实验讲义-分光光度法测量溶液中色素含量

分光光度法测量溶液中色素含量

一、引言（实验背景）

在物质检测分析领域，对样品测试时往往直接采用化学方法，或先采用化学方法预处理后再采用物理方法进行测试分析，这样都要采用化学试剂，对环境造成二次污染。而纯物理方法在整个测量过程没有化学反应，更多依赖于物理手段和数学处理来解决问题，符合环境友好型社会的发展需求，受到国家的重视和社会各界的欢迎。随着测试方法的转变，人才需求也随之发生转变。以往利用化学分析方法进行物质检测分析，需要大批量化学、生物相关专业人才。而随着物理测试方法的广泛采用，光学、光电专业人才需求越来越大。为了顺应社会需求，适应形势变化，光学、光电专业学生不仅要掌握制造分光光度计的技术，还要创新使用方法，通过实验训练积累知识和经验，以便达到社会人才需求标准，为推动社会的技术进步和发展作贡献。

二、实验目的与内容

食品中常添加色素使外观好看而吸引消费者，特别是食品饮料中常常使用人工色素配制成各种颜色。而毒理学证明化学合成色素有不同程度的毒性，有的甚至可致癌。各国相继制订了法规，对食品中合成色素的使用做了限量规定。本实验目的就是要采用光学方法测出溶液中常用的色素含量。

溶液中常使用三种色素显示黄色、橙色或红色：柠檬黄、日落黄和胭脂红，本实验要求：

（1）实验前一周进行预习查资料，设计出使用分光光度计同时测出溶液中柠檬黄、日落黄和胭脂红的含量的实验方案，实验方案包括：1）实验所需条件，包括仪器设备、材料试剂、工具器材等；2）配制哪些溶液？测量哪些数据？并设计好记录数据的表格以及主要实验步骤（注：分光光度计输出的数据量较大，每个样品的测量结果以文件形式保存，请先拟好文件名，填入表格，以免搞错）；3）由实验数据计算柠檬黄、日落黄和胭脂红的含量的方法，并说明所需使用的软件或拟编写的程序。实验设计方案至少提前一天（需要特殊材料的方案须提前一周）交给任课老师审阅，通过审阅后方可进行实验。

(2) 实验时，按照所设计实验方案，配制所需溶液，并使用分光光度计测出相应的光谱数

据；数据记录单须交老师审查签字。

(3) 实验结束后按数据处理要求进行数据处理，一周内上交实验报告，实验报告 包括实验

方案、实验原始数据、数据处理结论及误差分析、思考题。

三、实验原理

分光光度法是根据物质对不同波长的单色光的吸收程度不同而对物质进行

定性和定量分析的方法，常采用吸收光谱曲线来进行分析。所谓吸收光谱曲线， 即将不同波长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，

分别测出它们对各

种波长光的吸收程度(用吸光度 A 表示)，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标 作图所画出曲线。由于溶液对不同波长的光的吸收程度是不同， 不同溶液的吸收 曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同， 如图1所示，可以作为定性分析的基 础。

图1不同溶液的光谱吸收曲线

1760年，朗伯通过研究后指出：如果溶液的浓度一定，则光对物质的吸收 程度与它

通过的溶液厚度成正比

A - lg - K o b

A 为吸光度；I o 为入射光强度；I 为透射光强度；b 为液层厚度；K o 为比例常数。

1852年，比耳(Beer)提出光的吸收和光所遇到的吸收物质数量有关；

即当单

色光通过液层厚度一定的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度成正比

A = lg —— = K i C

(2)

2

A

A为吸光度；I o为入射光强度；I为透射光强度；C为溶液的浓度；K i为比例常数。

将朗伯(Lambert)定律和比耳(Beer)定律合并，则为朗伯-比耳(Lambert- Beer) 定律

A =lg 匕=lg 丄i bC

I T

式中：A为吸光度；T为透射率；b为液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；C为溶液的浓度，一般为物质的摩尔浓度，单位为mol ?L-1; &为摩尔吸光系数，单位L ? mol-1? cm-1；

(注意：吸光系数有三种表示方式：摩尔吸光系数，单位L mol-1c m-1，对应浓度单位为mol/L ;吸光系数，单位L g -cm -1，对应浓度单位为g/L;比吸光系数，单位100mL ? g -cm -1，对应浓度单位为g/1OOmL。)

需要说明的是，(3)式中的比例系数&对不同波长的光，其值是不同的，所以吸光度A 随波长呈变化的曲线。同一溶液，不同浓度，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样，根据朗伯-比耳定律，其吸光度与溶液浓度成正比，如图2所示，可利用吸收曲线结合吸光度对溶液物质含量进行定量分析。

图2同溶液不同浓度光谱吸收曲线

所以，对于单组分溶液，根据最大吸收峰处的吸光度，即可算出溶液中该

物质的浓度。具体方法是：先配制已知浓度的溶液，测出吸光度，根据（3）式计算出吸光系数；而后再测待测样品的吸光度，由（3）式计算样品的浓度。

对于多组分溶液，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加和性，根

据朗伯-比耳定律有：

n

；心& ⑷

i

如各组分光谱有叠加，则通过解联立方程组可以确定各组分的浓度。以三组分混合液为例，先用混合液绘制出吸收光谱，再分别用其中的每单一组分绘制出各自的吸收光谱，而后根据所测三条吸收谱线选择三个合适的波长，在这三个波长处

对混合物样品进行测定，其方程式如下：

A] = ；ii bC i ■ jbC? ■ ；13?。3 ⑸

A2 =；21bG ；22bC2；23bC3⑹

A3 = ；3i bC] ■ ；32匕。2 * 二33匕。3

应用行列式克莱姆法则，则可计算获得C l、C2、C3。同一物质，不同的测试波长有不同的摩尔吸收系数，即有不同的灵敏度，由于实际实验有误差，吸光度较小处相对误差较大，而最大吸收波长处的摩尔吸光系数最大，分析测试的灵敏度最高，且最大吸收波长处吸光度绝对误差A变化最小，所以三个波长分别选在

三种物质的吸收峰处较合适。当用分光光度计进行测量时，一般会对波长进行扫描，即同时给出许多波长下的测量值，这时为了充分利用现有数据减小误差，可采用最小二乘法对数据进行处理（参考附录3）。

一般情况下，采用分光光度法对某种物质进行测量时，物质的吸光系数是未知的，为了获取物质的吸光系数，常用下列方法：

绝对法：选择待测物质的吸收峰波长，通过书刊、手册查阅待测物质在吸收峰波长处吸光系数，利用实验所得的吸光度或透射率或反射率计算获得待测物质浓度。

标准对照法：在同样的条件下配制标准溶液及试样溶液，在所选波长处分别

测量吸光度，获得标准溶液及试样溶液的A标及A样，通过△标二￡标获得样品

A样C样

浓度

标准曲线法：配制一系列已知具有不同浓度的标准溶液，分别在选定波长处测其吸光度A，然后以标准溶液的浓度C为横坐标，以相应的吸光度A为纵坐标，绘制A-C关系图，获得标准曲线和标准关系方程。在相同条件下测量样品溶液的吸光度，根据标准曲线和标准关系方程即可获得样品溶液浓度。

标准加入法：在样品溶液中加入已知具有不同浓度的标准溶液，分别在选定波长处测量其吸光度，根据吸光度变化量和所加已知具有不同浓度的标准溶液浓度变化量的关系，进而获得样品待测物含量。

分光光度计是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，它主要由光源、单色器、吸收池、检测器、信息显示系统组成。分光光度计结构组成框图如图3所示。

光源

图3分光光度计结构框图

光源主要提供符合要求的入射光，较常用氘灯（165-375 nm）和钨灯（320-

250Onm）。单色器是将光源发射的复合光分解成连续光谱并可从中选出任一波长单色光的光学系统，主要由狭缝、色散元件（棱镜、光栅）和透镜系统组成。吸收池又叫比色皿，是用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件，主要有石

英吸收池和玻璃吸收池两种。检测器是利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号的器件，常用的有硒光电池、光电管、光电倍增管等。

四、实验仪器和试剂

仪器：

UV-4501S紫外可见分光光度计，TU1901紫外可见分光光度计（带两个1cm 石英比色皿）；基本操作步骤见附录1。

电子天平；

容量瓶、移液管、烧杯等玻璃仪器。

试剂：

柠檬黄、日落黄、胭脂红（试剂说明见附录2）；乙酸铵；光学纯水;

五、思考题

(1) 分光光度计有哪些类型？分别有什么特点？

(2) 测定过程中产生误差的原因有哪些，并简要进行分析？注意事项：

(1) 在配制所需浓度溶液过程中，天平读数要精确；玻璃仪器要轻拿轻放，配制完后，清

洗干净放回原处。

(2) 所配制溶液浓度在最大吸收波长处吸光度最佳范围为0.2~0.8，相当于本实验

所用溶液浓度范围为20~200卩g/mL浓度高低也可以用一定体积(与使用的容量瓶有关，如100mL)中含储备液多少来表示(如1mL, 3mL等)，可称“体积浓度”。

等数据处理完成后，再将它转换成标准浓度单位。

(3) 在一次测量完成后，比色皿须经光学纯水清洗，待测浓度溶液清洗后，再加入待测溶

液进行测试。

(4) 分光光度计测量常常涉及数十个甚至上千个波长数据，要想利用好这些数据，就可能

要解数目巨大的方程组，所以仅靠手工计算是不可能的，需要编程计算或利用软件计算。本实验提供VB 编写的计算软件程序或自行采用MATLAB 软件或其他软件进行计算。

附录1：光谱仪基本操作步骤

(1) 开机，仪器参数设置：

1) 打开分光光度计电源开关，预热约20min；

2) 在Windows 操作系统下启动光谱仪程序，待计算机与光谱仪通讯成功，可进入

主工作程序；

3) 选择附属功能-狭缝设置设定狭缝宽度。狭缝宽度过大时，入射光的单色光降

低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，仪器的

增益提高，仪器噪声增大，于测量不利。

4) 选择附属功能-波长设置设定波长范围，波长范围太大，测试时间太长，并增加

数据处理量，增加误差；波长范围太小，不能完全覆盖物质的吸收光谱宽度，测

试数据不全，增加测量误差；因而选择合适的波长范围，可以有效减少误差。

5) 选择测试-波长扫描进入波长扫描界面-模式选择吸光度或透射率；

6) 选择测试-波长扫描进入波长扫描界面-参数设置对扫描次数、扫描速度、起止

波长、坐标上下限进行设定；

7) 在参考通道与物光通道分别插入装有蒸馏水的石英比色皿，盖好防尘盖，选择附

属功能-建立基线进行基线扫描。

(2) 关机测量工作结束后，退出系统。先关闭系统软件，再关闭分光光度计。取出分光光度计内参考通道和物光通道比色皿分别清洗干净后交老师收存。拷贝好实验数据后，退出Windows 操作系统，关闭电源。

附录2试剂说明

⑴柠檬黄（酒石黄，Tartrazine ）

柠檬黄是3-羧基-5-羧基-1-（对磺苯基）-4-（对磺苯基偶氮）邻氮茂的三钠盐，属 单偶氮类色素，结构式如下：

HO —C —

II

N= N 一C \ “

C

COONa

柠檬黄外观为橙黄色粉末，易溶于水、甘油、丙二醇、微溶于乙醇，不溶于油脂， 对热、酸、光及盐均稳定，耐氧性差，遇碱变红色，还原时褪色。最大使用量 O.1g/kg ，最大吸收波长426nm

（2）日落黄（Sunset Yellow ）

日落黄是1-（对磺酸苯基偶氮）-2-萘酚-6-磺酸二钠盐，属单偶氮类色素，结构 式如下：

其外观为橙红色粉末，易溶于水、甘油、丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂。最 大使用量0.1g/kg ，最大吸收波长482nm

（3）胭脂红（丽春红4R , Ponceau 4R ）

胭脂红是1-（ 4'-磺基-1'-萘偶氮）-2-萘酚-6,8-二磺酸的三钠盐，属单偶氮类色 素，结构式如下

:

S03Na

NaO 3S

NaO 3S N= N

NaO 3 S

SO3 Na 其外观为红色粉末，易溶于水、甘油，微溶于乙醇和乙二醇一乙醚混合溶液最大使用量0.05 g/kg，最大吸收波长508nm。

柠檬黄、日落黄和胭脂红的光谱吸收曲线如图4所示

度

光

吸

图4柠檬黄、日落黄和胭脂红的光谱吸收曲线

附录3最小二乘法

当在实验中测得自变量X 与因变量y 的n 个对应X 1,X ^ X n ,y 1 ，

2

使y i —f X i (称为残差)的平方和最小，即：a ly -f 人I - min(最小)，这种 i 二 求f x 的方法，称为最小二乘法。

设函数残差为S ,则所得的残差线性方程组如(1)式所示:

S = y i - an X i ■ a i2 X 2 ■ a i n x n

S 2 = y 2 - a 21 X i ■ &22X 2 " “““ a 2n X n S n 二 y n - a n 1X 1 ' Q n2X 2 '…"an X n

根据数学分析知，欲使残差的平方和

S 取值最小，要满足的条件是

S

S

—=0，…亠=0，且其二阶导数大于0。经整理得: X 2 rx n

满足最小二乘条件，则有：

n

n n

X 1 ?— a im a i1

x 2 ?— a im a i2 x m ■— a im a im

i =1 i =1

i =1

X 1,X 2 X n ,y 2，…,X 1,X 2 X n ,

y n 时，要找出已知类型的函数关系 y 二f X ,

空=0， jx 1

S i 2

i 吕

CX 1 (n 2)

a z Si 2

I

3壬丿

&2

■n r n n n

\\

-2 |

送

a i1 y

i —

x^

X a i1 a i1 + X 2瓦 a i1a i2 卄 + x 11 入a i1a im

2

1 i 丝

7 \=1 Ji

_n

n

n

n

.匡 a i2y i -

X

^ a i2a i1

+ X 2迟 a i2a i2 + …

+ X

m ￡ a i2 a im 2

i=1

◎ 丿」

(n

J

a z Si 2 I 2 丿 -x m 对(1)式中各方程求二阶偏导数恒为正, n i1

I n

=一2 匡 a im y i - 洛￡ a im a

_i^

卜。

因而(1)式中各方程求得的极值为最小值,

n

n

X 2 ?— a im a i2

X m ?_ a im

a

im

iW

i=1

n

' a^y i

i

经

n

—a i2 y i

i =1

—Xi

》a^a

i1

i =1 n

X 1 二 a i2a i1 ■ 2 a i2a i2 i d

n

n

X 2 J a i1a i2

X m J a i1a im

i =1 i =1 n

n

X 2 二 3)2曰2 ?

' X m 二 a i2a im

i d

i =1

n ■— a im y i i

』

=0 - 2 =0 (2)

(3) 式称为最小二乘法估计的正规方程。将正规方程写成矩阵形式，可表示为：

A T Y—A T AX=O (4) 整理(4)式有

A T AX=A T Y(5) 对(5)式两边分别左乘A T A J，可得到正规方程的解为：

参考文献

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社,1983

[2] 李昌厚.紫外可见分光光度计[M].北京:化学工业出版社,2005

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⑹费业泰.误差理论与数据处理(第六版)[M].北京:机械工业出版社,2010,6