大熊猫健康和寄生虫检测大熊猫肠道微生物宏基因组代谢组及蛋白
大熊猫健康和寄生虫检测（大熊猫肠道微生物宏基因组、代谢组及蛋白组研究）
技术参数
一、60个大熊猫粪便样品宏基因组测序
二、16个大熊猫粪便样品宏蛋白组测定
三、170个大熊猫粪便、血清样品、竹子样品代谢组学测定
宏基因组学的研究进展
宏基因组学的研究状况及其发展 摘要：宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛 选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足，是研究未培养微生物、寻找新功能基因和开发获得新资源的重要新途径。目前宏基因组学已广泛应用于各个领域，并在医药、农业、能源开发、环境修复、生物技术、生物防御等方面有了较深入的研究。 关键词：宏基因组学、宏基因组、基因组文库构建、文库筛选、未培养微生物、研究进展 随着微生物学的发展，微生物基因组全序列测定计划正在全球被快速地推行，但现有技术条件下，自然界存在的可培养微生物不到总数的1％，阻碍了该计划 的发展，使得绝大多数的微生物资源不能被开发和利用。21世纪初，随着测序能力的提高和基因组学的发展，科学家提出了一种研究不可培养微生物基因组的新思路——直接对含有各种不可培养的微生物的群体进行基因组序列的测定。这类研究称为Metagenomics，前缀“Meta”源于希腊语。意思是“超越”。科学家选择它来表示这种基因组研究超越了传统意义上分析单一物种的基因组学，将研究对象定为由种类众多的微生物组成的整个菌落。国内的研究者也据此将该术语翻译为“宏基因组学”。 1 宏基因组的概念 宏基因组 (也称微生物环境基因组、宏基因组学、元基因组学、生态基因组学) 是由Handelsman等1998年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌 和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段, 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 克隆DNA到合适 的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了不能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质的机会，为新的医药产业和发现新的生物技术提供丰富的基因文库，并利于环境微生物有机群体的分布和功能的研究。 2 宏基因组学的研究过程 2．1 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和策略。一般包括样品总DNA的 提取、与载体连接和克隆到宿主中。 2．1．1样品总DNA的提取 宏基因组文库构建的关键之一是获得高质量的目的样品的总DNA。目的样品 的采集是第一步，除了需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品能更好地代表自然状态下的微生物原貌。 根据提取样品总DNA前是否分离细胞，提取方法可以分为原位裂解法和异位 裂解法。原位裂解法主要是通过去污剂处理(如SDS)、酶解法(如蛋白酶K)、机械
病原微生物
病原微生物： 1、病原微生物检查的标本种类。 血液、脑脊液与其他无菌体液、尿液、呼吸道标本、粪便、泌尿生殖道标本、创伤、组织和脓肿标本。 2、医院感染的定义及常见病原体。 定义：患者在入院时既不存在，亦不处于潜伏期，而在医院内获得的感染。通常医院感染相关症状或体征出现在患者入院48h之后。 细菌为最常见病原体，如G-b、MRSA、MRSCON、厌氧菌、真菌等正常菌群亦常引起医院感染 3、重要的耐药菌及耐药机理。 耐药菌：ESBLs、MRS 耐药机理： 1.细胞膜通透性的改变，使抗生素不能或很少透入细菌体内到达作用靶位，如亚胺培南耐药铜绿假单胞菌 2.灭活酶或钝化酶的产生，如产生β-内酰胺酶，使抗生素失效 3.与抗生素结合靶位（亲和力）的改变，使抗生素的作用下降，如MRSA,青霉素耐药肺炎链球菌 4.其他，如主动外排系统（泵出机制）等，如四环素耐药葡萄球菌 4、ESBL的定义及临床意义。 超广谱β-内酰胺酶。主要由克雷伯菌属和大肠挨希菌等肠杆菌科细菌产生 在体外试验中可使三代头孢和氨曲南抑菌圈缩小，但并不一定在耐药范围,加入克拉维酸可使其抑菌圈扩大 临床对β-内酰胺类药物（包括青霉素类和头孢类）耐药，但对碳青霉烯类和头霉素类药物敏感 由质粒介导，往往由普通的β-内酰胺酶基因（TEM1，TEM2，SHV1）突变而来 临床意义：ESBLs阳性，表明该菌耐所有 -内酰胺酶类药物（包括青霉素类和头孢类）而不管体外药敏结果为耐药或敏感。 5、MRSA的定义及临床意义。 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。耐苯唑西林的葡萄球菌应同时认为耐所有青霉素类，复合青霉素类，头孢菌素类及亚胺硫霉素。 6、细菌耐药性检查的主要方法。 K-B法药敏试验 尿液及肾功能： 1、尿液理化检查的主要指标及临床意义。 pH（5.5~6.5）：尿pH降低：酸中毒、高热、糖尿病、低钾性代谢性碱中毒。尿pH增高：碱中毒、膀胱炎、肾小管性酸中毒。 比重（1.015~1.025）：肾脏稀释-浓缩功能。比重增高：肾前性少尿、糖尿病、急性肾小球肾炎、肾病综合征。比重降低：大量饮水、慢性肾小球肾炎、慢性肾衰、尿崩症。 尿蛋白（＜0.12g/24h）：蛋白尿（＞0.12g/24h）：主要见于肾脏疾病：肾小球肾炎、各种原因引起的肾小管中毒性损伤、高血压、DM、SLE。 尿微量清蛋白（<30 mg/24h）：早期糖尿病肾病的诊断指标。肾小球疾病、狼仓性肾炎、小管间质病。高血压、肥胖、高脂血症、吸烟。 尿葡萄糖测定（-）：血糖增高性疾病：DM、内分泌功能亢进：如甲状腺机能亢进、肾上腺皮质功能亢进、应急状态（颅脑损伤、脑血管意外）；血糖不增高性疾病（肾性糖尿）：家族性糖尿、慢性肾炎或肾病综合征、妊娠。 酮体测定（-）：酮体血症（血中KET↑性疾病）。 尿胆红素测定（-）：阻塞性黄疸：胆囊癌；肝原性黄疸：急性黄疸性肝炎，急性病毒性性肝炎。 尿胆原测定（-/弱阳性）：增高: 溶血性黄疸、肝源性黄疸；下降：阻塞性黄疸。 硝酸盐（-）：阳性：尿路感染。 RBC（0~3/HP）: ＞3／HP :Rbc尿。肾性Rbc尿（肾性血尿）：急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、狼疮性肾炎；非肾性Rbc尿（非肾性血尿）：泌尿道肿瘤，如肾、膀胱肿瘤；泌尿道结石，如肾结石。尿路感染。 WBC(0～3/HP或0～5/HP)：中性粒细胞增多：尿路感染、肾结石、急性肾小球肾炎（轻度）;嗜酸性粒细胞增多：过敏性间质性肾炎;淋巴细胞增多：肾移植排斥反应、急性间质性肾炎（药物）;单核细胞增多：急性间质性肾炎;浆细胞增多：多发型骨髓瘤（肾病型）. 2、肾小球性蛋白尿与肾小管性蛋白尿的鉴别。
宏基因组学概述
宏基因组学概述
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宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境140２班） 摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Mｅｔａｇenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Mａcｒo summary of Ｍetagenｏｍｉcs WanｇＹｉng，Ma Ｙi-Mｉｎｇ (BeｉjinｇＪiaoｔｏngUniｖeｒsiｔy, Inｓtitute of civiｌ enｇｉneerｉｎｇ,）Key ｗords:Metａgenｏmｅ; Ｍetagenoｍiｃs;The eｎviｒｏｎｍental genｏmics 宏基因组学（Meｔａgeｎomｉｃｓ)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是:对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metａgeｎomｉc)进行克隆,并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据ｒDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在19９８年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Haｎｄelsman等提出的,是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta－"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和LｉoｒPaｃｈｔer将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落,而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Ｍeｔagenｏｍics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法
病原微生物的分类与风险分级
附件 1 病原微生物的分类与风险分级 病原微生物的分类与风险分级 病原微生物是指能够使人或者动物致病的微生物。根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，将病原微生物分为4类，相应风险等级为I级~IV级。 第一类病原微生物，是指能够引起人类或者动物患非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。相应的风险等级为IV级(个体高风险，群体高风险)，即容易直接或间接或因偶然接触在人与人、动物与人、人与动物、动物与动物间传播，一般为不能治愈的病原体(如Smallpox virus)。 第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物患严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物问传播的微生物。相应的风险等级为Ⅲ级(个体高风险，群体低风险)，即通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体(如Salmonellatyphi、prion)。? 第三类病原微生物，是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。相应的风险等级为Ⅱ级(个体中风险，群体有限风险)，一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不构成严重危险的病原体。实验室暴露很少引起致严重性疾病的感染，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。 第四类病原微生物，是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。相应的风险等级为I级(个体低风险，群体低风险)，即不会使健康工作者或动物致病的微生物(如细菌、真菌、病毒)和寄生虫等(如非致病性生物因子)。其中第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。
Ion torrent微生物(细菌)全基因组重测序文库构建实验方案
微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案 一、重测序原理 全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。 二、技术路线 ↓基因组DNA提取 细菌DNA（纯化） ↓超声波打断 DNA片段化 ↓ 文库构建 ↓Ion OneTouch 乳液PCR、ES ↓Ion PGM、Ion Proton 上机测序 ↓ 生物信息学分析 三、实验方案 1.细菌总DNA的提取 液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA量。 细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。 取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA 浓度达到文库构建的量。
2.DNA片段化 采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断 步骤： 1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg 2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色 3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入Low TE 至总体积为50mL 4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中（200bp规格），转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子 5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN” 6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中 3.末端修复及接头连接 3.1 末端修复 使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s 步骤： 1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min 3.2 片段纯化 片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行 步骤： 1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序 在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。 样品处理：
宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取： 宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。 测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序： 用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。 由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。454 Platform： 454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。
宏基因组学的一般研究策略
宏基因组学的一般研究策略 摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。 关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集 在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常
传染病是由各种病原微生物和寄生虫感染所引起的一组具
第一章总论 传染病是由各种病原微生物和寄生虫感染所引起的一组具有传染性的疾病。 传染病学是研究传染病和寄生虫病在人体内、外环境中发生、发展、传播和防治规律的科学。其重点是研究这些疾病的发病机理、临床表现、诊断和治疗方法，同时兼顾流行病学和预防措施的研究，以求达到防治结合的目的。 第一节感染与免疫 一、感染的概念 病原体与人体相互作用、相互斗争的过程（infection）。 构成传染过程需要三个条件，即病原体的致病性、机体的反应性，外界环境的影响。 二、传染病感染过程的表现 1、病原体被清除 病原体侵入人体后，在入侵部位被消灭，如皮肤粘膜的屏障作用，胃酸的杀菌作用，组织细胞的吞噬及体液的溶菌作用。或通过局部的免疫作用，病原体从呼吸道、肠道或泌尿道排出体外，不出现病理损害和疾病的临床表现。 2、隐性感染（covert infection）亦称亚临床感染（Subclinical infection） 是指机体被病原侵袭后，仅出现轻微病理损害，而不出现或出现不明显的临床症状，只能通过免疫检测方能发现的一种感染过程，流行性乙型脑炎、脊髓灰质炎、登革热、乙型肝炎等均有大量隐性感染的存在。 3、显性感染（apparent infection） 病原体侵入人体后，因免疫功能的改变，致使病原体不断繁殖，并产生毒素，导致机体出现病理及病理生理改变，临床出现传染病特有的临床表现，则为传染病发作。 4、潜在性感染（lateneinfection） 是指人体内保留病原体，潜伏一定部位，不出现临床表现，病原体也不被向外排出，只有当人体抵抗力降低时，病原体则乘机活跃增殖引起发病。疟疾、结核有此等表现。麻疹后，病毒可长期潜伏于中枢神经系统，数年后发病，成为亚急性硬化性全脑炎。 5、病原携带状态（Carrier infection） 按病原体种类不同可分为带菌、带病毒及带虫状态。这些病原体侵入机体后，存在于机体的一定部位，虽可有轻度的病理损害，但不出现疾病的临床症状。病原携带有两种状态，一是无症状携带，即客观上不易察觉的有或无轻微临床表现的携带状态；二是恢复期携带，亦称病后携带，一般临床症状已消失，症理损伤得到修复，而病原体仍暂时或持续寄生于体内。由于携带者向外排出病原体，成为具有传染性的重要传染源。 三、病原体的致病性 传染过程中，病原体起重要作用，它的致病作用表现如下几方面。 1、侵袭力 病原体在机体内生长，繁殖，蔓延扩散的能力。病原体在体内的扩散通过三种形式。直接扩散：病原由原入侵部位直接向近处或远处组织细胞扩散。血流扩散：
宏基因组学研究方法及应用概述
宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文 (山东省济宁学院生物学系 273155) 颜 梅 (山东省曲阜师范大学生命科学学院 273165) 摘 要 本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。 关键词 宏基因组 宏基因组学 环境基因组学 基因文库的构建 迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。 1 宏基因组学的研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。 1.1 宏基因组的提取 在宏基因组筛选过程中,目的基因是整个核苷酸链中的一部分,因此样品前期的富集能够提高筛选命中率。DNA的提取是宏基因文库构建的关键步骤。提取步骤通常需要满足两个条件:既要尽可能提取样品所有微生物的基因,又要保持片段的完整和纯度。目前所开发的DNA提取方法有两种:细胞提取法和直接裂解法。直接裂解法包括物理法(冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法)、化学法(常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等)及酶裂解法。另外,依据提取样品总DNA前是否分离细胞,可以分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可以直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA 得以释放,由于无需对样品微生物进行复苏,且黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性。此法操作容易、成本低,DNA 提取率高,但由于机械剪切作用较强,所提取的DNA 片段小(1～50kb),通常适用于构建小片段插入文库(以质粒和λ噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后采用较温和的方法抽提DNA。此法条件温和,可获得大片段DNA(20～500kb),纯度高,但操作繁琐、成本高、得率低,通常适用于构建大片段插入文库(以柯斯质粒或者细菌人工染色体为载体)的DNA提取。1.2 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建需适宜的克隆载体。通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒的插入片段可达40kb左右,细菌人工染色体插入片段可达350kb,可用来制备由多基因簇调控的微生物活性物质的完整代谢途径的相关片段文库。1.3 目的基因的筛选 目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析两种。序列分析适用于小片段DNA文库的基因筛选;而功能分析通常适用于大片段DNA文库的筛选。序列分析筛选不依赖于重组基因在外源宿主中的表达,因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过DNA序列中的保守区域设计的,反映了氨基酸序列的保守性,可获得未知序列的目的基因。该方法对DNA量的要求不高,筛选到新活性物质的可能性较大。序列分析的另一个手段是对宏基因组克隆测序,无论是全部或随机测序都是发现新基因的有效手段。 对于功能分析而言,首先需获得目的克隆,然后通过序列和生化分析对其进行表征。此法能快速鉴定出全新且有开发价值的活性物质,可用于医药、工农业等行业。由于此法检出率较低,工作量较大,且受检测手段的限制,所以常要借助于高通量筛选。 2 宏基因组学的应用 2.1 在生态学方面的应用 当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。应用16s r DNA作为系统发育锚去鉴定属于某种微生物的克隆,然后对基因进行测序,从而获得
病原微生物与免疫学
医学微生物学与寄生虫学＆医学免疫学 简答题 １.简述特异性免疫应答过程。 适应性免疫应答，又称特异性免疫应答，指体内抗原特异性T/B淋巴细胞接受抗原刺激后，自身活化增殖分化为效应细胞，产生一系列生物学效应的全过程。 基本过程： ①识别活化阶段： ⅰAPC（抗原提呈细胞）对抗原加工处理及提呈。 ⅱT细胞和B细胞识别抗原。 ②增殖分化阶段：T、B淋巴细胞活化，增殖分化产生效应细胞和浆细胞。 ③效应阶段：Ab和效应T细胞与Ag结合，通过多种机制最后清除Ag。 ２．Ⅰ型超敏反应发生的机制。 Ⅰ型超敏反应又称过敏反应，主要是由特异性IgE抗体介导产生，可发生于局部，亦发生于全身。 ①致敏阶段：变应原进入机体后，可选择诱导变应原特异性B细胞产生IgＥ抗体应答，Ig Ｅ类抗体与ＩｇＧ类抗体不同，它们可在不结合抗原情况下，以其Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面相应受体结合，而使机体处于对该变原的致敏状态。 ②激发阶段：指相同变应原再次进入机体后，通过与肥大细胞／嗜碱性粒细胞表面IgE抗体特异性结合，使之脱落释放生物活性介质的阶段。 ③效应阶段：指生物活性介质作用于效应组织和器官，引起局部或全身过敏反应的阶段。 ３.细菌致病因素。
４.区别内、外毒素的主要性状。 ５.细菌的特殊结构有哪些？各有何作用？ ①荚膜：抗吞噬；粘附作用；抗有害物质损伤，与细菌的致病性有关，是构成细菌毒力的重要因素。 ②鞭毛：细菌运动器官；某些与致病性有关，如霍乱弧菌、空肠弯曲菌；有抗原怕，称H 抗原，可以鉴定细菌。 ③菌毛：具有抗原性，普通菌毛具有粘附易感细胞的能力；与细菌致病性有关，性菌毛。 ④芽胞：具有保护和稳定蛋白质生命物质作用；有助于鉴别细菌；医学消毒、灭菌的重要指标。 6.细菌、病毒感染的类型和特点。 细菌： 隐性感染：机体损伤轻，不出现或仅出现不明显的临床症状，机体可获得特异性免疫力，如结核、白喉、伤寒等疾病常有隐性感染。 ⑴根据病情缓急不同可分为： 急性感染：发病急，病程短，一般数日或数周，病愈后病原菌从宿主体内消失，如霍乱、化脓性脑膜炎等。 慢性感染：病程缓慢进行，常持续数月至数年，多见于胞内寄生菌的感染，如结核、麻风等。 ⑵按感染部位不同可分为： ①局部感染：致病菌引起的感染仅局限于一定部位，引起局部病变。如临床上常见的痈、伤口化脓等。 ②全身感染：感染后病原菌或其毒性产物向全身扩散，引起全身症状的一种感染类型，常见的全身表现有：毒血症、内毒素血症、菌血症、败血症、脓毒血症 带菌状态：有时病原菌在隐性或显性感染后，并未被完全消除，而继续在体内存留一段时间，并不断被排出体外，称为带菌状态。处于带菌状态的人称为带菌者。如白喉、伤寒等传染病，病后常出现带菌状态。由于带菌者经常或间歇排出病原菌，是重要的传染源。 病毒： 隐性感染：病毒侵入机体不引起临床感染称为重金属感染或亚临床感染。其原因可能是病毒毒力弱或机体免疫力强，使病毒不能大量增殖，组织细胞损伤轻微；也可能是病毒最终未到达靶器官，帮不呈现或极少呈现临床症状。脊髓灰质炎病毒感染时，大多数人表现为隐性感
微生物基因组研究进展及意义
微生物基因组研究进展及其意义 近年来，病原微生物的基因组研究取得了飞速的进展。所谓基因组研究是指对微生物的全基因进行核苷酸测序，在了解全基因的结构基础上，研究各个基因单独或数个基因间相互作用的功能。由于过去人们大多从表型分析入手，寻找已知功能的编码基因，实际只了解微生物中极少数的基因，如链球菌的链激酶基因、结核杆菌编码的热休克蛋白基因等。还有大量未知基因未被发现。通过基因组研究，则从根本上揭示了微生物的全部基因，不仅可发现新的基因，还可发现新的基因间相互作用、新的调控因子等。这一研究将使人类从更高层次上掌握病原微生物的致病机制及其规律，从而得以发展新的诊断、预防及治疗微生物感染的制剂、疫苗及药品。此外，新发现的微生物酶及蛋白还可能有在工农业生产上的应用价值。因此，全球除已完成了70余株覆盖重要病毒科的病毒代表株全基因组研究外，据美国基因组研究所（The Institute for Genomic Research, TIGR）报道，目前已完成了19种微生物基因组测序，其中11种与人类及疾病相关（嗜血流感杆菌，生殖道支原体，肺炎支原体，幽门螺杆菌，枯草杆菌，伯氏疏螺旋体，结核杆菌，梅毒螺旋体，沙眼衣原体，普氏立克次体）。另外，还有40余种微生物已被登记正在进行测序，预计在1999～2000年完成〔1〕。 病毒基因组研究进展 病毒因其基因组小，是进行基因组研究最早的生物体。早在1977 年已完成了噬菌体DNA的全基因测序。存在于脊髓灰质炎疫苗中的SV40，是最早完成全基因测序的与疾病相关的病毒；此后，许多病毒均已完成了全基因测序，并根据序列的开放阅读框架（ORF）对编码蛋白进行了推导。已对相当一些病毒蛋白进行了重组表达，还对一些病毒基因编码的调控序列进行了研究。除一般大小的病毒已完成了基因组测序，对大基因组病毒，疱疹病毒科，如水痘病毒基因组为0.125Mb(Mega-basepair,兆碱基对)〔2〕。巨细胞病毒，基因组为0.229Mb〔3〕。我国已对痘苗病毒天坛株（约0.2Mb）进行了全基因测序，发现与国外的痘苗毒株序列有明显的差异〔4〕。我国还对甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒进行了国内毒株的全基因测序。近来还对国内2株发现的虫媒病毒毒株完成了全基因测序。我国从不同来源的标本中发现了不少乙肝病毒变异株，有的具有特殊的生物学特性〔5〕。对病毒基因中调控因子的分析，发现了与乙肝病毒增强子作用的新细胞核因子〔6〕。 因此，目前对病毒的基因组研究已进入了后基因组阶段，即从全基因水平研究病毒的生物学功能，同时发现新的基因功能。对于医学病毒学当前主要方向是研究病毒基因组中与致病及诱生免疫应答相关的基因，从而揭示和解决迄今尚未解决的问题，以达到控制或消灭一些重要病毒感染的目的。 建议目前可进行后基因组研究的领域为： 1．病毒持续性感染：基因组中与持续性感染相关的基因，基因变异或调控因子研究。已报道的乙肝病毒的前核心基因出现终止密码突变，
宏基因组测序讲解
宏基因组测序讲解
宏基因组测序 目的 研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样
宏基因组学概述
宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境1402班） 摘要：随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Metagenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内，宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词：宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Macro summary of Metagenomics Wang Ying, Ma Yi-Ming （BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,） Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics 宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA （也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"met a-"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter 将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生 物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组 DNA；构建宏基因组 DNA 文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图 1)五个步骤。
第17章微生物与寄生虫学习题(精)
第17章微生物与寄生虫学习题 细菌形态与结构 一、名词解释 1.微生物 2．荚膜 3．芽胞 4．质粒 5．L型细菌 二、填空题 1.根据微生物的细胞结构及化学组成，可将其分为、 、三种类型。 2．细菌物形态多种多样，根据外形可归纳为、和 。 3．细菌的基本结构包括、、和等。 4．细菌的特殊结构有、、和。 5．异染颗粒对鉴定有意义。 6．细胞膜的主要功能有、、。 7．核质与细菌的、有着密切的关系。 ★8. 溶菌酶的作用机理是切断N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的连结，破坏的骨架，引起革兰阳性菌裂 解；青霉素则是干扰之间的连 结，使革兰阳性菌不能合成而导致死亡。 ★9. 菌体中的RNA均存在于核蛋白体上，当m RNA与核蛋白体连成时，即成为合成蛋白质的场所。细菌核蛋白体沉降系数 为。由和两个亚基组成，链霉素能与细 菌核蛋白体的亚基结合，红霉素能与 亚基结合从而干扰蛋白质的合成而致细菌死亡。 三、判断改错题 1.细菌是一类含有完整细胞器的单细胞微生物。（） 2.芽胞形成是细菌的繁殖方式.( ) 3.临床上常以杀死细菌的芽胞作为彻底灭菌的指标.( ) 4.荚膜本身具有毒性,所以有荚膜的细菌毒力强.( ) 5.鉴别细菌最常用,最重要的染色法是革兰染色法和抗酸染色法.( ) 6.性菌毛与细菌遗传物质传递及耐药菌形成有关.( ) 四、选择题 1.细菌的测量单位是( )
A.nm B. um C. mm D. cm 2.细菌细胞壁的共有成分是( ) A.多糖 B.脂多糖 C.肽聚糖 D.磷壁酸 3.细菌能维持其一定外形是因为( ) A.细菌壁的半渗透性 B.细胞质是溶胶状物质 C.细胞壁坚韧且具有弹性 D.细胞浆具有渗透压 4.革兰氏染色法的染色步骤是( ) A.初染-脱色-复染-媒染 B. 初染-复染-媒染-脱色 C.初染-脱色-媒染-复染 D. 初染-媒染-脱色-复染 5.与细菌体内遗传有关的物质是( ) A.核糖体 B.中介体 C.染色体 D.质粒 6.有关细菌芽胞的正确描述是( ) A.是某些细菌的特殊结构 B.当环境适宜时可发芽为多个繁殖体 C.是细菌保持生命力的一种形式 D.根据芽胞的形状,位置及大小有助于鉴别细菌 7.细菌涂片标本制作步骤包括有( ) A.涂片 B.固定 C.染色 D.干燥 五、简答题 1.G+菌与G-菌细胞壁的结构主要有何不同? 2.简述显微镜油镜的使用及保护法. ★3.细菌有哪两种菌毛?各有何功能? 4.举例说明微生物与人类的关系. 5．列表说明细菌特殊结构的种类及医学意义。 细菌的生长繁殖与代谢 一、名词解释 1.培养基 2．热原质 3．抗生素 二、填空题 1.细菌生长繁殖的条件有、、、 . 2．将细菌接种于液体培养基中，经37℃培养小时，可出现 、、生长现象。 3．细菌合成代谢产物与致病性有关的是、，