微生物学试验目的与要求

实验五病原性球菌

目的

(一) 掌握致病性葡萄球菌的特征；抗链球菌溶血素“O”试验；甲型链球菌与肺炎链球菌区别。

(二) 熟悉三种链球菌在血平板上的区分；肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌的形态特征。

(三) 了解病原性球菌的形态、染色性。

内容

(一) 病原性球菌的形态及染色性(示教)。

(二) 葡萄球菌培养及生化特性(示教)。

(三) 致病性葡萄球菌的鉴定(操作)。

(四) 链球菌的培养与抗链球菌溶血素“O”试验(示教与操作)。

(五) 肺炎链球菌与甲型链球菌的区别(示教)。

(六) 脓汁或咽拭子分离培养(操作)。

一、病原性球菌的形态及染色性(示教)

1．葡萄球菌的形态及染色性(示教)

【材料】

金黄色葡萄球菌革兰染色示教片。

【方法】

油镜观察细菌的形态、排列及染色性。

2．链球菌的形态及染色性(示教)

【材料】

乙型链球菌血清肉汤培养物制作的革兰染色示教片。

【方法】

油镜观察链球菌的形态、大小、排列及染色性。

3．肺炎链球菌的形态结构及染色性(示教)

【材料】

肺炎链球菌革兰染色示教片、肺炎链球菌荚膜示教片。

【方法】

油镜观察二张示教片中肺炎链球菌的形态结构特点及其染色性。

4．脑膜炎奈瑟菌的形态及染色性(示教)

【材料】

脑膜炎奈瑟菌革兰染色示教片。

【方法】

油镜观察注意形态、大小、排列以及染色性。

5．淋病奈瑟菌的形态及染色性．

【材料】

淋病性尿道、阴道脓汁涂片（革兰染色）。

【方法】

油镜观察细菌形态、排列、在细胞内或外及染色性。

二、葡萄球菌培养及生化特性(示教)

【材料】

1．金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌血琼脂平板培养物

2．金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌甘露醇管

【方法】

1．取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的血琼脂平板培养物，观察二种葡萄球菌单个菌落的形态、大小、表面、边缘、透明度、颜色及溶血性(如颜色不易区别时，可用滤纸片揩抹菌落观察)。

2．取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的甘露醇发酵管，观察二者对甘露醇的分解情况。

三、致病性葡萄球菌的鉴定

致病性葡萄球菌的鉴定，一般实验室都根据以下特征，其中尤以血浆凝固酶试验意义最大。

1．产生金黄色色素。

2．对家兔或羊红细胞有溶血作用。

3．分解甘露醇，产酸不产气。

4．血浆凝固酶试验阳性。

5．耐热DNA酶试验阳性。

血浆疑固酶试验：试管法(示教)

【材料】

见实验四。

【方法】

见实验四

耐热DNA酶试验(示教)

【原理】

致病性葡萄球菌能产生DNA酶，它可特异地分解DNA的磷酸戊糖联结的磷酸二酯键；且有明显耐热性，经180℃15分钟或60℃2小时也不灭活。此酶最适pH9.0，在含DNA基质的琼脂一Tris缓冲液中(PH9.0)，随DNA被分解指示剂甲苯胺蓝从蓝色变粉红色。

【材料】

经100℃煮沸15分钟后的金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌24小时液体培养物；甲苯胺蓝-DNA-琼脂(PH9.0)。

【方法】

1．取装有3ml甲苯胺蓝-DNA-琼脂培养基的小试管置沸水浴中溶化，浇小玻片一块(琼脂全部用完)，待琼脂冷却凝固后，以3mm直径打孔器打2个孔。

2．用无菌滴管吸取加热冷却后的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌液，加人不同的小孔中，置37℃培养2~3小时后观察结果。

3．凡小孔周围出现透明粉红色小圈者为阳性，小孔周围仍为蓝色不透明者为阴性。

注：指示剂甲苯胺蓝在酸性中呈红色，在中性或弱碱性溶液中呈蓝色。

四、链球菌的培养与抗链球菌溶血素“O”试验

(一)培养特性(示教)

【材料】

甲、乙、丙三型链球菌血琼脂平板及乙型链球菌10％兔血清肉汤培养物。

【方法】

1．观察三种链球菌在血琼脂平板上的菌落形态，注意其大小、表面、透明度及溶血情况。

2．观察链球菌在10％兔血清肉汤中生长情况(混浊、沉淀、表面生长)。

(二)抗链球菌溶血素“O”(ASO)试验(操作)

【原理】

链球菌侵人体内可释放溶血素“O”(SO)，它刺激机体产生相应抗体(ASO)。试验时先以溶血素“O”与病人血清混匀产生中和反应，再加入SO乳胶试剂，若病人血清中ASO量很多，未被中和掉的抗体则与乳胶试剂反应，产生清晰凝集，是为阳性；反之为阴性，故本试验属体外中和反应，观察到的现象为间接凝集。

【材料】

8单位/毫升链球菌溶血素“O”，l:15病人血清，链球菌溶血素“O”乳胶试剂，黑底玻片，滴管，对照（正常）血清。

【方法】

1．取已稀释的病人血清与正常血清各一滴，分别滴于玻片的两侧，然后于两侧

各加一滴8单位/毫升链球菌溶血素“O”，晃摇或用牙签混匀2分钟，使其充分混匀。

2．于上述混合液中各加一滴乳胶试剂，晃摇或用牙签混匀3分钟，使其充分混匀。

3．立即观察结果：

(1)有清晰凝集者为阳性，血清滴度>500单位/毫升。

(2)无凝集者为阴性。

“注”：若需进一步测定其血清滴度，用生理盐水将阳性血清再作对倍稀释，再按第2项进行实验，若仍呈清晰凝集时，则血清滴度>800单位/毫升。

五、肺炎链球菌与甲型链球菌的区别(示教)

(一)培养特性(示教)

【材料】

肺炎链球菌及甲型链球菌血琼脂平板培养物

【方法】

观察并比较两种细菌菌落的大小、形态及溶血性等。

(二)菊糖发酵试验(示教)

【材料】

肺炎链球菌及甲型链球菌菌落，菊糖发酵管。

【方法】

1．挑取肺炎链球菌及甲型链球菌菌落分别接种于菊糖发酵管中，37℃培养10~24小时。

2．观察两种细菌在葡糖管中生长后的情况，以溴甲酚紫变色与否作为是否发酵菊糖的判断依据。

(三)胆汁溶菌试验(示教)

【材料】

肺炎链球菌及甲型链球菌血清肉汤培养液18小时生长物，去氧胆酸钠溶液，干燥小试管，1毫升无菌吸管、试管架、生理盐水、37℃水浴。

【方法】

1．取洁净小试管4支，标明1、2、3、4。于第一及第二管内各加入0.2毫升牛胆汁或10%胆盐溶液，第三及第四管中各置0.2毫升生理盐水。

2．用一吸管取0.8亳升肺炎链球菌血清肉汤培养液置于第一管，再吸取0.8毫升至第三管。用另一吸管吸取0.8毫升甲型链球菌血清肉汤培养物于第二管；又0.8毫升于第四管，混匀后置37℃水浴箱中15分钟到一小时，取出观察，若液体变清即为胆汁溶菌阳性，否则为阴性。

六、脓汁或喉拭子分离培养(操作)

【材料】

1．标本：脓汁或喉拭子。

2．培养基：血琼脂平扳、甘露醇发酵管、菊糖发酵管。

3．兔血浆、生理盐水、毛细滴管、吸管、小试管、试管架、革兰染液、玻片。

【方法】

1．将脓汁或喉拭子作涂片(注意先分离培养，后作涂片，避免污染)，革兰染色后镜检，观察细菌形态、排列及染色性。

2．将脓汁或喉拭子材料接种血琼脂平板，置37℃培养18~24小时。

3．根据菌落特点及涂片检查结果，作出初步判断，必要时再作进一步鉴定。

（1）若菌落中等大小、完全溶血、不透明、产生金黄色色素、涂片革兰染色阳性，葡萄状排列，可能是金黄色葡萄球菌，可进一步做血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验，确定其致病力。

（2）若菌落较小、半透明、完全溶血、涂片革兰染色阳性、大都呈链状排列，为乙型链球菌。

（3）若菌落较小、半透明、绿色不完全溶血环，涂片革兰染色阳性、呈短链状排列，为甲型链球菌或肺炎链球菌，需要进一步鉴别，可作胆汁溶菌和菊糖发酵试验。

学生通过判别做进一步的实验（甘露醇发酵和菊糖发酵试验）。将接种后的甘露醇发酵管和菊糖发酵管放入37℃孵箱。

附录：

血琼脂平板培养基：加热融化pH7.6的肉汤琼脂培养基100毫升，冷至45℃~50℃时，以无菌操作加入脱纤维的兔血或羊血5~10毫升。摇匀后倾注平板，冷凝后即成。37℃孵誉24小时，无菌生长，即可使用。血琼脂平板是营养培养基，因血液内含多种营养物质，可促进营养要求较高的细菌的生长。血琼脂平板也可用来检测细菌的溶血性。血液不耐热，故需待琼脂稍冷后才能加入。