单链抗体及重组白介素-双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测.
单链抗体及重组白介素-2双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测
2010-10-22
目的利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,并探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法采用聚合酶链式反应(PCR)将人工合成的`抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤单链抗体(scFv)基因5′端,其3′与白介素-2(IL-2)基因连接构成分泌型单链双功能抗体scFv- IL-2基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(scFv- IL-2)SN 在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/scFv-IL-2,以PCR,RT-PCR以及Western blotting 对scFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定.在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件DNAssist和蛋白质分析软件ANTHEPROT V5分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果经酶切、PCR及Western blotting分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体
pL(scFv- IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26,scFv-IL-2融合蛋白通过DNAssist和ANTHEPROT V5软件分析获得了融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据.
作者：史梦远王海涛张芳琳 SHI Meng-yu WANG Hai-tao ZHANG Fang-
li 作者单位：第四军医大学基础部微生物教研室,陕西,西安,710032 刊名：新乡医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF XINXIANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)：2008 25(2) 分类号：Q782 关键词：单链抗
体生物信息学资源融合蛋白
单链抗体的构建及其在医学上的应用
#综述#单链抗体的构建及其在医学上的应用* 汪希雅综述,余平**审校 (中南大学湘雅医学院免疫学系,湖南长沙410078) =摘要>基因工程抗体在疾病诊断、治疗及医学研究等方面都有着广泛的应用。近几年来,国内外学者对抗体的研究已 迈入基因工程抗体阶段,其中单链抗体(single chain F v,scFv)因其具有分子质量小、穿透力强、体内循环半衰期短及排 除了Fc段所致的免疫复合物反应等优点,成为基因工程抗体探索领域中的研究热点。尤其是将scF v应用于医学的研 究已取得突破性进展,现就scF v的构建及其在医学上的应用综述如下。 =关键词>单链抗体;构建;应用;综述 =中图分类号>R392.11=文献标识码>A=文章编号>167325234(2009)1020790203 [J our nal of P a thogen B iology.2009Oct;4(10):790-792.] Construction of single2chain Fv antibody and its application in the medicine WANG Xi2ya,YU Ping(Dep ar tment of I mmunology,Xiangya Med ica l College,Centra l Souther n University, Cha ngsha410078,China) =Abstract>T he genetic engineer ing antibody is widely used in disease diagnosis,tr eat ment and medical resea rch.In re2 cent years,many scholars have taken in the genetic engineering antibody research.And because the single2cha in F v fr ag2 ment(ScFv)has small molecular weight,str ong penetr ating,short half2life in vivo circulation and avoided t he immunity compound response by F c section,it become to a research focus in the genetic engineering antibody.Especially,the medi2 cine applies research of ScF v have obtained br eakthr ough pr ogress.The r eview is given of ScF v constr uction and it s appli2 cation in t he medicine. =Key wor ds>Single2chain F v antibody(scF v);construction;applicat ion;r eview 在现代免疫学技术迅速发展的今天,抗体尤其是单链抗体技术所具有的优点,使其被广泛应用于医疗和生物技术领域[1,2]。抗体的发展大致可分为3个阶段。第一阶段:以1890年Behr ing和Kit asato发现白喉抗毒素为代表,其特点是利用抗原免疫动物来获取多克隆抗体;第二阶段:以1975年Kohler 和Milstein创建杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)为代表, McAb具有性质纯、效价高、特异性强、少或无血清交叉反应等特点,已被广泛应用于医学各个领域。由于人2人杂交瘤技术尚无重大突破,目前用于临床的多均为鼠源性的McAb,后者对人是异物抗原,可能引起人抗鼠抗体反应(H AM A)[3]。McAb是特异性很强的药物,严重局限了其在人体内的应用[4];第三阶段:以1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表。这是抗体研究领域出现的又一次技术革命,在此基础上研制出的基因工程抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少了无关结构,并赋予抗体分子以新的生物学活性,因而较天然抗体具有更广泛的应用前景。目前,单链抗体是基因工程抗体研究热点。 1单链抗体的结构与特点 1.1单链抗体的结构单链抗体(scF v)是一种新型重组蛋白,它属于基因工程抗体中的一种小分子抗体,仅为完整抗体的六分之一[5],相对分子质量约为27ku[6]。由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)经14~15个氨基酸的弹性短肽(Linker)首尾连接而成。由于传统的单克隆抗体存在某些缺陷,如鼠源性单克隆抗体与NK等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)较弱,且与人补体成分结合能力低,对靶细胞的杀伤能力较弱;鼠源性单克隆抗体在人血循环中的半衰期短,发挥的作用时间亦较短;单克隆抗体还难透过致密组织屏障,使其在靶组织的药物浓度常常低于有效浓度而难发挥作用等。相反,scFv具有分子质量小、穿透力强的特点,在疾病的临床诊断和治疗方面有着广泛的应用前景。 1.2scFv的特点scFv作为基因工程中抗体中的小分子抗体,有着如下的优点:1)scFv只含有抗体的V区且保持较完整的抗原结合位点;2)scF v缺乏F c段的特性,使之不与非靶细胞结合,且具低免疫原性,有利于作为药物的导向载体而应用于临床靶向治疗;3)scF v分子质量较小,容易穿透致密组织屏障而到达靶组织;4)scF v体内血循环半衰期短,易从血循环中排除[5];5)相对分子质量较小,scFv无需糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子,因而可在原核表达系统中广泛表达且易获得[7]。 但scFv也存在缺点:1)因其只能与抗原结合,故不能激活补体而介导相关的细胞免疫;2)scFv仅有一个抗原结合位点,其亲和力、稳定性较单克隆抗体要低,且筛选受到局限,高亲和力、高特异性scFv的筛选较困难;3)scF v结构中所使用的弹性 # 790 #中国病原生物学杂志 J our nal of P a thogen Biology 2009年10月第4卷第10期 October2009,Vol.4,N o.10 * ** =基金项目>湖南省大学生创新性实验计划资助项目(No. 081053373)。 =通讯作者>E2m ail:yu ping1953@https://www.360docs.net/doc/725075192.html, =作者简介>汪希雅(1988-),女(汉族),湖南长沙人,主要从事免疫学研究。E2m ail:wangxiya@https://www.360docs.net/doc/725075192.html,
抗核抗体谱检测的临床意义
抗核抗体谱检测的临床意义（1） 自身抗体：是指抗自身细胞内、细胞表面和细胞外抗原的免疫球蛋白。 抗细胞内抗原的抗体包括： 1、抗细胞核成分的抗体（抗核抗体）。 2、抗细胞浆内成分的抗体（抗中性粒细胞及其他细胞胞浆抗体、抗线粒体抗体、抗核糖体抗体等）。 3、抗细胞表面抗原的抗体。 抗细胞外抗原的抗体包括：类风湿因子、抗甲状腺球蛋白抗体等。 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）:又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体是一组对细胞核内的DNA，RNA，蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体。按其核内各个分子的性能不同可将各ANA区分开来，如(一)抗DNA抗体，（二）抗组蛋白抗体，（三）抗非组蛋白抗体，（四）抗核仁抗体等。每一大类又因不同抗原特性而再分为许多种类。因此ANA在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体，更确切的名称应为抗核抗体谱。ANA 主要存在于IgG，也见于IgM、IgA，甚至LgD及LgE中。 常见的核免疫荧光杭核抗体试验有以下几种图形：（1）均质型：核质染色均匀一致，这种染色型常与抗组蛋白和抗DNA抗体有关；（2）斑点型：核质染色呈斑点状，抗可提取性核抗原（ENA）抗体常呈这种染色型；（3）周边型：荧光染色围绕在核膜周围，它与抗DNA抗体有关；（4）核仁型：仅有核仁染色，具有抗4-6sRNA抗体呈现这种染色型；（5）着丝点型：在体外培养的细胞株（喉癌细胞）在核分裂相期时，可见到荧光染色的着丝点排列成特殊图型，而在鼠肝做底物中看不到此类图型，而被遗漏。 抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率，如系统性红斑狼疮（SLE，95%~100%）、类风湿性关节炎（RA，10%~20%）、混合性结缔组织病（MCTD，80%~100%）、干燥综合症（SjS,10%~40%）、全身性硬皮病（85%~90%）、狼疮性肝炎（95%~100%）、原发性胆汁性肝硬化（95%~100%）等，但经皮质激素治疗后，阳性率可降低。抗核抗体在类风湿病人中约有20％～50％IgG型ANA呈阳性，小儿类风湿ANA的阳性率约19％～35％，伴发虹膜睫状体炎者阳性率高（505~90%），故ANA 阳性预示类风湿有发生慢性睫状体炎的可能。已发现75％类风湿病人有多形核白细胞的特异性ANA或抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）可使白细胞核受到破坏。 ★抗核抗体谱（ANAs）
单链抗体药物项目计划书
XXXCEA单链抗体药物项目 商业计划书
目录 第一章执行摘要 (4) 1.1 公司简介 (4) 1.2 项目简介 (4) 1.3 市场容量 (4) 1.4 融资方案 (4) 1.5 经济效益 (4) 第二章市场分析 (5) 2.1 生物制药行业分析 (5) 2.1.1 行业现状 (5) 2.1.2 行业发展趋势 (7) 2.1.3 行业分析结论 (9) 2.2 结直肠癌市场分析 (9) 2.2.1 目标市场定位 (9) 2.2.2 目标市场容量分析 (9) 2.2.3 市场竞争分析 (10) 2.2.4 市场分析结论 (12) 第三章产品介绍 (13) 3.1 产品名称 (13) 3.2 产品功能 (13) 3.3 原理 (14) 3.4 产品特点与优势 (14) 3.5 生产工艺 (17) 3.6生产主要设备 (17) 第四章商业模式 (18) 4.1 运营模式 (18) 4.1.1 产业链分析 (18) 4.1.2 运营模式 (18) 4.1.3 盈利模式 (18) 第五章战略规划 (19) 5.1 竞争策略 (19) 5.2 战略目标 (19) 5.3 实施计划 (19) 第六章管理团队 (20) 第七章融资方案 (21)
7.1 资金使用计划 (21) 7.2 融资计划 (21) 7.3 退出机制 (21) 第八章财务预测 (22) 8.1 财务假设.......................................................................... 错误!未定义书签。 8.2 财务预测.......................................................................... 错误!未定义书签。 8.2.1 收入预测................................................................ 错误!未定义书签。 8.2.2 成本预测................................................................ 错误!未定义书签。 8.2.3 利润预测................................................................ 错误!未定义书签。 8.2.4 现金流量预测........................................................ 错误!未定义书签。 8.3 财务分析.......................................................................... 错误!未定义书签。第九章风险分析.. (23) 9.1 药品质量风险.................................................................. 错误!未定义书签。 9.2 核心技术泄露风险.......................................................... 错误!未定义书签。 9.3 执行力风险...................................................................... 错误!未定义书签。 9.3.1 风险描述................................................................ 错误!未定义书签。 9.3.2 规避措施................................................................ 错误!未定义书签。
自身抗体谱的临床意义
抗U1-rRNP抗体：高滴度的抗U1-rRNP抗体是混合性结绨组织病（MCTD，夏普综合征）的标志，阳性率95-100%，抗体滴度与疾病活动性相关。在30-40%的系统性红斑狼疮患者中也可检出抗U1-rRNP抗体，但几乎总伴有抗Sm抗体。 抗Sm抗体：系统性红斑狼疮的特异性抗体，与抗dsDNA抗体一起，是系统性红斑狼疮的诊断性指标，但阳性率仅为5-10%。 抗SS-A抗体：与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综合征（40-80%）、也见于系统性红斑狼疮（30-40%）和原发性胆汁性肝硬化（20%）中，偶见于慢性活动性肝炎。此外，在100%的新生儿红斑狼疮中抗SS-A抗体阳性。该抗体可经胎盘传给胎儿引起炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。 抗SS-B抗体：几乎仅见于干燥综合征（40-80%）和系统性红斑狼疮（10-20%）的女性患者中，男女比例为1：29。在干燥综合征中抗SS-A抗体和抗SS-B抗体常同时出现。 抗Scl-70抗体：见于25-75%的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法和疾病活动性而异（Scl=硬化症）。在局限型硬化症中不出现。 抗PM-Scl抗体：常见于多肌炎与硬化症的重叠综合征中，50%的该抗体阳性患者为肌炎与硬化症的重叠综合征，抗PM-Scl抗体也可见于单独的多肌炎患者中，阳性率为8%，在弥散型硬化症中的阳性率为2-5%。 抗Jo-1抗体：见于多肌炎，阳性率为25-35%。常与合并肺间质纤维化相关。 抗着丝点抗体：与局限型进行性系统性硬化症（CREST综合征：钙质沉着、Raynaud，s 病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70-90%。在原发性胆汁性肝硬化患者中也可检测到该抗体（阳性率10-30%）。还可出现于雷诺氏综合征中。 抗PCNA抗体：PCNA为增殖细胞核抗原，其表达与细胞周期有关。抗PCNA抗体为系统性红斑狼疮的特异性抗体，但阳性率仅为3%。有文献报道，抗PCNA抗体可能与系统性红斑狼疮患者发展为弥散性增殖性肾小球肾炎有关。 抗dsDNA抗体：对系统性红斑狼疮具有很高的特异性。除抗Sm抗体外，抗dsDNA抗体也可作为该病的一个血清学标志，阳性率为40-90%，并且抗dsDNA抗体滴度与疾病的活动度相关，可用于疗效监控。 抗核小体抗体： 在系统性红斑狼疮患者血清中的阳性率为50-95%，特异性几乎为100%。核小体是细胞染色体的功能亚单位，由DNA和组蛋白以特殊的方式组成。抗核小体抗体比抗dsDNA抗体、抗组
融合蛋白定义
融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录
融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋
单链抗体研究进展样本
抗体工程课程论文单链抗体研究进展 姓名： 学号： 指引教师： 时间：-上半年
单链抗体研究进展 姓名 摘要：单链抗体作为一种小分子基因工程抗体，在理论和应用方面研究引起了广泛关注，其在显像定位诊断、靶向治疗和参加细胞免疫等方面展示出了可观应用前景。本文对单链抗体构造及特点、制备技术及其应用研究进展等进行了综述，以期可觉得单链抗体进一步进一步研究和应用提供理论基本。 核心词：单链抗体；构造；制备技术；应用 Abstract:Micro-molecule antibody prepared by genetic engineering have attracted wide attentions. And it showed considerable application prospects in imaging localization and diagnosis，targeted therapy and cellular immunity. The structure，characteristics and preparation technology of single-chain antibody as well as its applications were reviewed，so as to provide theoretical foundation for further study on single-chain antibody and its applications. Key words：single-chain antibody ； structure ； preparation technology ；application 前言：机体在受到抗原物质刺激后，B 淋巴细胞或记忆B 细胞增殖分化形成浆细胞，产生免疫球蛋白能与抗原发生特异性结合，辨认并清除外来入侵物质。防御系统中抗体不可或缺，是维护机体生理平衡和稳定重要构成某些之一［ 1 ］，因而,人们对抗体制备、纯化技术进行了长期摸索。初期使用老式办法以天然抗原免疫实验动物，产生相应多克隆抗体。该办法获得抗体重要用于治疗某些感染性疾病，但因其存在均一性差、交叉反映多、易产生副作用等缺陷而限制了其大规模生产应用。1975 年以来，使用杂交瘤技术制备单克隆抗体与多克隆抗体相比，具备性质均一、特异性强、容易生产等长处，现已在科学研究、临床诊断与治疗等方面发挥着重要作用。但由于制备周期较长，操作难度高，抗体自身稳定性差,在人
单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析
单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析 生物制品中的聚体的来源，类型和大小不同，并且是由多种因素引起的。监管机构特别关注的是具有增强免疫应答从而引起不良临床反应的蛋白质聚体，或可能损害抗体或蛋白药物产品安全性和功效的聚体。在动物和临床研究中已经报道了蛋白质聚体可以增强免疫反应。尽管可以预期对人外源蛋白物质的免疫反应，但免疫系统可能会通过耐受性分解机制对具有内源性的聚集蛋白制品产生强烈反应。在耐受性破坏机制中，蛋白质聚体可在蛋白质复合物的形成中充当促进剂，这些蛋白质复合物可触发B细胞针对该蛋白质抗体的产生，而与T辅助细胞无关。这类反应的基础来自免疫原概念，其中抗原具有多于半抗原的聚合结构形式存在，在病毒样颗粒组织中间隔5-10nm，大小超过100kDa，可以克服免疫力。这种情况可能解释了内源性蛋白质的意外中和，并且产生了深远的临床效果。这种类型的机制最受关注的是高分子量（HMW）聚集体，这些聚体保留了其单体对应物的大多数天然构型，并且可以以这种方式使抗原成核。另外，显示非天然蛋白质构象的聚体可能被免疫系统视为新抗原，这可能会触发抗抗体形成。在这里我们提供了有关蛋白质药物中的聚体的表征，检测方法以及药物制造商已实施的各种控制措施的监管观点。 抗体或蛋白聚体的分类 聚体的分类是一项复杂的任务，目前还没有全面的分类方法。分类的困难在于可以对聚合进行多个类别的分组。下表1列出了生物制
药中最常见的聚体类别。为了有助于理解所讨论的聚体类型，常见的聚体类型有：二聚体，可逆聚体，共价聚体和颗粒，这些都是蛋白聚集中常见的形式。聚体的其他分类可以基于聚体的大小，因为这可能与潜在的不良临床反应直接相关。聚体的大小范围从可溶性二聚体和其他多聚体（表观球状直径约5-10nm），包括高分子量（HMW）聚集体到可溶或不溶的有核聚集体，到较大的不溶性物质（被识别为亚可见和可见）颗粒（表观球状直径约20–50μm）。在可溶性聚集体组中，较大的聚集体（例如HMW物）可能更能引发产生不良临床后果的免疫原性应答。就其分子量而言，大小大于10的二次方kDa的聚体潜在的不良免疫原性反应潜力，值得更仔细的评估。 聚体除大小外，聚体随时间的大小变化率是一个有用的参数，可以提供聚体的功能特征，其中时间对应蛋白质产品的有效期。聚体最初可以小二聚体或碎片的形式存在，并朝着更大的聚集结构变化，例如亚可见或可见颗粒（如果这种转变在热力学上温度变得快速）。在任何给定的时刻，蛋白质可能在有利于蛋白质单体或天然构型的热力学状态与有利于展开的天然蛋白质构型状态之间转变。在某些的条件下，未折叠的蛋白质可能与其他天然和非天然形式形成复合物，在获得足够的自由能以转变为可能成为新蛋白质实体而形成稳定状态的聚体。科学家Lumry和Eyring在1960年代研究了这些转变的基础，他们提出了溶液中蛋白质聚体的动力学转变，并在干扰素-γ聚集的情况下进一步转变为一级转变反应动力学。评估药品聚体总增长率的
单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断
单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断、治疗中的应用 文章来源：国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第1期发表时间：2004-08-10 13:25:00 关键字：单链抗体；表达；肿瘤诊断；肿瘤治疗 自从1975年K?hler和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术以来，单克隆抗体技术在临床诊断和基础研究中的应用越来越广泛，但在疾病治疗方面，还没有达到令人满意的效果，原因主要是应用的单克隆抗体绝大多数来自鼠类，而鼠抗体在人体内应用时容易产生人抗小鼠Ig抗体而降低疗效，而人源性抗体制备尚存在许多困难。 1988年以来，抗体基因工程的研究取得了一些技术上的进展。Huston等[1]和Bird 等利用基因工程技术成功制备了单链抗体（Single chain Fv, scFv或single chain antigen binding protein, SCA）,scFv是由免疫球蛋白的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片断，大小为完整抗体的六分之一，分子量约为27KD。它具有许多优点：①分子小，免疫原性低，用于人体不易产生抗异种蛋白反应；②容易进入实体瘤周围的微循环；③血循环和全身廓清快，半衰期短，肾脏蓄积很少；④无Fc段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，成像清晰；⑤易于基因操作和基因工程大量生产。此外单链抗体还可以与毒素、前体药物转化酶、放射性同位素、细胞因子等效应分子构建成多种双功能抗体分子，单链抗体也是构建双特异性抗体的理想元件，用于肿瘤的临床诊断和治疗显示出了巨大的潜力，目前国外的一些抗肿瘤单链抗体已进入体内试验阶段。 1 单链抗体的构建 基因工程单链抗体技术的基本原理是：首先从杂交瘤细胞、外周血淋巴细胞中提纯mRNA，再经RT-PCR分别扩增抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因，人工合成一条
抗核抗体介绍
抗核抗体介绍 抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率，如系统性红斑狼疮（SLE，95% ~100%）、类风湿性（RA，10%~20%）、混合性结缔组织病（MCTD，80%~100%）、干燥综合症（SjS,10%~40%）、全身性硬皮病（85%~90%）、狼疮性（95%~100%）、原发性胆汁性肝硬化（95%~100%）等，但经皮质激素治疗后，阳性率可降低。抗核抗体在类人中约有20％～50％IgG型ANA呈阳性，小儿类风湿ANA的阳性率约19％～35％，伴发虹膜睫状体炎者阳性率高（505~90%），故ANA阳性预示类风湿有发生慢性睫状体炎的可能。已发现75％类风湿病人有多形核白细胞的特异性ANA或抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）可使白细胞核受到破坏。 抗核抗体是一组对细胞核内的DNA，RNA，蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体。按其核内各个分子的性能不同可将各ANA区分开来，如(一)抗DNA抗体，（二）抗组蛋白抗体，（三）抗非组蛋白抗体，（四）抗核仁抗体等。每一大类又因不同抗原特性而再分为许多种类。因此ANA在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体，更确切的名称应为抗核抗体谱。ANA 主要存在于IgG，也见于IgM、IgA，甚至LgD及LgE中。 常见的核免疫荧光杭核抗体试验有以下几种图形：（1）均质型：核质染色均匀一致，这种染色型常与抗组蛋白和抗DNA抗体有关；（2）斑点型：核质染色呈斑点状，抗可提取性核抗原（ENA）抗体常呈这种染色型；（3）周边型：荧光染色围绕在核膜周围，它与抗DNA抗体有关；（4）核仁型：仅有核仁染色，具有抗4-6sRNA抗体呈现这种染色型；（5）着丝点型：在体外培养的细胞株（喉癌细胞）在核分裂相期时，可见到荧光染色的着丝点排列成特殊图型，而在鼠肝做底物中看不到此类图型，而被遗漏。 抗核抗体的分类，由于核抗原不同，有多种不同的ANA 。 抗DNA抗体 抗DNA抗体有抗双链DNA（ds DNA）和抗单链(ss DNA)抗体之分。抗ds DNA抗体与S LE的关系密切，且随疾病的活动度而升降，病情好转者其滴度多下降甚或转阴。抗ss DN
单克隆抗体药物
浅谈单克隆抗体药物 摘要：单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向，在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗手段不断升级过程中，单抗药物扮演着不可替代的角色，已经成为全球靶向治疗药物的主流。在刚刚兴起的细胞免疫治疗中，单抗药物同样是位列第一的品类，单抗产业是目前乃至未来医药行业中极具投资价值的细分行业。本文从单克隆抗体简介，常见的单克隆抗体药物、国内外单克隆抗体药物的研发现状，及对单抗药物的展望几个方面做一简介。 关键词：单克隆抗体单抗药物研发现状 1单克隆抗体 抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体，简称单抗。这些抗体具有相同的结构和特性。抗体与特异性表达的肿瘤细胞表面蛋白质结合，从而阻碍蛋白质的表达，起到抗肿瘤作用。抗体还可使B淋巴细胞产生免疫反应，诱导癌细胞凋亡。早期单抗为鼠源性单抗,易被人体免疫系统识别，应用受到限制。后来采用基因工程的方法生产人源或人鼠嵌合型单抗，广泛应用于临床。 2常见的单克隆抗体药物 2.1利妥昔单抗（Rituximab）-美罗华-CD20单抗 第一个被美国食品药物管理局（FDA）批准用于临床治疗的单抗，是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，能特异性地与CD20结合，导致B淋巴细胞溶解的免疫反应，抑制其增殖，诱导成熟B淋巴细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。90%以上的B淋巴细胞淋巴瘤细胞均有CD20表达，不表达于非定向干细胞或浆细胞。本药可使耐药淋巴瘤细胞对VP-16、顺铂重新敏感，用于CD20表达的复发或化疗耐药的惰性B淋巴细胞淋巴瘤，有效率46%。利妥昔单抗+CHOP 方案为治疗弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤标准方案，可使全完缓冲（CR）率、生存时间明显延长[2-3]。 2.2曲妥珠单抗-赫赛汀-HER-2单抗 为重组DNA人源化的抗p185蛋白（癌基因）单克隆抗体-IgG抗体。进入人体后能选择性地与由细胞核内表皮生长因子2基因调控的p185糖蛋白结合。本
抗核抗体的检测及医学意义
抗核抗体的检测及医学意义 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是一组将自身真核细胞的各种细胞核成分作为靶抗原的自身抗体的总称。 ANA的性质主要是IgG，也有IgM、IgA 和IgD，其无器官和种属特异性，故该类抗体可与所有动物的细胞核发生反应。迄今已有二十余种抗核内不同成分的抗核抗体被相继发现。ANA主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。 ANA在未治疗的SLE 患者中的滴度较高，在大多数自身免疫性疾病中均可呈阳性，如SLE、R A、混合性结缔组织病（M CTD ）、干燥综合征（SS）、硬皮病、慢性活动性肝炎，正常老年人也可有低滴度的ANA。ANA阳性并不一定患有自身免疫性疾病。 由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性不同，因此可产生多种类型的ANA，在其众多类型中，作为针对某一特定核成分的个别抗体，只在某一疾病中出现，成为诊断该疾病的血清标志性抗体。各种ANA在不同的自身免疫性疾病中出现不同组合，可形成各种疾病或疾病亚群的特征性抗体谱。因此，总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验，ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价都具有重要意义。 目前按细胞内分子理化特性与抗原分布部位将ANA分为四大类，即抗DNA抗体；抗组蛋白抗体；抗非组蛋白抗体和抗核仁抗体，每一大类又因不同的抗原特性再分为许多亚类。在临床检测中ANA的命名通常按以下三种方式进行： 1．根据抗原的化学名称命名如抗dsDNA、抗RNP、抗DNP抗体。 2．以第一位检出该抗体的患者命名如抗S m、抗Ro、抗La 抗体。 3．以相关疾病命名如抗SSA、抗SSB 抗体。 常见的AN A 荧光图形及临床意义
XXXCEA单链抗体药物项目计划书
XXXCEA单链抗体药物项目计划书 XXXCEA单链抗体药物项目商业计划书成都XXX生物分子技术有限责任公司目录 第一章执行摘要4 1、1 公司简介4 1、2 项目简介4 1、3 市场容量4 1、4 融资方案4 1、5 经济效益4第二章市场分析4 2、1 生物制药行业分析4 2、 1、1 行业现状4 2、 1、2 行业发展趋势4 2、 1、3 行业分析结论4 2、2 结直肠癌市场分析4 2、 2、1 目标市场定位4 2、 2、2 目标市场容量分析4
2、 2、3 市场竞争分析4 2、 2、4 市场分析结论4第三章产品介绍4 3、1 产品名称4 3、2 产品功能4 3、3 原理4 3、4 产品特点与优势4 3、5 生产工艺4 3、6生产主要设备4第四章商业模式4 4、1 运营模式4 4、 1、1 产业链分析4 4、 1、2 运营模式4 4、 1、3 盈利模式4第五章战略规划4 5、1 竞争策略4 5、2 战略目标4 5、3 实施计划4第六章管理团队4第七章融资方案4 7、1 资金使用计划4 7、2 融资计划4
7、3 退出机制4第八章财务预测4 8、1 财务假设错误！未定义书签。 8、2 财务预测错误！未定义书签。 8、 2、1 收入预测错误！未定义书签。 8、 2、2 成本预测错误！未定义书签。 8、 2、3 利润预测错误！未定义书签。 8、 2、4 现金流量预测错误！未定义书签。 8、3 财务分析错误！未定义书签。 第九章风险分析4 9、1 药品质量风险错误！未定义书签。 9、2 核心技术泄露风险错误！未定义书签。 9、3 执行力风险错误！未定义书签。 9、 3、1 风险描述错误！未定义书签。 9、 3、2 规避措施错误！未定义书签。 第一章执行摘要 1、1 公司简介
单链抗体及重组白介素-双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测.
单链抗体及重组白介素-2双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测 2010-10-22 目的利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,并探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法采用聚合酶链式反应(PCR)将人工合成的`抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤单链抗体(scFv)基因5′端,其3′与白介素-2(IL-2)基因连接构成分泌型单链双功能抗体scFv- IL-2基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(scFv- IL-2)SN 在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/scFv-IL-2,以PCR,RT-PCR以及Western blotting 对scFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定.在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件DNAssist和蛋白质分析软件ANTHEPROT V5分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果经酶切、PCR及Western blotting分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体 pL(scFv- IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26,scFv-IL-2融合蛋白通过DNAssist和ANTHEPROT V5软件分析获得了融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据. 作者：史梦远王海涛张芳琳 SHI Meng-yu WANG Hai-tao ZHANG Fang- li 作者单位：第四军医大学基础部微生物教研室,陕西,西安,710032 刊名：新乡医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF XINXIANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)：2008 25(2) 分类号：Q782 关键词：单链抗 体生物信息学资源融合蛋白
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(强克)说明书(完整版)
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白使用说明书 【药品名称】 通用名：注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白 商品名：强克 英文名：Recombinant Human TNF Receptor-Ig Fusion Protein for Injection 汉语拼音：Zhusheyong Chongzu Ren Erxing Zhongliuhuaisiyinzi Shouti －Kangti Ronghedanbai 【性状】 本品为无菌白色冻干粉针剂。 【主要成分】 每瓶含重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25毫克，甘露醇40毫克，蔗糖10毫克，三羟甲基氨基甲烷1.2毫克。用1毫升灭菌注射用水溶解。【药理毒理】 1.药理重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白是一个二聚体的融合蛋白，包含人75KDa肿瘤坏死因子受体（TNFR）（p75）的细胞膜外配体结合部分与人IgG1的Fc片段，包含934个氨基酸，表观分子量约为150K道尔顿（KDa）。 TNF是机体自然产生的一种细胞因子，参与正常的炎症和免疫反应。在强直性脊柱炎关节病变的炎症反应中，TNF起着重要的作用。TNF存在55KDa蛋白（p55）和75KDa蛋白（p75）两类受体，它们均以单体的形式存在于细胞表面。TNF的生物学活性取决于它与细胞表面两类受体分子的结合。 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的作用机制是竞争性地与TNF 结合，阻止TNF与细胞表面TNF受体的结合，抑制TNF的生物学活性。 2.毒理小鼠急性毒性试验结果显示，静脉注射1.09g/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见毒性反应。猴长期毒性试验结果显示，每周2次连续皮下注射180天15.0 mg/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见有明显的毒性。 【药代动力学】
注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白
注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白Ⅰ期临床试验 邵威 【摘要】：注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白是一种由人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)胞外区和人免疫球蛋白G1(IgG1)修饰的Fc片段(铰链区、CH2和CH3区)相连接的融合蛋白。它是一种选择性共刺激调节剂,它与抗原提呈细胞上的B7分子的亲和力大大高于T细胞表面的CD28,可以封闭抗原提呈细胞上的B7,阻断CD28与之结合,从而阻断共刺激通路,抑制T细胞(T淋巴细胞)激活。T淋巴细胞的激活与类风湿关节炎(RA)的病理进程相关。在RA患者的关节腔滑液中可以找到激活的T淋巴细胞。根据我国药品食品监督管理局(SFDA)通过的《药品注册管理办法》,注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白属于生物制品7类,即已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的生物制品。目的: 建立酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定人血浆中重组人CTLA4-Ig浓度的方法,进行单次给药后重组人CTLA4-Ig在健康人体内的耐受性和药代动力学研究,为指导临床制定安全、合理的用药方案提供理论依据,为新药审批和临床用药提供试验依据,并为Ⅱ期临床研究提供参考依据。方法:本研究分以下三部分: 第一部分建立灵敏度高、专一性强、准确性好、重复性强的EL ISA法测定人血浆中rhCTLA4-Ig的分析方法学。测定步骤:将鼠抗人CTLA4单抗用包被缓冲液按比例稀释,包被96孔酶标板,4℃孵育18小时;加包被缓冲液室温封闭2小时;用洗涤液洗板;加入不同稀释浓度的标准品和稀释好的待测样品;加样后立即加入稀释好的生物素标记的二抗。酶标板置于摇床中连续振摇,室温孵育2小时。加入按比例稀释好的HRP标记的链酶亲和素。酶标板置于摇床中连续振摇,室温孵育0.5小时。避光条件下加入HRP显色液,室温反应15分钟。加终止液,终止反应后0.5小时内酶标仪读取450 nm的吸光度(A)值,记录结果。每份样品重复测定,各药盒都设置标准校正曲线,用以计算未知样品浓度。第二部分考察单次静脉滴注rhCTLA4-Ig(1～20 mg·kg-1)在健康受试者体内的耐受性。随机选取27名健康志愿者,年龄、体重、身高均符合试验要求,常规体检、心电图检查,实验室检查包括血、尿常规,肝、肾功能等各项生化检查均无异常,无其它系统性疾病及药物过敏史。3个月内未参加过临床试验,试验前两周内及试验期间未服用其他任何药物。试验中随时观察受试者症状、体征以及各种不良反应,并定期进行实验室检查(血尿常规、肝肾功能、血液生化及血沉等)。综合评价rhCTLA4-Ig在健康人体内的耐受性,整个试验期间配备有经验的医师和护士监护。所有计量资料均采用Excel或SPSS软件进行计算,以?X±SD表示,并进行t检验或方差分析。第三部分研究单次静脉滴注rhCTLA 4-Ig(1～20 mg·kg-1)在健康受试者体内的药代动力学特征。27名健康受试者随机平行分为低、中、高3个单次给药剂量组。按实验设计要求,27名受试者于试验当日晨按分组分别静脉滴注重组人CTLA4-抗体融合蛋白1 mg·kg-1、10 mg·kg -1、20 mg·kg-1,输液在(60±5)分钟内完成,而后按设计的采血时间点采血。分别于静脉滴注前、滴注开始第30分钟,滴注结束后0、2、4、12、24小时、2、3、4、7、14、28、42、56、70和84天各取血2 ml,置于15 % EDTA抗凝的试管内, 3600 r·min-1离心分离血清至另一无菌试管中,-80℃保存,待测。本试验采用ELISA法测定血浆中rhCTLA4-Ig的浓度。采用DAS2.1软件计算主要药代动力学参数,Tmax、Cmax采用实测值,AUC用公式计算。所有的数据均用几何均数±标准差(?X±SD)表示,采用单因素ANOVA和Student’s t test进行统计学分析。结果: 1. 27名健康受试者,均完成试验。单次给药耐受性试验观察至84 d。试验期间,全部试验的27名受试者应用不同剂量药物后均未有明显的不良反应发生;呼吸、心率、血压、脉搏、体温等生命体征未见异常;心电图正常。注射药物局部未发现皮肤红肿、瘀斑或皮疹等刺激性反应,试验观察期间未出现不适反应和异常体征。2.单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1、10和20 mg·kg-1后观察至84 d。试验过程中共进行七次血液生化指标检查。27名健康受试者用药前后血沉检查未发现异常改变,经t检验,各指标试验前后比较均无显著差异。试验前后进行尿常规指标检测,所有健康受试者尿常规指标无异常改变。3.本试验采用ELISA法测定健康志愿者血浆中rhCTLA4-Ig浓度,最低检测限为0.4 ng·mL-1,线性范围为1.95～500 ng·mL-1。本药在此线性范围内重现性好,CV %均小于10 %,准确度在-5.3～-1.1 %之间;不同药盒的批间精密度CV %也均小于10 %,准确度在0.6～6.2 %之间。4.单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1、10和20 mg·kg-1后的药代动力学参数:T1/2ke分别为(15.13±2.62),(14.21±2.35) 和(11.77±1.24)d;MRT分别为(19.913±2.086)、(19.630±1.832)和(18.795±0.832)d;AUC(0-84d)分别为(170.64±27.75)、(1490. 26±231.23)和(2977.25±362.31)μg·d·mL-1;Tmax均为0.0416 d;Cmax分别为(18.39±1.57)(,186.91±24.70)和(416.84±34.40)μg·mL-1。结论: 1. ELISA的分析方法具有灵敏度较高,准确性好,专一性较强,操作简便快捷、可重复性强的特点。高、中、低三种浓度样品-80℃冻存一个月后,CTLA4-Ig稳定性良好,与未经冻存的样本相比,统计学无显著性差异。适用于人体血浆中rhCTLA4-Ig的定量分析。2.试验表明健康受试者单次静脉滴注国产rhCTLA4-Ig在1～20 mg·kg-1剂量范围内是安