生物化学(18.16)--作业常用分子生物学技术及应用(附答案)

第二十一章 常用分子生物学技术原理及应用

名词解释

印迹技术

Southern blotting

PCR

蛋白质芯片

基因剔除

基因治疗(gene therapy)

基因诊断(gene diagnosis)

DNA指纹(DNA finger printing)

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)

自杀基因(suicide gene)

探针(probe)

间接体内疗法(ex vivo)

包装细胞(packaging cell)

问答题

1. 基因诊断技术有哪些特点?

2. 基因治疗的基本程序是什么?

3. 简述基因诊断的基本途径、技术和方法。

4. 简述肿瘤基因治疗常用的方案有哪些?

5. 试述PCR技术的基本原理和主要用途

6. 基因组DNA文库和cDNA文库的含义和用途。

7. 什么是生物芯片技术?生物芯片技术与传统生物技术相比有哪些优势?

8. 何谓酵母双杂交系统?酵母双杂交技术的用途?

9. 说明遗传修饰动物模型的种类和在医学方面的主要用途。

10. 试述对遗传病开展基因治疗应该考虑的因素及可能面临的问题。

11. 目前基因治疗的方法包括那些？

12. 试比较基因治疗中各种主要病毒载体的优缺点。

13. 用于基因诊断的核酸分子杂交的方法有哪些?各自的原理为何?

参考答案：

名词解释

印迹技术

[答案]印迹技术是指将在凝胶中分离的生物大分子转移(印迹)或直接将其放在固定化介质上并加以检测分析的技术。

Southern blotting

[答案]即DNA印迹技术。从组织或细胞中提取的基因组DNA经限制性核酸内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳分离、变性后，转移到NC膜上，然后与标记的探针进行杂交反应。主要用于基因组DNA的定性和定量分析。

PCR

[答案]即聚合酶链反应。基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5，末端和3’末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸，直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

蛋白质芯片

[答案]蛋白质芯片(protein chip)是将一组蛋白质分子作为探针，高度密集排列点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白质样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。其基本原理是蛋白质分子间的亲和反应。

基因剔除

[答案]有目的地去除动物体内某种基因的技术称为基因剔除或基因靶向灭活，其基本原理是建立在同源重组技术上，其基本方式是将灭活的基因放人胚胎干细胞。

基因治疗(gene therapy)

[答案]从广义上讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

基因诊断(gene diagnosis)

[答案]利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

DNA指纹(DNA finger printing)

[答案]1985年，英国学者发现人类基因组中存在高度可变的小卫星区域。在同一酶降解物的Southern印迹图上，同一个体的不同组织来源的DNA的谱带完全一致；而不同个体之间(除非同卵双生)谱带都不相同，如同人的指纹一样高度个体特异性。因此，这种Southern 印迹图称为指纹或基因指纹。

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)

[答案]在人类基因组中不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上， 酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。

自杀基因(suicide gene)

[答案]某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体在人体细胞 转变为细胞毒性产物，从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死，故称这类基因为“自杀基因”。

探针(probe)

[答案]具有检测标记的已知序列的核酸片段。

间接体内疗法(ex vivo)

[答案]在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输入病人体内，使

带有外源基因的细胞在体内表达相应产物以达到治疗的目的。

包装细胞(packaging cell)

[答案]是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒(辅助病毒)导人哺乳动物细 胞制备成的一种特殊的细胞系。这种细胞因携带有逆转录病毒基因组而能够产生大量的病毒包装蛋白；而辅助病毒缺乏包装信号(中序列)而不能包装，不产生病毒颗粒。

简答题

基因诊断技术有哪些特点?

[答案](1)以基因作为检查材料和探察目标，属于病因诊断，针对性强。

(2)分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有高特异性。

(3)由于分子杂交和聚合酶链反应技术都具有放大效应，诊断灵敏度高。

(4)适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源性基因也可为外源性基因。

基因治疗的基本程序是什么?

[答案]治疗性基因的选择一基因载体的选择一靶细胞的选择一基因转移(病毒介导的基因转移与非病毒介导的基因转移)一外源基因表达的筛选一外源基因回输体内。

简述基因诊断的基本途径、技术和方法。

[答案]基因诊断的基本途径：根据临床诊断的初步结论进行基因诊断，可以进行：①直接探测基因结构是否存在突变；②检测基因转录产物mRNA是否表达异常。基因诊断的技术和方法：DNA探针技术；PCR技术；DNA探针技术与PCR技术结合的技术。

简述肿瘤基因治疗常用的方案有哪些?

[答案](1)细胞因子的转基因治疗，主要有干扰素类、白介素类、刺激因子类、肿瘤坏死因子及转化生长因子。

(2)MHC抗原基因的转基因疗法：肿瘤细胞逃避机体免疫系统的机制之一是其不表达MHC—I类抗原而不能被免疫系统所识别。因而将MHC—1分子基因导人缺乏MHC—I抗原表达的肿瘤细胞中可诱导肿瘤特异性的细胞毒作用来杀灭肿瘤。

(3)抗癌基因的导人治疗：用替代功能添加的方法将含有抗癌基因的DNA片段导人缺失这些基因的肿瘤细胞中，恢复其抗癌作用从而治疗肿瘤。

(4)抑制癌基因的表达：癌基因的激活与许多恶性肿瘤的发生发展密切相关，采用反义核酸技术在癌基因表达时与其mRNA特异性结合，阻断癌基因的表达。

(5)前药转换基因或自杀基因疗法：将某种前药转换酶基因导人肿瘤细胞，再给病人使用这种对细胞无毒的前药，在肿瘤细胞的局部，通过前药转换酶的作用，使肿瘤局部的前药转换为高浓度的有毒药物而达到杀灭肿瘤细胞的效果。

(6)反义核酸疗法或RNAi疗法：应用反义基因或SiRNA片段在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断其异常信号的传导，使肿瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。

(7)共刺激分子疗法：由于共刺激分子如B7在肿瘤细胞激活杀伤性T细胞的过程中起重要作用，如在缺失该基因有肿瘤细胞是导人此基因并有效表达，即可有效激活杀伤性T细胞，产生肿瘤免疫反应。

(8)多药耐药基因疗法：将此基因导入骨髓细胞，可对抗由化疗引起的毒副作用，减少骨髓的受抑制程度，并可加大化疗剂量，提高化疗效果。

试述PCR技术的基本原理和主要用途

[答案]PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5，末端和3，末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复上述过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR技术可以用于目的基因的克隆，基因的体外突变，DNA和RNA的微量分析，DNA序列测定和基因突变分析等方面。在PCR技术基础上发展了一些特殊的PCR技术，扩大了PCR技术的应用范围，如将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用形成的RT-PCR，在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行PCR反应结合原位杂交的原位PCR技术等。实时PCR技术实现了PCR反应从定性到定量的飞跃。

基因组DNA文库和cDNA文库的含义和用途。

[答案]基因组DNA文库是指包含某——个生物细胞全部基因组DNA序列的克隆群体，它以DNA片段的形式储存着某一生物的全部基因组DNA(包括所有的编码区和非编码区)信息。cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而生成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式储存着该组织细胞的基因表达信息。从基因组DNA文库中可以筛选到含有所需要的基因的基因组序列的克隆；从cDNA文库中可以筛选到特定表达的mRNA的cDNA序列的克隆。获得的基因组序列和cDNA序列可以用于进一步的分析和改造。

什么是生物芯片技术?生物芯片技术与传统生物技术相比有哪些优势?

[答案]生物芯片技术是一种规模化的生物信息分析技术，包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片技术是将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，用于检测样品中具有相同或相似序列的核酸分子。蛋白质芯片技术是将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上，捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。与传统生物技术相比，生物芯片具有分析规模大(高通量)、自动化程度高、快速简便等优势。

何谓酵母双杂交系统?酵母双杂交技术的用途?

[答案]酵母双杂交系统是利用酵母转录激活因子的DNA结合区(UD)和促进转录的活性区(AD)而建立的。如果BD和AD分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。酵母双杂交技术可用于分析已知蛋白质之间的相互作用、筛选未知相互作用蛋白质、对蛋白质功能域的分析等。

说明遗传修饰动物模型的种类和在医学方面的主要用途。

[答案]遗传修饰动物模型主要包括基因转移和基因剔除两大类。主要应用的动物是小鼠。基因转移技术和基因剔除技术在探讨每一种基因的产物的正常功能方面具有重要的作用，同时对于医学的发展也具有重大的推动作用。这两项技术在医学中的最重要的用途是建立疾病的动物模型，这些动物模型可用于探讨疾病的发生机制，更为重要的是可以作为新的治疗方法和新药的筛选系统。

试述对遗传病开展基因治疗应该考虑的因素及可能面临的问题。

[答案](1)遗传病的基因治疗应考虑4个因素：①对该病有关基因应该详尽了解，能较易克隆该基因，并能在人细胞中稳定、高效表达；②要以单基因缺损为主；③只需产生较少原来缺陷基因表达产物就能矫正疾病；④导人基因过度表达，对机体无不良反应。

(2)面临的主要问题：①导人基因调控问题，基因表达在体内受严格调控，这要求导人基因在适当的调控条件下接受体内调控系统的统一领导，而目前还比较困难。②有些遗传病是由某些特殊细胞损伤引起的，而这些细胞不易取出在体外进行基因修饰，无法满足上述考虑的因素。如Parkinson病。③单基因遗传病的缺陷只局限于某一个发病的基因，其造成的临床结果往往累及多个脏器，而体外基因治疗的靶细胞在目前是几种有限的体细胞。④由于基因治疗目前主要的基因载体是病毒，将基因转移到受体细胞染色体基因组是随机的整合，因而也可能带来新的安全问题；进入受体细胞的基因是否高效、稳定等问题还需进一步研究。

目前基因治疗的方法包括那些？

[答案]基因治疗的方法包括：基因矫正和置换，即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因；基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常基因的产物，从而补偿缺陷基因的功能。再有一类为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或三链技术、干扰RNA的方法。除上述3大类外，近日发展其他多种形式，如导入某些病毒或细菌来源的所谓“自杀基因’’或经过改造的条件性复制病毒，只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。

试比较基因治疗中各种主要病毒载体的优缺点。

[答案]逆转录病毒载体：优点一一转染效率较高，可以稳定表达、持续时间长。缺点——只能转染分裂细胞，随机整合，有插入突变的危险。

腺病毒载体：优点——一宿主细胞范围广，可感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞；效价高；不整合染色体，较安全。缺点—一表达持续时间较短；可诱发机体免疫反应。

腺相关病毒载体：优点——宿主细胞范围广，感染分裂细胞和非分裂细胞；优先整合于人细胞染色体19q位点，表达持续时间较长而且较稳定。缺点——外源DNA容量较小，包装效率较低，操作相对较复杂。

用于基因诊断的核酸分子杂交的方法有哪些?各自的原理为何?

用于基因诊断的核酸分子杂交的方法主要有：(1)限制性内切酶酶谱分析一一利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时，会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多少)在电泳迁移率上也会随之改变，借此可做出分析诊断。(2)DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析——在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异(称为中性突变)，中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可用这一多态性片段作为一种“遗传标志”来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。(3)等位基因特异寡核苷酸探针(ASO)杂交法——遗传病的遗传基础是基因顺序中发生一种或多种突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针，一种是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸(M)，一种是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。若受检者DNA能与M杂交，而不