病毒包装及使用的常见问题
病毒包装及使用的常见问题
1、问：关于病毒载体种类的选择的问题。从载体的毒性对实验的影响来说，是逆转录还是腺病毒好呢，还是其他病毒好？从操作的难度可行性来说是慢病毒要比腺病毒容易很多吗？
答：操作难度上慢病毒与腺病毒都差不多,是指重组病毒的制备和纯化角度来说的，AAV的制备就更复杂更难一些。
从载体毒性而言，慢病毒毒性较大，但它相对较少引起受体的免疫原性，而腺病毒则有较大的免疫原性。腺相关病毒载体是比较理想的基因治疗载体，免疫原性较低，而且对受体伤害较少。
从插入目的基因角度考虑，慢病毒最大插入基因长度是5k，腺病毒最大插入基因长度是8k，腺相关病毒最大插入长度是3k。
对大多数研究者来说病毒仅仅是一个基因转移工具，在自己的研究工作中只代表工作量，并没有值得大写特写的地方。因此，把这样的工作委托出去，就象把测序、合成引物等工作交给别人做一样。
即便是委托出去，也要明白自己的实验目的和要求是什么，才能很好地选择，同时尽量节省经费。以腺病毒载体为例，可以这样选择：买穿梭质粒，自己做构建、鉴定和大提，交给公司做出毒、扩增和纯化和检测。根据自己的实验要求，可以选择精纯化，也可以选择粗纯化；条件好的可以选择自己做一部分检测。
至于你的实验是选择腺病毒好，还是慢病毒或别的病毒载体好，主要还看你的实验目的，其次才是看哪那种病毒载体容易做。
2、问：重组病毒产品如何运输和保存？
答：病毒产品一般采取干冰运输。腺病毒及腺相关病毒也可以采用冰袋运输。
避免重组病毒反复冻融，请酌情分装后于-80℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。在我们提供的保存液中，病毒产品-80℃保存期为半年。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时，4℃可保存1~2周。但最好尽快用完，根据我们的经验，4℃放置1周，滴度会有4~5倍的下降。
3、问：用于体内试验的重组病毒，是否要求纯化？
答：是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的病毒外壳和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。
4、问：病毒载体可以浓缩或稀释吗？方法如何？
答：可以浓缩。对于一般实验室用户，可以采用高速离心办法浓缩。目前市面上的病毒浓缩纯化办法很多，有不少商业化产品。不同的病毒纯化办法不同。腺病毒载体可以用300K以下的浓缩离心管（PALL 公司产品）进行浓缩。一般来说浓缩后的滴度以不超过3×1012v.p/ml为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。可以稀释：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完。
5、问：小鼠体内注射腺病毒，一只小鼠肌注大概多少量？体内表达时间和表达高峰如何？
答：大部分文献显示，腺病毒用量范围在108-10IU/只小鼠。根据我们的经验，小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。
6、问：腺病毒载体对小鼠的半致死剂量（LD50）大概是多少？
答：据我们的经验，静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1×1011v.p./只；裸鼠和SCID 鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50未测到：1×1012v.p./只给药，未发现小鼠死亡
7、问：VP，PFU，IFU 的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？
答：VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。
PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。
IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。
VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。
8、问：感染细胞最佳MOI的测定？
答：MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
对于分裂活跃的细胞，比如HeLa、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒，比如Lenti-EGFP）。
9、如何保证病毒包装实验室安全？
答：病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！
所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶，不要使用培养板来感染病毒，以防意外洒落。对共用实验室的人员进行病毒安全培训或提示
10、慢病毒滴度检验办法
答：常用的有核心蛋白定量法、RNA基因组定量法、DNA基因组定量法、流式细胞计数法、生物学滴度法、抗性克隆筛选法。
11、关于病毒载体安全性问题
问：病毒载体安全性有些问题，你对此是怎么看待，如何解决？比如：免疫原性问题
答：病毒载体的安全性是业界一直关心的问题。尽管病毒载体都删去了致病基因，但病毒在包装过程中会发生基因重组，存在致病风险性。该问题需要更多的实验进行验证。
病毒载体的免疫原性各不相同。关键在于如何使用载体，应针对不同疾病选用不同载体。
比如腺病毒载体的免疫原性很强，一般用于治疗肿瘤和用做疫苗载体。这时其免疫原性并不是什么缺点，反而还有好处，起到免疫佐剂的作用。
反转录病毒载体和AAV病毒载体的免疫原性很弱，用于需要长期表达和忌讳引起免疫反应的情况，比如自身免疫性疾病。
12、病毒载体的开发和利用问题
问：病毒载体靶向性强，且能稳定的在体内表达，现被认为最有开发价值的转导系统，但是安全性受到质疑，载体本身也受到一定的限制。如何开发和利用病毒载体？
答：病毒载体是一个工具，一般的研究者的主要精力应该用在挖金矿上，而不是制造工具上。目前国内也存在专门研究不同病毒载体的机构，专门为研究者制备载体。
对于专门研究载体的研究者而言，载体的靶向性、容量和安全性都是热点。
靶向性研究的热点主要也集中在这两方面：
①对病毒的外壳蛋白基因进行改造，主要是在基因的某些位点插入特定短肽。依靠这些短肽来改变对细胞的亲嗜性。
②用不同血清型的病毒做载体。如AAV有9种不同的血清型。
13、腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中？如果不是，那么整合率大概有多少？是不是跟靶细胞类型有关呢？
答：野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的．
AAV载体是经过改造的，已经去除了其repcap基因，因此已经失去了特异整合的特性。
对于不同的靶细胞，AAV载体的整合几率是不同的。越来越多的研究发现，在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合，而以附加子（episome）形式存在，最为典型的是在肌肉中。
也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的，有整合到活跃的基因中的倾向。
14、病毒载体对目的基因的长度是否有要求？
答：有AAV的总包装容量是4.7 kb，载体中ITRs（两个ITR共290 bp）+hCMV（约750 bp）+polyA （约150 bp）约1200bp，所以如果用AAV包装载体，目的基因长度要求不超过3.5 kb。
相对应慢病毒目的基因长度不超过5kb，腺病毒载体目的基因长度要求不超过8kb。
15、我的试验需要多少总量的AAV载体？
答：AAV介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)
两部分。根据我们的经验需要AAV的病毒量总量约为5×1012v.g.（一般AAV动物实验低、中、高剂量组用药量分别为1011、1012、1013v.g./kg左右）。
16、据说AAV在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达，为什么？
答：AAV载体在体外实验中用于转导培养细胞时，常发现其表达水平较低，而且有表达延迟现象。这是因为AAV基因组是单链的，它进入细胞以后，必须要有一个由单链变为双链的过程，然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译，在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下，这种AAV由单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程是十分缓慢的，因此相对于其它双链DNA病毒载体如单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），其表达明显延后。此外，AAV对细胞毒性低，培养的细胞在加入AAV后，细胞分裂生长
能力不受太大的影响，这样也对AAV载体有一种稀释作用，也导致其表观表达水平较低。而在体内应用时，注射部位的组织细胞通常没有显著增殖，不会出现AAV载体被稀释的情况，而且在体内各种促进AAV载
体所携带外源基因表达的各种因子相对丰富，故体内应用时，AAV载体的表达水平比较高。
研究表明辅助病毒或其它辅助因子可以明显促进单链DNA复制成双链DNA，从而明显提高外源基因的表达水平，故在体外应用可以考虑加入辅助病毒（Ad5）或丁酸钠（终浓度10~50mmol/L），这样可以提高表达水平达5~10倍。
17、如何才能用重组病毒载体在细胞上做出满意的结果？
答：病毒载体在细胞试验中要想取得满意的结果，主要在以下几个方面：
①病毒载体在不同的细胞由于细胞表面受体的差异而不同转导效率不同，尽量选择转导效率高的细胞，可用参考文献报道和转导报告基因进行筛选。
②良好的细胞状态。
③最好在细胞状态最佳时感染病毒。特别是不要在消化细胞后不久就感染，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏，应该培养过夜后再感染病毒，效果较好。
④适当的转导MOI（病毒基因组数/细胞的比），一般可用105上下做倍比稀释。
⑤适当的转导体积，如24孔板可用200ul，6孔板0.5ml。
⑥转导时间为1-2h，每25分钟晃动培养板混匀一次。（转导时，最好换用无血清培养基，因为血清对病毒的感染有些许不利影响）
⑦可加合适辅助药物刺激，增强表达。
⑧适当表达检测时间，如是分泌蛋白可每24h连续取培养上清检测。通常蛋白表达量在几百纳克至几微克/ml水平。
18、如何才能用病毒载体在动物体内做出满意的结果？
答：病毒载体在动物试验中要想取得满意的结果，主要注意以下几个方面：
①选择适当的血清型：例如不同的AAV血清型在动物体内同一组织有不同的转导效率，如AAV1在
肌肉组织中、AAV5在肺组织中有很高的转导效率。
②选择适当的靶器官：同一血清型AAV在不同的组织具有不同的转导效率，尽量选择转导效率高的靶器官。
③转导途径：尽量选择局部直接多点注射靶器官。
④转导病毒量：根据我们的经验，所加病毒量太多表达量反而会降低。
⑤检测时间：根据我们的经验不同基因的表达高峰时间是不同的，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上的时间。
19、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？
答：腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右.
20、如果我的实验中需要将重组腺病毒注射入动物体内，如果贵公司提供的纯化产品比较浓，需要如何稀释病毒产品，有特殊要求吗？
答：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完，在没有保护剂的情况下，腺病毒在2～8℃保存时间越短越好。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T 细胞的培养 一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。 三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下 只供学习与交流
MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828
产品手册│ MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统 本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。 本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。
目录│ 产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8
产品有限责任担保 Vigene生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。本担保规定了Vigene 更换产品的责任。Vigene生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。Vigene生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。 产品订购和技术支持 山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处 美国地址：12111 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 US 北京办事处：北京市海淀区北三环西路43号青云里满庭芳园D座1206室上海办事处：上海市徐汇区肇家浜路201弄11号602室 广州办事处：广州市天河区骏景花园骏景路棋乐街33号404室 山东办事处：济南市高新区开拓路2350号留学人员创业园717室 Email: service@https://www.360docs.net/doc/744903126.html, Phone: 400-077-2566 https://www.360docs.net/doc/744903126.html,(美国) https://www.360docs.net/doc/744903126.html,（中国） 欢迎您致电或发邮件，咨询产品技术信息。
产品简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。 ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。 重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。 pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可
慢病毒(过表达)包装步骤
. 慢病毒（过表达）包装步骤 秦超 1.转染 复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。 转染步骤：（以10cm培养皿为例） ⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。 ⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀 ⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min ⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min ⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。 2.收毒(36-48h) 收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。 ⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。 ⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。 ⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。 3.接毒 接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml 细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。 4.检测及培养细胞系(48h) 如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 精品
慢病毒包装体系使用说明
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.360docs.net/doc/744903126.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.360docs.net/doc/744903126.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.360docs.net/doc/744903126.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.360docs.net/doc/744903126.html,/
重组腺病毒常见问题解答(FAQs)解析
重组腺病毒常见问题解答(FAQs) ?Q1. 使用重组腺病毒需要的生物安全级别？ ?Q2. 怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？ ?Q3. 感染细胞时腺病毒的最佳浓度？ ?Q4. 感染腺病毒时所需要的培养基的量？ ?Q5. VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？ ?Q6. 病毒的滴度是如何测定的？ ?Q7. 对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？ ?Q8. 重组腺病毒的推荐存储条件是什么？ ?Q9. 腺病毒表达系统承载外源基因的容量？ ?Q10. 腺病毒有多种血清型，哪一种是基因传递中最普遍使用的？ ?Q11. 什么是RCAs？ ?Q12. 目前存在的许多病毒载体系统，包括：腺病毒、逆转录病毒和慢病毒，针对我的实验应该使用哪个系统？ Q1.使用重组腺病毒需要的生物安全级别？ 答：我们所提供的重组腺病毒是E1/E3区缺失的复制缺陷型病毒。根据NIH官方的参考信息，重组腺病毒的生物安全等级被确定为II级，您只需要BL-II级实验设施，值得注意的是，大多数实验室都具备BL-II级的实验设施。野生型腺病毒可复制，能引起感冒和很强的免疫反应，通常不会引起很严重的疾病。要想获得更多生物安全信息，请参考网站https://www.360docs.net/doc/744903126.html, 返回Q2.怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？ 答：腺病毒有很广泛的宿主范围。它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染。一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性，因此需要大量的病毒来感染细胞。为了客户的
方便，我们提供含有报告基因的病毒，如Ad-CMV-B-gal 和Ad-CMV-GFP从而方便的进行您的预实验。 返回 Q3.感染细胞时腺病毒的最佳浓度？ 答：要得到最佳的实验结果，确定腺病毒的最佳用量是非常重要的。如果用量不足，那么不能达到100%的感染效率，如果用量太高，会对细胞有毒害作用或者其他不可预测的效应。我们应该尽量用最小浓度的病毒来达到100%的基因传递效率。这个最佳的浓度因不同的细胞类型而有显著差异。为了确定你的细胞系的最适病毒用量，可以用带报告基因的腺病毒做预实验，如AdCMV-B-gal 或者AdCMV-GFP。用不同稀释倍数的报告基因病毒感染细胞，在感染1-2天后检测感染效率。可以通过B-gal染色或者通过在荧光显微镜下观察细胞的GFP的表达情况来确定可达到100%感染效率但又不会引起细胞表型变化病毒浓度范围。 我们已经针对多种细胞系做了预实验，加入已混合病毒的培养基，6-8小时或者过夜。对于大多数细胞系来说病毒浓度在2 x 105 - 1 x 106 IFU/PFU (infectious unit)/ml培养基都能得到10%的感染效率而且不会有副作用。我们推荐在您实验系统中用报告基因病毒重新摸索一下最适培养基用量。 返回 Q4.感染腺病毒时所需要的培养基的量？ 答：作为参考，我们推荐您按照如下的量加培养基（已混入病毒）： 10cm培养皿：8-10ml/孔6孔板：1ml/孔12孔板：0.5ml/孔24孔板：0.2ml/孔 返回 Q5. VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？ 答：VP(Viral particles) 反映病毒颗粒的总数（包括活病毒和死病毒），由于在病毒制备过程中，每次活/死病毒比率都不同，VP并不能反映有活性的病毒的数量。 PFU（plaque formation unit）代表可感染的或者活病毒的数量。能反映实验中所需要的病毒的量。 IFU（infectious unit）相当于PFU 大多数情况下所制备的病毒，VP/PFU比值在20:1到50:1范围。 应用VP（viral particles）做单位会与实际应用的活病毒的数量有很大出入。用IFU或者PFU做单位会得到比较一致的结果。 返回
病毒包装原理
汉恒生物2017产品手册 --您身边的病毒载体专家
专注于基因技术的研发与应用转化 病毒载体为工具的基因技术操作全平台 汉恒已成为国内生物医药科研与研发领域最主流的基因载体与基因技术供应商 覆盖、并抢占国内主流科研、临床前研究及药物研发的AAV市场，完成基础底层市场的教育及占领 与国内临床机构合作申报并实施基因治疗临床前及临床研究项目 上市1-2种自主知识产权的基因治疗AAV药物 2012年4年多的发展短期目标 中期目标2-5年内长期目标10年内 2010成立汉恒简史 汉恒生物成立于2010年，专注于基因技术的研发与应用转化。2012年， 汉恒建立了以病毒载体为工具的基因技术操作全平台，经过7年多的发展，汉恒已成为国内生物医药科研与研发领域最主流的基因载体与基因技术供应商。 汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上，进一步开发基因及信号通路研究工具，包括自噬流 研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础，汉恒更加注重技术应用与临床转化。 公司简介 目 录 1 Zhu Y , Di S, Hu W et al. A new flavonoid glycoside (APG) isolated from Clematis tangutica attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating PKCepsilon signaling. Biochim Biophys Acta 2017; 1863:701-711. 2 Zheng X, Chen W, Hou H et al. Ginsenoside 20(S)-Rg 3 induced autophagy to inhibit migration and invasion of ovarian cancer. Biomed Pharmacother 2017; 85:620-626. 3 Zhao H, Xue Y , Guo Y , Sun Y , Liu D, Wang X. Inhibition of endocan attenuates monocrotaline-induced connective tissue disease related pulmonary arterial hypertension. Int Immunopharmacol 2017; 42:115-121. 4 Yang Z, Hou Y , Hao T et al. A human proteome array approach to identifying key host proteins targeted by Toxoplasma kinase ROP18. Mol Cell Proteomics 2017. 5 Xu J, Zhang X, Wang H et al. HCRP1 downregulation promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion through the induction of EGFR activation and epithelial-mesenchymal transition. Biomed Pharmacother 2017; 88:421-429. 6 Wang X, Fu Z, Chen Y , Liu L. Fas expression is downregulated in gastric cancer. Mol Med Rep 2017; 15:627-634. 7 Wang T, Wang P , Cao Z et al. Effects of BMP9 and pulsed electromagnetic fields on the proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells. Bioelectromagnetics 2017; 38:63-77. 8 Wang P , Wang Y , Tang W et al. Bone Morphogenetic Protein-9 Enhances Osteogenic Differentiation of Human Periodontal Ligament Stem Cells via the JNK Pathway. PLoS One 2017; 12:e0169123. 9 Li M, Y uan Y , Hu B, Wu L. Study on Lentivirus-Mediated ABCA7 Improves Neurocognitive Function and Related Mechanisms in the C57BL/6 Mouse Model of Alzheimer's Disease. J Mol Neurosci 2017. 10 Li C, Guo XD, Lei M et al. Thamnolia vermicularis extract improves learning ability in APP/PS1 transgenic mice by ameliorating both Abeta and 2017客户最新文献节选 06一流质量标准汉恒专利08 产品介绍 07公司优势 02汉恒客户发表文献专题研究 33HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒 36SaveIt TM 抗支原体试剂盒 37 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒 34LipoFiter TM 脂质体转染试剂汉恒自主研发试剂 30CRISPR-Cas9专题研究 27环状RNA专题研究28自噬专题研究 32 探针工具 细胞器定位工具 25悬浮细胞专用病毒 26 原代T细胞专用病毒 17化学遗传学AAV现货工具 14光遗传学AAV现货工具22慢病毒 24 逆转录病毒 09 腺相关病毒AAV 19腺病毒特色服务
细胞培养常见问题(二)
细胞培养常见问题（二） 1.何谓无血清培养基SFM（Serum Free Medium）？ 无血清培养基是设计用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基。无血清培养基中需要添加生长因子和/或细胞因子，含有个别蛋白或大量蛋白组分：如：胰岛素，转铁蛋白等。 2.何谓无蛋白培养基 PFM （Protein Free Medium）？ 无蛋白培养基中没有添加蛋白，但仍然可能包含一些动物或植物来源的成分（如低分子量肽的各种水解物）。 3.何谓化学限定培养基 CDM （Chemical Define Medium）？ 化学限定培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构，又称无血清、无蛋白、无肽纯化学合成培养基。 4.无血清培养基有什么优点？ 无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。无血清培养基的优点在于避免了血清的批次、质量、成份等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。目前，国际法规严格要求“生物制品的生产要向无动物源原料添加发展”，因此，在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，无血清培养基可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。 5.无血清培养基可应用于哪些领域？ 目前，无血清培养基已应用的领域有： （1）研究细胞的分化条件； （2）用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究； （3）用于从多种细胞混杂的培养基中选择目的细胞； （4）肿瘤病理学和病因学的研究； （5）用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品。 6.如何对哺乳动物细胞进行无血清条件的驯化？ 建议通过渐进脱离的方法使哺乳动物细胞从有血清培养的条件适应到无血清培养条件。在驯化过程中，细胞生长速度通常比添加血清的培养基缓慢。而且，细胞培养4-5天时，由于细胞内蛋白质的丢失，可能会出现细胞大量死亡的情况。所以，应注意观察细胞生长时的状态，频繁更换培养液，培养基一旦变黄即更换。为了使细胞进入正常生长周期，传代时细胞密度不得低于1x105cells/ml。可应用下列方法进行无血清培养： （1）在通常的培养基中(含5-10%FBS)，细胞进行培养并传代两次。 （2）可直接使用100%无血清培养基进行培养。 （3）或者将血清加入到无血清培养基中，使血清浓度递减，直到完全应用无血清培养基培
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片
慢病毒包装原理-介绍学习资料
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。 U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法，寻找高效的 siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入 siRNA 表达载体。 慢病毒载体（ Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答 1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？ 有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的 外源片断要求小于8 kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。 2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？ 腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验，完成一个完 整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右. 3、如何提高腺病毒的活性？ 提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。 4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？ UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。 5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？ 参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。 Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。 6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？ 1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。 2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒，效果较好。 3）选择适当的转导MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。 4）感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。 5）感染时间为90分钟，每15分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。 6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达，48小时表达达到较高水平。 7、用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？ 是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会
第二代和第三代慢病毒包装系统定稿版
第二代和第三代慢病毒包装系统精编W O R D 版 IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】
第二代和第三代慢病毒包装系统 将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的 HIV-1顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV-G蛋白代替，应用 VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。3质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白 (VSV 2G)，应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因( 绿色荧光蛋白 GFP) 。 在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第二代系统中5’LTR 634bp，3' LTR 634bp，5’LTR前不需要强启动子。4质粒系统。 第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了U3区的3’LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
1.1.6+腺病毒感染
疾病名：腺病毒感染 英文名：adenovirus infections 缩写： 别名： 疾病代码： ICD ：B97.0 概述：可引起人、猿、马、猪、羊、狗等感染。实验发现可引起动物致癌；未证实其可致人类肿瘤,但可引起人类多种感染性疾病。 流行病学：病毒由病人及隐性感染者通过粪便及呼吸道分泌物排出,可经气溶胶、密切接触及粪-口途径传播眼、鼻、口黏膜为入侵途径。感染者半数无症状,儿童的呼吸道疾病约5%～10%由腺病毒引起。 病因：目前发现腺病毒有6个亚型(A～F)和47个不同的血清型(按中和试验分型)。已知约20余种亚型可感染人类。病毒为直径70～80nm 的20面体衣壳,内核含双股DNA。对热和酸不稳定。由于不含脂质,对胆盐等脂质溶解剂抵抗力强,故能在肠道中存活。不同亚型可引起不同感染,见表1。 发病机制：呼吸道病毒侵入人的呼吸道表面的纤毛上皮细胞后,在其内复制和扩散并直接引起受染细胞损伤,造成局部病变或产生全身毒血症状。某些病毒感染的组织损伤可能由机体免疫反应所介导,如呼吸道合胞病毒对呼吸道纤毛上皮细胞的直接破坏最轻,但能引起婴幼儿严重呼吸道疾病；最易罹患的年龄正是母传C D D C D D C D D C D D
抗体水平最高的阶段；接种疫苗后反而使自然感染者的病情加重等均提示其发病可能与免疫反应有关。呼吸道病毒感染的病理改变有鼻、咽、喉黏膜充血、水肿、渗出与单核细胞浸润,部分细胞可发生变性、坏死、脱落。上皮细胞胞质或胞核内可查见包涵体。病变程度与病毒种类、型别和感染部位有关。轻者数天后上皮细胞可再生而恢复正常。如病变累及细支气管,可发生上皮细胞坏死、剥脱,细支气管壁有广泛单核细胞浸润,纤维蛋白、细胞碎片和黏稠的黏液可堵塞管腔而致肺不张、肺气肿。病毒性肺炎最初表现为纤毛进行性减少,上皮细胞空泡形成,继之上皮细胞变性,肺泡实质性坏死、萎陷,肺泡壁也可见坏死和增厚,间质水肿和单核细胞、淋巴细胞浸润。并发细菌性感染时,可见黏膜充血,中性粒细胞浸润和黏液脓性分泌物,严重者可发生肺脓肿、败血症及多个器官的化脓性变化。 临床表现：潜伏期4～5天。 1.儿童中最常见的临床表现 (1)呼吸道感染：鼻炎为婴儿腺病毒感染最常见的症状。这个年龄组中偶可引起暴发性支气管炎和肺炎,部分病儿发生百日咳综合征。 (2)咽结膜炎热(pharyngo-conjunctival fever,APC fever)：腺病毒3、7型引起为多,夏季可发生小流行,与游泳池水传播有关。发病急,发热38℃以上,出现咽炎、鼻炎、眼结膜炎及颈淋巴结炎。球结膜及睑结膜可见颗粒状突起、红肿,常为单侧,双侧者常为一侧较重。症状延续1～2周,无后遗症。一般不伴支气 管炎及肺炎。 (3)出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis)：大多由腺病毒11、21型引起,男孩多见,无明显季节性。可有血尿、尿频、尿急及排尿困难、肉眼血尿,约3～7天,镜下血尿可持续2周左右。 (4)其他：婴儿腹泻、心包炎、慢性间质性纤维化、风疹样疾病及先天性畸形曾发现与腺病毒感染有关。有报道器官移植及免疫缺陷者腺病毒感染后,除引起呼吸道、泌尿道感染,还可致脑炎等中枢神经系统感染。 2.成人常见的临床表现 (1)呼吸道感染：常见为非典型肺炎的表现,可有发热、咳嗽、咽痛、流涕、肺部啰音。X 线胸片示间质性肺炎改变,多为单侧,下肺野较多见,可发生少量胸膜渗出。病程常自限性(约1～2周),罕见继发细菌感染或致死病例。 C D D C D D C D D C D D
腺病毒载体疫苗.doc
腺病毒载体疫苗 什么是腺病毒载体疫苗 腺病毒载体疫苗是指以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中，使用能表达保护性抗原基因的重组腺病毒制成的疫苗。 腺病毒载体疫苗特点 研究发现，携带各种抗原的腺病毒载体能刺激机体产生很强的体液免疫或细胞免疫。此外，由于腺病毒载体能感染呼吸道和肠道细胞，可以方便地通过黏膜进行免疫，并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答。 腺病毒载体疫苗的临床研究 1、腺病毒载体诱导的天然免疫反应 腺病毒载体本身的病原相关分子模式与细胞表面模式识别受体结合，促进炎性细胞因子的分泌和未成熟树突状细胞分化为专职抗原呈递细胞，激活宿主的天然免疫系统。研究表明，通过静脉给小鼠注射大剂量的表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒，6h即可检测到IL-6、IL-1和TNF-α的分泌，脾脏边缘也有树突状细胞和巨噬细胞聚集，在恒河猴中也观察到类似现象。 2、腺病毒载体疫苗能迅速刺激机体产生高水平的体液免疫 很多疫苗是通过刺激机体产生中和抗体来发挥保护机体预防疾病作用的。腺病毒载体疫苗能有效产生针对相应靶抗原的高水平抗体。如携带狂犬病毒糖蛋白的复制缺陷型或复制型的5 型重组腺病毒载体疫苗，都能诱导高水平中和抗体，保护动物抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击。 3、腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的细胞免疫 特异性T细胞免疫在对抗寄生虫病、病毒性疾病及肿瘤治疗中都具有重要作用。大量的临床前和临床研究发现，腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的针对外源基因的特异性T 细胞反应。有研究报道，携带恶性疟原虫抗原ME.TRAP的腺病毒载体疫苗能刺激小鼠产生很强的CD8+T细胞免疫反应，最高能达到92％的保护率。 4、腺病毒载体疫苗可方便地通过黏膜进行免疫 能通过黏膜免疫诱导局部或全身体液免疫反应是腺病毒载体疫苗的一个重要特点。黏膜免疫与全身免疫相比有许多不同，注射免疫诱导的全身免疫虽然可以清除其感染，但通常不能保护黏膜表面；而经黏膜接种疫苗可以非侵入性地诱导机体产生黏膜和系统免疫应答，从而可以保护机体免受通过黏膜表面和其他途径的感染。研究发现，在多种动物模型中，口服或滴鼻接种肺炎球菌、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、乙肝病毒的重组腺病毒载体疫苗，都能刺激机体产生很强的体液免疫和局部的黏膜反应，并保护机体免受相应病原的侵害。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程 一、材料 1 细胞培养试剂 试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen 胎牛血清10%Invitrogen/Gibco 丙酮酸钠1mM Invitrogen DMSO（冻存用）10% 2 慢病毒包装试剂 试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000Invitrogen Opti-MEM基础培养基Invitrogen PEG6000溶液50%Wako NaCl溶液40 mM HBSS溶液Invitrogen 3 耗材 50 mL离心管 15 mL离心管 10 cm细胞培养皿 μm过滤器 2 mL EP管 二、操作流程
1细胞培养 1.1293T/293FT细胞的复苏 1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。在超净台内，用吸管吸取6~7mL 完全培养液至15 mL离心管中； 2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不 要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化； 3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的 完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO 对细胞造成的毒性作用）。 4)在室温条件下，250 g离心4分钟。 5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液， 再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和 湿度培养箱内培养。（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的 培养容器。） 6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。 7) 1.2293T/293FT细胞传代 1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细 胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰 酶的抑制因子）； 2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。在显微镜下观察，可看 到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞 仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间； 3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。用吸管