和蛋白质的表达水平都大幅攀升。另外Singh et al.使用基因中断技术的研究表明在Staphylococcus aureus的Dnak 对压力的耐受性也发挥着重要作用。在自然条件下，脂环酸芽孢杆菌被发现在土壤和热酸性环境中如温泉，引起水果和果汁行业微生物学家的关注，主要是因为他能引起果汁腐败和巴氏杀菌。有个合理的推想是脂环酸芽孢杆菌生长在不好的环境如巴氏杀菌的环境中时，热休克蛋白发挥着关键作用。不过，据我们所知，以前还没有直接评论这方面研究的论文。我们通过基因组步移技术首次克隆脂环酸芽孢杆菌Dnak基因，然后在高温和酸性条件下应用定量RT-PCR技术来衡量Dnak基因的表达水平。结果表明，当脂环酸芽孢杆菌的培养温度低于最适生长温度时，Dnak的表达水平大幅增加，这表明Dnak对细菌在持续应力条件下生存起作用。当用能引起热冲击的条件对待细菌时，Dnak的表达水平快速增加并在5分钟内达到最高。（比对照组高0.4倍）一定程度的上调被认为与热冲击温度正相关。当用pH=0.1的酸处理细菌时，Dnak的表达水平也提高很快，在30分钟内达到对照组的2.5倍以上。我们的研究结果显示Dnak在调控脂环酸芽孢杆菌耐热耐酸性中的作用和其他细菌中的报告相同。Dnak上调的时间和模式强烈表明Dnak在生物体生活在如巴氏杀菌操作过程的突然或持续应力条件中发挥着作用。

应当指出的是Dnak的表达水平在应力条件下也经历着波动，譬如持续的应力条件，特别是酸性条件下。已知的是Dnak与其他热休克蛋白和肽相互影响。这表明对于脂环酸芽孢杆菌在应力条件下的反应涉及一个更为复杂的网络，其中Dnak起着关键作用。然而，脂环酸芽孢杆菌耐热和酸性的机理仍然不清楚，需要进一步研究。

在应力条件下，Dnak的表达水平说明不规则的变化引起应力的继续，特别是在酸性条件下。我们都知道德是Dnak和其他热休克蛋白和肽相互作用，这意味着有Dnak的调控。这是一个更复杂的机制参与脂环酸芽孢杆菌对应力条件下的作用。

致谢：这项工作是由中国教育部博士基金的部分资助。