基因工程作业

基因工程设计方案

骨胶原蛋白在Ecoli中的表达与纯化研究

一、功能与市场前景分析

1、1有功能有市场有前（钱）途

胶原蛋白是由动物的成纤维细胞合成的一种生物高分子，广泛存在于动物骨、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中，是细胞外基质的主要成分。由于其特有的生理活性和丰富的营养价值，被广泛地应用于医学、美容、化妆品、食品等领域。目前胶原蛋白的制备大多采用常规方法，通常以含有结缔组织的屠宰陆生动物废弃物为原料，对其进行酸、碱和酶处理来提取胶原蛋白，但该方法提取的蛋白具有非水溶性、病毒传染性、异体免疫排斥性等缺点，限制了胶原蛋白许多潜在用途的发。基因工程菌发酵生产具有生长周期短、成本低廉、操作简单、过程便于规范控制、发酵培养基成分简单等优点，且蛋白基因可受启动子基因调控，其具备易纯化和可诱导的特点。近年来，人们开始用基因工程的方法表达不同来源、不同类型的胶原蛋白。研究者利用重组大肠杆菌通过高密度发酵培养生产人源性胶原蛋白，所得重组胶原蛋白表达量高达２９．４％，可见通过基因工程手段生产类人胶原将会是一有效途径。目前，本实验所研究的胶原蛋白，国内外对其的研究均是关于该蛋的作用及其作用机制，而关于基因工程生产方面的研究尚未见报道。

本实验以ＬＢ培养基为基础对重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件进行了一系列的优化，采用单因素实验考查多种因素对表达量的影响，为进一步研究发酵工艺提供了实验基础。

随着分子生物学的快速发展，诸多学者为了能充分利用胶原蛋白的优良性能，同时避免动物来源的病毒高风险，开始利用基因工程技术，选用各种宿主细胞生产重组人胶原蛋白，已利用的宿主细胞如转基因烟草、转基因昆虫、转基因鼠、转基因蚕、大肠杆菌、酵母等。基因工程法生产的胶原蛋白产品具有安全性好、重现性好、结构稳定等优点，同时也能改善胶原蛋白的免疫排异性、亲水性等性能，从而解决了传统提取方法存在的如疯牛病病毒隐患等很多缺点。由于基因工程法生产胶原蛋白有很多显著的优点，近几年来利用基因工程技术生产类人胶原蛋白已经是生产胶原蛋白方法的研究热点。

基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞，并且近年来出现了很多新型的真核表达系统，但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。采用大肠杆菌表达目的基因的优势在于：宿主的遗传背景相对清楚，表达易于控制，且大肠杆菌易于培养，可以获得较高产量的目的蛋白。本研究旨在使目的蛋白在原核细胞中获得高效表达，由于目的蛋白的表达量与接种量、诱导时机、诱导浓度、温度和诱导时间密切相关，所以本文作者对这５个影响蛋白质表达产量的主要因素进行了优化，确定最佳表达条件为：菌株在３７℃、接种量为２％，摇瓶培养约２．５ｈ后，加入终浓度为０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的ＩＰＴＧ，３７℃诱导５ｈ，收获的蛋白表达量可达３１．５２ｍｇ·Ｌ－１。本研究构建了重组质粒ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ６，转化入大肠杆菌ＤＥ３中，经ＩＰＴＧ诱导表达，得到可溶性重组蛋白，经Ｎｉ－ＮＴＡ柱亲和层析的纯化方法获得重组蛋白，方法简单易行，适合进行大规模纯化。本实验结果为进一步在发酵罐内进行分批发酵和补料发酵提供了参考。

1、2能够在大肠杆菌表达

二、基因克隆

2、1确定三个序列

氨基酸序列： 1 mepgrrgaaa llallcvaca lragraqyer ysfrsfprde lmplesayrh aldkysgehw

61 aesvgyleis lrlhrllrds eafchrncsa apqpepaagl asypelrlfg gllrrahclk

121 rckqglpafr qsqpsrevla dfqrrepykf lqfayfkann lpkaiaaaht fllkhpddem

181 mkrnmayyks lpgaedyikd letksyeslf iravraynge nwrtsitdme lalpdffkaf

241 yeclaacegs reikdfkdfy lsiadhyvev leckiqceen ltpviggypv ekfvatmyhy

301 lqfayyklnd lknaapcavs yllfdqndkv mqqnlvyyqy hrdtwglsde hfqprpeavq

361 ffnvttlqke lydfakenim dddegevvey vddlleleet s

//

CDS序列:"MEPGRRGAAALLALLCV ACALRAGRAQYERYSFRSFPRDELMPL ESAYRHALDKYSGEHWAESVGYLEISLRLHRLLRDSEAFCHRNCSAAPQPEPA AGLAS YPELRLFGGLLRRAHCLKRCKQGLPAFRQSQPSREVLADFQRREPYKFLQFAY FKANN LPKAIAAAHTFLLKHPDDEMMKRNMAYYKSLPGAEDYIKDLETKSYESLFIR A VRAYN GENWRTSITDMELALPDFFKAFYECLAACEGSREIKDFKDFYLSIADHYVEVL ECKIQ

CEENLTPVIGGYPVEKFV ATMYHYLQFAYYKLNDLKNAAPCAVSYLLFDQND KVMQQN

LVYYQYHRDTWGLSDEHFQPRPEA VQFFNVTTLQKELYDFAKENIMDDDEGE VVEYVD

DLLELEETS"

mRNA序列：

ORIGIN

181 GCCGAGAGCG TGGGCTACCT GGAGATCAGC CTGCGGCTGC ACCGCTTGCT GCGCGACAGC

241 GAGGCCTTCT GCCACCGCAA CTGCAGCGCC GCGCCGCAGC CCGAGCCCGC CGCCGGCCTC

301 GCCAGCTATC CCGAGCTGCG CCTCTTCGGG GGCCTGCTGC GCCGCGCGCA CTGCCTCAAG

361 CGCTGCAAGC AGGGCCTGCC AGCCTTCCGC CAGTCCCAGC CCAGCCGCGA GGTGCTGGCG

421 GACTTCCAGC GCCGCGAGCC CTACAAGTTC CTGCAGTTCG CTTACTTCAA GGCAAATAAT

481 CTCCCCAAAG CCATCGCCGC TGCTCACACC TTTCTACTGA AGCATCCTGA TGACGAAATG

541 ATGAAGAGGA ACATGGCATA TTATAAGAGC CTGCCTGGTG CCGAGGACTA CATTAAAGAC

601 CTGGAAACCA AGTCATATGA AAGCCTGTTC ATCCGAGCAG TGCGGGCATA CAACGGTGAG

661 AACTGGAGAA CATCCATCAC AGACATGGAG CTGGCCCTTC CCGACTTCTT CAAAGCCTTT

721 TACGAGTGTC TCGCAGCCTG CGAGGGTTCC AGGGAGATCA AGGACTTCAA GGATTTCTAC

781 CTTTCCA TAG CAGATCATTA TGTAGAAGTT CTGGAATGCA AAATACAGTG TGAAGAGAAC

841 CTCACCCCAG TTATAGGAGG CTATCCGGTT GAGAAATTTG TGGCTACCAT GTATCATTAC

901 TTGCAGTTTG CCTATTATAA GTTGAACGAC CTGAAGAATG CAGCCCCCTG TGCAGTCAGC

961 TATCTGCTCT TTGATCAGAA TGACAAGGTC ATGCAGCAGA ACCTGGTGTA TTACCAGTAC

1021 CACAGGGACA CTTGGGGCCT CTCGGATGAG CACTTCCAGC CCAGACCTGA AGCAGTTCAG

1081 TTCTTTAATG TGACCACACT CCAGAAGGAG CTGTATGACT TTGCTAAGGA AAATATAATG

1141 GATGATGATG AGGGAGAAGT TGTGGAATAT GTGGATGACC TCTTGGAACT GGAGGAGACC

1201 AGCTAG

//

2、2确定克隆策略

引物设计的一般原则：

通常情况下较好的引物在结构和组成上应满足以下条件：

（1）引物长度应在15~30bp，Tm接近72℃较佳。引物的Tm可按下列简单公式计算：Tm=（G+C)×4+(A+T)×2

（2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。

（3）GC含量在45%~55%。

（4）两个引物在3'端均必须与摸板互补，5'端可以不互补

（5）引物自身连续互补碱基小于4个

（6）引物之间连续互补碱基亦应小于4

引物3'端的末位碱基

引物3'端的末位碱基在很大程度上影响着taqDNA聚合酶的有效延伸。实验表明，引物3'端末位碱基存在错配时，不同碱基的引发效率存在很大的差异。当末位碱基为T时，即使存在错配的情况下也能引发链的合成；而末尾碱基为A时，错配的引发效率大大降低。GC居于其间。如果是用于扩增一个已知基因的序列，3'端的末位碱基最好选择A、G、C，不要选T。如果已知一种蛋白的末端氨基酸序列而基因序列未知时，通常设计简并引物来分离该蛋白基因，此时简并引物的3'端末位碱基选T，有时会得到较好的效果。

利用软件设计引物：（mRNA途径）

SEQ Unknown: 1206 bp;

Composition 242 A; 339 C; 349 G; 276 T; 0 OTHER Percentage: 20% A; 28% C; 29% G; 23% T; 0%OTHER

Molecular Weight (kDa): ssDNA: 372.44 dsDNA: 743.6 ORIGIN

1 CTAGCTGGTC TCCTCCAGTT CCAAGAGGTC ATCCACATAT TCCACAACTT CTCCCTCATC

61 ATCATCCATT ATATTTTCCT TAGCAAAGTC ATACAGCTCC TTCTGGAGTG TGGTCACATT

121 AAAGAACTGA ACTGCTTCAG GTCTGGGCTG GAAGTGCTCA TCCGAGAGGC CCCAAGTGTC

181 CCTGTGGTAC TGGTAATACA CCAGGTTCTG CTGCATGACC TTGTCATTCT GATCAAAGAG

241 CAGATAGCTG ACTGCACAGG GGGCTGCATT CTTCAGGTCG TTCAACTTAT AATAGGCAAA

301 CTGCAAGTAA TGATACATGG TAGCCACAAA TTTCTCAACC GGATAGCCTC CTATAACTGG

361 GGTGAGGTTC TCTTCACACT GTATTTTGCA TTCCAGAACT TCTACATAAT GATCTGCTAT

421 GGAAAGGTAG AAATCCTTGA AGTCCTTGAT CTCCCTGGAA CCCTCGCAGG CTGCGAGACA

481 CTCGTAAAAG GCTTTGAAGA AGTCGGGAAG GGCCAGCTCC

ATGTCTGTGA TGGATGTTCT

541 CCAGTTCTCA CCGTTGTATG CCCGCACTGC TCGGATGAAC AGGCTTTCAT ATGACTTGGT

601 TTCCAGGTCT TTAATGTAGT CCTCGGCACC AGGCAGGCTC TTATAATATG CCATGTTCCT

661 CTTCATCATT TCGTCATCAG GATGCTTCAG TAGAAAGGTG TGAGCAGCGG CGATGGCTTT

721 GGGGAGATTA TTTGCCTTGA AGTAAGCGAA CTGCAGGAAC TTGTAGGGCT CGCGGCGCTG

781 GAAGTCCGCC AGCACCTCGC GGCTGGGCTG GGACTGGCGG AAGGCTGGCA GGCCCTGCTT

841 GCAGCGCTTG AGGCAGTGCG CGCGGCGCAG CAGGCCCCCG AAGAGGCGCA GCTCGGGATA

901 GCTGGCGAGG CCGGCGGCGG GCTCGGGCTG CGGCGCGGCG CTGCAGTTGC GGTGGCAGAA

961 GGCCTCGCTG TCGCGCAGCA AGCGGTGCAG CCGCAGGCTG ATCTCCAGGT AGCCCACGCT

1021 CTCGGCCCAG TGCTCGCCGC TGTACTTGTC CAGCGCGTGC CGGTAGGCCG ACTCGAGCGG

1081 CATCAGCTCG TCCCGTGGGA AGCTGCGGAA GCTGTAGCGT TCGTATTGGG CGCGCCCGGC

1141 GCGCAGCGCG CAGGCCACGC ACAGCAGCGC TAGCAGCGCC GCGGCCCCCC GGCGCCCCGG

1201 CTCCAT

Restriction analysis on Unknown

Methylation: dam-Yes dcm-Yes

Screened with 2523 enzymes, 6588 sites found

Non Cut Enzymes

AaaI AacI AaeI AagI AaqI AatII

AcaI AcaII AcaIII Acc113I Acc16I

Acc65I

AccB7I AccEBI AccIII AclI AclNI AcpI

AcpII AcrII Acs1371I Acs1372I Acs1373I

Acs1421I

Acs1422I Afa16RI Afa22MI AflII AflIV AgeI

AhaB8I AhaIII AhdI AhyI AinII Ali12257I

Ali12258I AliI Alw44I AmaI AmeI AocI

Aor13HI AosI ApaCI ApaI A I paLI ApeI

Apu16I AseI AsiI AsnI Asp10HI

Asp10HII

Asp3065I Asp52I Asp5HI Asp707I Asp718I

Asp763I

AspAI AspEI AspJI AspTII AsuII AteI

Atu1II AviI AviII AvrBII AvrII AxyI

BalI BamFI BamHI BamKI BamNI BanIII

BavAI BavBI BavCI BavI Bbf7411I

Bbi24I

BbrAI BbrI BbrPI BbsI BbuI Bbv16II

BbvAII BbvAIII BbvII Bca1259I Bce751I

BcgI

Bci29I BciBI BclI BcmI Bco10278I

Bco102II

Bco63I Bco6I BcoAI BdiI BfrAI BfrBI

BfrI BglI BglII Bim19I BimI Bla7920I

Bli41I Bli86I BliHKI BliRI BlnI BlpI

BmaAI BmaBI BmaCI BmaDI BmaI BnaI

BpeI BpiI BpoAI Bpu1102I Bpu1268I

Bpu14I

BpuAI BpuB5I Bsa29I BsaBI BsaDI BsaFI

BsaKI BsaTI BsaVI Bsc91I BscI BscJI

Bse21I Bse59I Bse631I Bse64I Bse8I BseAI

BseCI BseHI BseII BseRI BseT10I

BseT9I

Bsh1365I BshHI BshLI BsiBI BsiCI BsiGI

BsiI BsiKI BsiMI BsiOI BsiWI BsiXI

BsmBI BsmGI BsmGII BsoAI BsoDI BsoEI

BsoJI BsoSI Bsp106I Bsp119I Bsp120I

Bsp121I

Bsp125I Bsp126I Bsp127I Bsp130I Bsp131I

Bsp13I

Bsp1407I Bsp144I Bsp145I Bsp146I Bsp148I

Bsp153AI

Bsp16I Bsp1720I Bsp19I Bsp24I Bsp2I Bsp30I

Bsp4009I Bsp46I Bsp4I Bsp508I Bsp68I

Bsp82I

Bsp84I Bsp87I Bsp98I BspBS31I BspCI BspDI

BspEI BspHI BspIS4I BspJ106I BspJII

BspKT8I

BspLU11I BspLU11II BspM39I BspM90I BspMI BspMII

BspO4I BspTI BspTS514I BspVI BspXI BsrBRI

BsrCI BsrDI BsrGI BsrXI BssGI BssSI

Bst1107I Bst1126I Bst170I Bst170II Bst2464I

Bst28I

Bst2902I Bst29I Bst2BI Bst30I Bst31I

Bst98I

BstBI BstBS32I BstBSI BstDI BstEII

BstFI

BstI BstLVI BstMI BstPI BstQI BstRI

BstSNI BstTI BstTS5I BstWI BstXI BstZ16I

BstZ2I BstZ3I BstZ6I BstZ8I BstZ9I

BstZI

Bsu15I Bsu22I Bsu23I Bsu36I Bsu8565I

Bsu8646I

Bsu90I BtgAI BtgAII BtuI BvuBI Cas2I

CauB3I CbiI CciNI CelI CelII CeqI

Cfr19I Cfr32I Cfr51I Cfr57I Cfr6I Cfr7I

Cfr92I Cfr9I CfrJ4I CglAI CglAII

ChuI

ClaI ClcII CliII CpoI Csp45I

Csp4I

CspAI CspBI CspI CvnI DdsI DmaI

DpaI DraI DraIII DrdI DrdIII

EaeAI

EagBI EagI Eam1105I EcaI Eci125I

EciAI

EciCI EciEI Ecl136II Ecl137I EclHKI

EclI

EclJI EclRI EclXI Eco105I Eco115I

Eco118I

Eco149I Eco158II Eco159I Eco178I Eco188I

Eco228I

Eco231I Eco237I Eco252I Eco255I Eco32I

Eco52I

Eco65I Eco72I Eco76I Eco81I Eco82I

Eco91I

Eco98I EcoICRI EcoNI EcoO128I EcoO65I

EcoRI

EcoRV EcoT22I EcoVIII ErhB9I Esp1396I

Esp16I

Esp19I Esp23I Esp3I Esp4I EspHK26I

EspI

FdiII FseI FspI FspII GdoI GinI

GoxI GseIII GspAII GspI HalI HgiCIII

HgiDII Hin1076III Hin173I Hin5III HinbIII

HindIII

HinfII HjaI HpaI HsuI KoxI KoyI

Kpl79I Kpn2I Kpn49kI KpnI KpnK14I

KspAI

KteAI LcaI Lmu60I LplI LspI MamI

MchAI MfeI MkiI MlaI MleI Mlu23I

Mlu31I Mlu9273I MluB2I MluI MluNI Mph1103I

MroI MscI Msp20I Msp23I MspCI MstI

MstII MunI Mva16I MvsAI MvsBI MvsCI

MvsDI MvsEI MvsI MwhI MxaI MziI

NanI NasBI NasSI NblI NcoI NcrI

NflAI NmeRI NmiI NopI NotI NruI

NsiCI NsiI Nsp29132I Nsp29132II NspBI NspFI

NspHIII NspJI NspLI NspMACI NspMI NspSAII

NspSAIII NspSAIV NspV OkrAI OxaNI Pac1110I

Pac1110II PacI Pae177I Pae18kI Pae2kI

PaeBI

PaeCI PaeI PamI Pfl16I Pfl18I

Pfl23I

Pfl23II PflMI Pfr12I PfuI PgaI Pgl34I

PinAI PinBI PinBII PinI PlaII Ple19I

PliI PmaCI PmeI PmlI PntI Ppu10I

Ppu111I Ppu1253I PpuAI PshAI PshBI PshCI

PshDI Psp124BI Psp1406I Psp30I Psp32I

Psp33I

Psp38I Psp3I Psp56I Psp5I Psp89I

PspAI

PspALI PspBI PspEI PspLI PspOMI

Psu161I

PtaI Pvu84I Pvu84II PvuHKUI PvuI PvuII

RcaI RflFI RflFII RhcI RheI RhpI

RhsI RleAI Rlu4I Rme21I Rrh4273I

RrhI

RroI RshI Rsp519II Rsp534I Rsp556I

RspI

RspXI RsrI RsrII RtrI SacI SalDI

SalI SanDI SapI Sau10I SauHI SauI

SbaI SbfI Sbo13I ScaI SciAI SciAII

ScoI SdiI SecIII SenPT16I SepI SfiI

SfuI SgfI Sgr1839I SgrAI SmaAI SmaAIII

SmaAIV SmaI SmiI Sna3286I SnaBI SnoI

Sol3335I SolI SpaHI SpaXI SpeI SphI

SplAI SplAIII SplAIV SplI SpoI SpvI

SrfI Sru4DI SruI SsbI Sse1825I

Sse8387I

Sse8647I SshAI SsoI Ssp152I Ssp1I Ssp27144I

Ssp4800I Ssp5230I SspBI SspI SspJI SspKI

SspM1I SspM2I SspRFI SsrI SstI SthAI

SthBI SthCI SthDI SthEI SthFI SthGI

SthHI SthI SthJI SthKI SthLI SthMI

SthNI SunI SurI SviI SwaI TaqII

Tsp504I Tsp507I Tsp514I Tsp515I Tsp8EI

Uba1094I

Uba1096I Uba1098I Uba1100I Uba1117I Uba1129I

Uba1133I

Uba1136I Uba1137I Uba1138I Uba1139I Uba1144I

Uba1145I

Uba1156I Uba1157I Uba1158I Uba1161I Uba1162I

Uba1163I

Uba1164II Uba1165I Uba1167I Uba1168I Uba1172I

Uba1173I

Uba1184II Uba1190I Uba1191I Uba1195I Uba1196I

Uba1197I

Uba1198I Uba1199I Uba1200I Uba1201I Uba1202I

Uba1203I

Uba1205I Uba1219I Uba1220I Uba1221I Uba1222I

Uba1224I

Uba1226I Uba1227I Uba1233I Uba1238I Uba1240I

Uba1241I

Uba1242I Uba1245I Uba1246I Uba1250I Uba1257I

Uba1258I

Uba1266I Uba1275I Uba1279I Uba1284I Uba1286I

Uba1289I

Uba1290I Uba1291I Uba1294I Uba1295I Uba1297I

Uba1299I

Uba1302I Uba1308I Uba1309I Uba1310I Uba1312I

Uba1313I

Uba1315I Uba1320I Uba1324I Uba1325I Uba1331I

Uba1332I

Uba1333I Uba1334I Uba1339I Uba1342I Uba1346I

Uba1366II

Uba1368I Uba1374I Uba1375I Uba1379I Uba1380I

Uba1383I

Uba1385I Uba1386I Uba1387I Uba1393I Uba1394I

Uba1398I

Uba1400I Uba1402I Uba1408II Uba1412I Uba1414I

Uba1416I

Uba1420I Uba1425I Uba1426I Uba1427I Uba1430I

Uba1435I

Uba1443I Uba1451I Uba1452I Uba1453I Uba19I

Uba22I

Uba24I Uba30I Uba31I Uba34I Uba38I

Uba43I

Uba51I Uba58I Uba6I Uba76I Uba83I

Uba85I

Uba86I Uba87I Uba88I Uba89I Uth506I

Uth536I

Uth558I Uth559I Van91I Van91II VanI VchN100I

VchO2I VchO49I VchO68I VchO70I VfiI Vha464I

VneI VpaK32I VpaK3AI VpaK3BI VspI XamI

XbaI XcaI XciI XcyI Xgl3216I

Xgl3217I

Xgl3218I Xgl3219I Xgl3220I XmaCI XmaI XmaIII

XmlAI XmlI XniI XorII Zsp2I

限制性内切酶：BamH I Bgl II

所以引物为F: BamH I 5'---GGT GCCGAGAGCG TGGGCTAC--3'

R: Bgl II 5'---GGTCTAGCTGGTC TCCTCCAG---3'

2、3表达载体构建的一般原则

（一）阅读框架与外源基因高效表达

（二）启动子与外源基因高效表达

（三）转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达

1.除去衰减子

2.插入抗转录终止序列

3.强转录终止序列

（四）有效地翻译起始与外源基因高效表达

（五）终止密码选择与外源基因高效表达

（六）外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达

1.构建融合基因，产生融合蛋白

2.构建成可分泌的蛋白

3.使外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达

2、4设计PCR配方表：参数表PCR

2.4.1 PCR参数表

利用高保真的pfu DNA 聚合酶进行PCR 反应

4种dNTP混合物各200μmol/L

引物各100 pmol

模板DNA 2μg

Tac DNA聚合酶 2.5μ

Mg2+ 1.5mmol/L

2.4.2 PCR工作参数表

Collagen DNA 片段PCR 反应条件: 95℃预变性5 min,95 ℃变性50 s, 60℃复性50 s, 72℃延伸50 s, 30 个循环, 72 ℃,延伸5 min。反应产物经过琼脂糖电泳鉴定正确后, 合并PCR 产物, 用氯仿抽提, 除去其中的pfu DNA 聚合酶。

1）初变性：95℃ 5min

2) 循环参数：a.变性 95℃ 50s

b.退火 60℃ 50s 循环30次

c.延伸 72℃ 50s

3）最后延伸 72℃ 5min

2、5转化与筛选

2.5.1 转化

大肠杆菌感受态细胞的制备

1）取5-10mlSOB液体培养基（不含Ampr）,加入新活化的宿主单菌落，37℃振荡培养过夜，直至对数生长后期，再将该菌液以1:50的比例接种于100mlSOB 液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.5左右。

2）将培养物于冰上放置10min后，分装成20ml/管，4℃下5000r/min离心

10min

,悬浮沉淀，置于冰上15min 3）弃上清，加约10ml预冷的100mmol/L CaCl

2

后，在4℃下5000r/min离心10min

4）弃上清，加约1ml预冷的100mmol/L CaCl2,轻轻悬浮，即为感受态细胞感受态细胞的转化效率在24h内最高，因此转化反应最好紧接其后进行。若不马上转化，感受态细胞应置于终浓度为15%的灭菌甘油内，-70℃可存1-2个月，-20℃可保存2-3周。

处理的大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴将重组质粒DNA分子同经过CaCl

2

中一段时间，在转移到42℃下做短暂（约90s）的热刺激后，迅速置于冰上，向其中加入非选择性的肉汤培养基，保温振荡培养一段时间（1-2h），使细菌恢复正常生长状态，以促使在转化过程中获得的新抗生素抗性基因得到充分表达

2.6重组子的鉴定

载体pET-30a在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源α-肽失活。载体pET-30a或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体pET-30a的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG 贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml。IPTG和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月。

蓝白斑选择原理

①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物；

②b-半乳糖苷酶与Xgal显色反应是通过b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝；

③lacZ的a肽互补：a-肽（lacZ? ）是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），lacZ只有在a-肽形成4聚体的状态下才有功能。若受体菌lacZ突变（lacZ?M15），b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。如受体菌株JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a等。而pUC质粒载体上的lacZ? 编码a肽与这个缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体的a-肽，故能分解Xgal。产生蓝色物质。

④a互补的插入失活：pUC载体上LacZ?的5…端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ?的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ?的合成。不能互补。

⑤IPTG的诱导作用：IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ?a肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生a肽。

⑥IPTG诱导的结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑，MCS有插入时，不互补，白菌斑（见下图）。

异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）可作为lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物X-gal 还可充作生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色.你的空载提转进去的话，IPTG诱导lacZ' 表达α肽，互补体内缺陷的酶，然后可降解底物X-gal，产生蓝斑；如果你则载体的多克隆位点插入了片段，导致编码的α肽错误，或者不能编码α肽，也就不能产生正常功能的酶，无法分解X-gal，所以长白斑。

?筛选

人们发现lacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15突变体的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段（α肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称做α互补（α-complementation）。

α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整

的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因发生突变，则

不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因（称为 lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。

在 lacZ' 编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响β-半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的β-

半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，lacZ△M15 放在 F 质粒上, 随宿主传代； lacZ' 放在载体上, 作为筛选标记。相应的受体菌有 JM 系列、 TG1 和 XL1-Blue ，前二者均带有 D （lac - proAB）F'[ proAB + lacIq lacZD M15] 基因型。其中 lacI 为 lac 阻抑物的编码基因，lacIq 突变使阻抑物产量增加，防止 lacZ 基因渗漏表达。

lacZ 基因是乳糖 lac 操纵子中编码β-半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。乳糖既是 lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物。异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物； 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）可作为 lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物 X-gal 还可充作生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色.

2、7鉴定后菌株的扩增与质粒的提取纯化

菌株的扩增

将白色菌斑用牙签接种到含有氨苄的液体培养基中，然后37℃过夜培养。

1.碱裂解法质粒提取的原理:

溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；

溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；

溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。

溶液I的作用

用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液控制好溶液的pH，加了葡萄糖后悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。

溶液II的作用

这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。SDS为下步做准备。

溶液III的作用

溶液III加入后就会有大量的沉淀，SDS使绝大部分蛋白质（包括核蛋白）沉淀了，这样基因组DNA与蛋白被去除。SDS并不与DNA分子结合。醋酸中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA。

2.实验方法：吸取培养液与离心管中，4℃离心弃上清，收集；加入溶液I，混匀，

使菌体悬浮，静置；

加入溶液II，温和混匀，冰中静置；

加溶液III，温和混匀，冰中静置。

4℃离心取上清，加等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，室温离心取上清；

纯化步骤同上。加入RNase水解RNA,37℃保温20--30min

电泳检测琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下看到三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。

三．表达载体构建

3、1表达载体分离与纯化

用凝胶电泳分离片段并用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

3、2基因重组

按如下所述设立连接反应混合物：

a．将0.1μl载体DNA转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源DNA。

b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到0℃。

c．加入：10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液１μl

T4噬菌体DNA连接酶 0.1Weiss单位

5mmol/L ATP 1μl

于16℃温育1-4小时

10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液

50mmol/K MgCl2

50mmol/L二硫苏糖醇

在外源目的基因同表达载体分子连接的基因重组过程中，一般需要考虑一下3个因素：

1）实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重组子筛选

2）重组DNA分子，应能被一定的限制性核酸内切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段

3）外源基因必须在表达载体DNA的启动子控制下，并置于正确的阅读框中，以便目的基因的高效表达

3、3转化、筛选

取新鲜感受态大肠杆菌200μl,加2μl连接物，混匀，冰上放置30min,42℃热休克30s，冰上放置2min,加入250μlSOC培养基，37℃ 200r/min振摇1h，

取40μl涂抗氨苄青霉素琼脂平板，37℃过夜。

3、4鉴定重组子

利用BamH I 和Bgl II进行双酶切鉴定 , 由琼脂糖电泳所示, 双酶切若可以得到一个1100 bp左右的片段, 与理论计算值符合, 初步确定质粒构建正确。

挑单个菌斑置3ml LB中，37℃ 200r/min振摇培养过夜，取菌液2μl进行PCR，上游引物:5’-，下游引物: 5’-，94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，进行30个循环.最后72℃延伸10min结束反应。PCR产物在15g/l琼脂糖凝胶上电泳，取2ml经菌落PCR鉴定的菌液，送公司测序。

3、5 表达产物分析检测

放射性抗体检测法

现在已被许多实验室广泛采用的放射性抗体测定法所依据的原理为：①一种免疫血清含有好几种IgG 抗体，它们识别抗原分子，并分别同各自识别的抗原相结合；②抗体分子抗体的Fab 部分，能够十分牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯等塑料制品)上，而不会被洗脱掉；③通过体外碘化作用，IgG 抗体便会迅速地被放射性同位素125I 标记上。在实际的测定中，首先把转化的菌落涂布在普通培养皿的琼脂平板上，同时，还必须制备影印的复制平板。因为在随后的操作过程中，涂布在普通培养平板上的转化菌落是要被杀死的。接着把细菌菌落溶解，这样便使阳性菌落释放出抗原蛋白质。将连接在固体支持物上的抗体缓慢地同溶解的细胞接触，以利于抗原吸附到抗体上，并且彼此结合成抗原—抗体复合物。然后，将这种吸附着抗原—抗体复合物的固体支持物取出来，与放射性标记的第二种抗体一道温育，以便检出这种复合物。未反应的抗体可以被漂洗掉，而抗原—抗体复合物的位置，则可通过放射自显影技术被测定出来，并据此确定出在原平板中能够合成抗原的细菌菌落的位置。

3、6 确定菌株

三、工程菌株的获得

4、1菌株培养

1．配制牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,NaCl 5g,琼脂 15～20g,水1000mL,pH7.4～7.6。

2. 大肠杆菌的培养 37摄氏度，恒温培养48到72小时，因为接种时和具体培养条件的不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落。

3. 菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。

4.2功能产品分离纯化

材料与方法

4.2.1 材料

4.2.1.1菌种

基因工程菌E. coli BL21 3. 1, 质粒pNWCP为本实验室构建并保存, 卡那抗性,

温度诱导。

4.2.1.2培养基

种子培养基为LB 培养基; 发酵培养基: (NH4 ) 2SO4 33. 6 g, K2HPO4 # 3H2O 52. 66 g,EDTA 5. 88 g, 微量元素6mL, 葡萄糖180 g, 酵母粉180 g, Kanamycin 0. 03 g, H2O 6L; 补料培养基为3倍浓缩的发酵培养基。

4.2.1.3试剂

DEAE52 (Wa lkman 公司产品);Sephadex G-100, 丙烯酰胺, 甲叉双丙烯酰胺, SDS,Tr is(华美公司); 其他为国产分析纯试剂。

4.2.1.4仪器

超声波细胞破碎仪( JY98-Ⅲ宁波新芝仪器研究所) ; 超滤系统(美国Pall公司) ; 离子交换层析系统; 凝胶过滤层析系统(华美公司) ; 电泳仪(M in-iProteinⅡ美国B ioRad)。

4.2.2方法

4.2.2.1高密度发酵

将新鲜种子从平板内接入含50mL LB 培养基的300 mL摇瓶中, 在34e 以200r/m in培养10 h, 再按8% (体积分数)接入二级种子。同样条件下, 培养6 h后按8% (体积分数)接种量接入B ioeng ineering L1 523型12. 8 L自控发酵罐, 培养16 h后调节温度至42e 开始诱导, 3 h后降温至39e 继续诱导5 h。培养过程中流加25% (质量分数)氨水维持pH值到6. 8左右, 调节转速和空气流量使溶氧饱和度维持在30% 左右, 用聚醚控制发酵中的泡沫, 按设定的补料方程式流加补料培养基。

4.2. 2. 2 胶原蛋白的粗分离

发酵液离心收集菌体, 用蒸馏水洗3次, 以质液比1B3(质量比)把菌体悬浮在细胞破碎缓冲液( 1 mmo l/L EDTA,5 mmo l/LT ris) 中, 超声破碎15 m in。破碎液于18e , 5 000 r/m in离心1 h, 收集上清液。上清液用硫酸铵分级沉淀, 收取15% ~ 65% 饱和度的蛋白沉淀溶于20 mmo l /L T ris-HCl ( pH 值为8. 0)的缓冲液, 用截留分子质量为30 ku的超滤膜包进行脱盐、浓缩。

4.2.2. 3 离子交换层析

经粗分离的上清液在不同pH 值条件下分别过DEAE52( 5 2 cm @ 24 cm )柱和CM52( 5 2 cm @ 24 cm )柱, 比较阴、阳离子交换层析, 并选取最佳pH值。

4.2.2.4 凝胶过滤层析

经离子交换层析的样品再过Sephadex G-100( 5 10 @ 100 cm )柱, 用20 mmo l /LTris-HC l( pH 值为7. 5)缓冲液作为洗脱液。

4.3 测定方法

纯度测定采用7. 5% (质量分数) SDS-PAGE (变性聚丙烯酸胺凝胶电泳)的Laemm li法。总蛋白浓度测定采用B radford 法, 以牛血清白蛋白为基准。类人Ⅰ型胶原蛋白浓度测定使用羟脯氨酸测定法。羟脯氨酸为类人胶原蛋白Ⅰ的特征氨基酸, 约占其总量(物质的量)的8%, 因此, 可将类人Ⅰ型胶原蛋白水解后用分光光度法测定羟脯氨酸的浓度, 羟脯氨酸的浓度除以8% 即为胶原蛋白的浓度。

4.4功能研究

使骨骼坚硬且有弹性。胶原蛋白能使得钙质与骨细胞结合, 不致流失。胶原蛋白在体内可以使骨骼与肌肉相联。骨与骨相连接部分, 如膝盖、关节等软骨组织主要成分也是胶原蛋白, 使得运动时筋骨可保持柔软并具有弹性。此外, 牙齿的坚硬而富有弹性也与胶原蛋白密不可分。

使肌肉细胞互相连接, 并使其富有弹性和光泽。肌肉主要由肌纤蛋白及肌球蛋白构成, 而胶原蛋白则可以使细胞与细胞进行粘合, 同时也是身体构成材料之一。胶原蛋白分子所形成的立体骨架可以使身体保持良好姿势, 并呈现适当柔软度。

4.5培养条件的优化

5 发酵工程

5.1设备

发酵罐:B.Braun Biostat 5L、15L、150L,摇床NBS产品

5.2试剂

蛋白胨,酶母抽提粉,系Difco,Sigma,Oxoid.日本产品。葡萄糖,CaCl2,MgSO4,(NH4)2SO4,NaOH,NaCl,Na2HPO4,KH2PO4,CoCl3,FeCl3,Ni(NO3) 3及泡敌,皆系国产品。

5.3摇瓶种子培养

种子培养液(g/L)含蛋白胨10,酵母抽提粉5,pH7.0、0.2mol/L,磷酸缓冲液20ml,1000ml三角瓶中含250ml种子培养液,120℃灭菌20min,冷却后加20%葡萄糖液5ml,接种低温保存的甘油管种子1ml,加氨苄青霉素最后浓度为50μg/ml,37℃,200 r/min培养。12~14h作为发酵罐的种子

5.4发酵罐

发酵液(g/L)含蛋白胨20,酵母抽提粉10, 0.2mol/L pH7.0磷酸缓冲液20ml 及微量元素,CaCl2,Ni(NO4)3,CoCl3,MgSO4,FeCl3浓度各为1mg,120℃灭菌20min,冷却至37℃后,加氨苄青霉素50mg,泡敌及种子培养液20ml,加20%葡萄糖5ml以2mol/LNaOH,2mol/L HCl维持pH 6.8-7.2,进行发酵,发酵条件如下:

温度37℃,PL30→42℃,搅拌500 r/min,pH 6.8~7.2,通气量V/ Vmin,DO250%。

5.5细菌浓度测定

间隔一定时间各取1ml发酵液置于2个塑料离心管中,8000 r/min离心10min,除去上清液,称取菌体重量为湿重。也可适当稀释,测定在600nm菌体光密度(OD),但需注意不同波长,不同公司分光光度计产品光密度测定值难以比较。

6.菌种的分离与纯化

7、市场推广策略

我认为三个环境要素的形成，可以加速了胶原蛋白的市场普及：

一、国内企业不断加入市场竞争，推出含量更高，价位更低的产品，开发和抢胶原蛋白夺金字塔的中下层消费者；