液质联用操作规程

本设备配备ACQUITYJPLC液相色谱仪、TQSMS/MS质谱仪，适用于食品、药

品中各种有机物的定性、定量分析，是一种具有高灵敏度的检测仪器，仪器由主机、计算机和数据处理软件等组成。

2.职责

2.1操作人员按照本规程操作仪器，认真填写实验使用记录。

2.2保管人员负责对仪器进行定期维护和保养。

2.3科室负责人负责监督检查规程的执行。

3 ?操作程序

日常操作步骤：

准备UPLC―>设置样品表一-> 运行样品一-定量一-打印报告。

注：如果一个星期内不运行样品请不要关质谱仪，使其保持真空。

建立新方法和project的操作步骤：

准备UPLC—建立新的project —用标准品调谐—编辑质谱方法—编辑UPLC方法一-设置样品表一-运行样品一-定量一-> 打印报告。

3.1开机：

3.1.1彻底开机顺序（仪器已关闭）

确定MS及其它仪器电源电缆已连接，开氮气发生器、开氩气，小表<0.1mpa。

打开计算机电源> 等待windows正常启动>电脑界面右下角网络图标红叉。

打开UPLC自动进样器电源，等到电脑界面右下角网络图标出现感叹号！。

打开UPLC泵电源，等约30s或者是有响声。

打开质谱电源，等待5min，离子源透视镜里面亮。

打开Masslynx软件，masslynx主界面——左侧instrument----Mass tune---界面菜单栏vacuum-pump 同样界面左侧偏上diagnostics---vacuum---analyser MS1 turbo speed]%要在5分钟内升到80。至少抽真空4个小时> 查看真空状态主界面mass console--~ 面左侧xevo tq ms detector力卩号展开---ms display > 碰撞室真空度>达

至U 7.x e-5mbar。

3.1.2日常开机顺序（仪器未关闭）

开氮气发生器、开氩气，小表<0.1mpa,打开Masslynx软件，进入工作站。

3.2建立项目

点击file下的project wizard ，出现对话框，单击yes出现对话框，输入

project ,location 为C:\MS DATA单击next ,选择create existing project as template, 并以c:\masslynx'default.pro 为模板，单击finish .点击OK。

3.3准备UPLC系统

准备液相的一般流程：准备流动相>准备样品>灌注二元泵> 灌注自动进样器> 建立液相方法> 平衡液相

3.3.1. 准备流动相

用0.22um的膜过滤缓冲液，所有的缓冲液和超纯水都要新配制，超纯水和缓冲液

使用不得超过二天，缓冲盐一定要是可挥发的，而且浓度不要大于10mM。

3.3.2. 样品要求

所有样品都要用流动相初始梯度比例的溶剂来溶解，并用0.22um的膜过滤。

3.3.3灌注二元泵

在Massly nx主界面，单击MS Con sole进入UPLC交互显示界面，点击左栏Acquity UPLC System> Control > Start Up System单击QSM，选择需要用到的流动相位置，如A和B，选择seal wash,时间设为3分钟。

单击SM，选择Strong Wash 5 cycles , Sample syringe 20

单击Equilibrate to Method，将流速设为0 ,单击Start开始灌注.时间大约为9min 左右。

设定流速，平衡液相

在Masslynx主界面，单击Inlet Method图标，打开液相方法编辑窗口，单击status >

ACQUITY Additional Status,进入液相控制台，单击A或B或流速的位置，出现流速、比例设定对话框，设定液相流速与比例，单击对勾，开始平衡液相，如果后面要做调谐，可设定流速0.2ml/min,有机相与水相的比例为50:50。

3.4准备质谱

341.计算化合物单同位素质量数

Masslynx主界面> 单击Tools〉Molecular Weight Calculator,输入化合物的分子式

（大写-注意C、Br等正确的输入方法）,注意选单同位素Mono iso ,lo n Mode:离子

化模式，+ve正离子，-ve负离子，单击Calculate

3.4.2用Intellistart进行自动调谐

在Masslynx主界面单击MS Tune图标，打开调谐窗口，

单击Ion Mode> ES+或ES-，单击API Gas图标打开氮气，单击打开高压

选择MS Mode图标，设定液相流速0.2ml/min,水：乙腈的比例为50:50。

把标准品调谐液放入质谱仪塑料瓶位置处的 A （或B或C）号位（注:浓度在200ppb 左右）

单击Fluidics 选择Reservoir为 A ,Flow State 为LC 模式，点击Purge 图标。Purge 结束后，将Flow State 改为Combine 模式，设定Function 为MS1 scan, Mass为计算出化合物的质量数，span为5，点击进样，开始进样，直到离子的响应比较稳定。

保存调谐文件：File > Save A至已建的项目下。

在Masslynx主界面，选择Ms Console> Xevo TQ MS Detector 选择Intellistart，选择Sample Tune and Develop Method，ES+ 单击Start图标，出现Intellistart自动调谐编辑窗口，选择Switch to Advaneed mode，输入Compound name 化合物名称），Molecular Mass/Formula （分子量或分子式）Adduct A+（[ M+H] +，选择Load Existing Sample Tune，在Sample Tune Name方框后的“。。。”处调用开始保存的调谐文件，在Develop MRM Method前的方框打钩，并在方框出输入MRM方法的文件名，路径为已建的项目下。在Print Report 前方框打钩，Cone Voltage，Collision Energy 处为默认值，Fluidics 下的Flow Path 选择Combined 模式，Sample

Reservoir 和Sample Flow Rate参数与Fuldics下Combined模式下的进样参数保持一致。单击右边的Start开始自动调谐。调谐成功，会有绿勾出现，查看intellistart报告

343 查看intellistart中自动生成的质谱方法：

从MassLynx主窗口，单击MS Method,出现MS Method编辑对话框,选择File > open,选择Intellistart中保存的质谱方法的文件，双击方法，如发现自动调谐生产的质谱方法中部分参数有误，则可以在Cha nn els窗口手动修改参数，填写relentinon window中的end时间，此时间必须与液相色谱方法运行时间保持一致，选择Auto Dwell,单击OK，点击File> Save As,保存质谱方法文件。

3.5建立液相方法

3.5.1编辑液相方法

在液相方法编辑窗口，单击Inlet，输入溶剂名称，run time及梯度洗脱程序，

梯度洗脱程序中最后阶段时间必须与run time符合，单击OK,选择File > Save As 保存方法，单击Load Method，平衡液相。

3.5.2建立样品列表

在Masslynx主窗口，选择File > New建立一个空白的表samplelist。输入文件名File Name，样品信息File Text，双击MS File，选择质谱方法，双击Inlet File, 选择液相方法，在Bottle中输入样品瓶的位置，在Inject Volume中输入进样体积，可右键> Add,增加样品表的行数，保存样品表：File > Save As。

3.6数据采集和处理

3.6.1.选中要采集的样品，单击Run > Start选择Acquire Sample Data only”单击OK 开始进样并采集。

3.6.2在采集过程中，可查看色谱图，点击Chromatogram窗口，点击Real-time Update icon .如果不能见整个TIC图，单击Default Range图标。

如果方法中包括多个通道，可通过Display > Mass查看

如果方法中包括多个检测器或多个Function,可通过Display > TIC查看

3.6.3处理多个Function的数据

如果质谱方法中有多个Function，如有三个Function，如想看第二个Function，MS Sca n的数据。

3.631在色谱图窗口，点击Display > TIC选中MS Scan ,选择Add trace，单击OK。

3.6.3.2如想查第二个Function. Daughter Scan质谱图，在色谱图中，选择Display > TIC,选择ScanWaveDS Add trace，单击OK=

3.6.3.3.选择Process > Combine spectra分别用右键输入信号和本底噪音.单击OK.得到Daughter Scan的质谱图，单击Process > Smooth ?，单击OK。

3.7数据处理-外标定量法

3.7.1在Masslynx主页面单击Targetlynx/Edit method，出现定量方法编辑对话框，单击新建方法图标，新建一个定量方法。

3.7.2单击Add new compound （添加新的化合物）图标，添加一个新的化合物。

3.7.3 单击菜单栏update,选中Quantitation Ion 和Compound Name （前面打勾）

在Masslynx主页面，打开中等偏下低浓度标准品的色谱图，Display/Mass chromatogram选出要定量的化合物的离子对，一般强度高的化合物用来做为定量离子，另一个离子对则作为确证离子，用鼠标右键在定量离子对色谱图上拉一下，贝U compound name, Acquisition Function Number, Quantification Trace, Predicted Retention Time和Retention Time window 将自动输入到定量方法中。注意：在色谱图上拉的时候，要遵循两个原则，拉的位置要以色谱峰的峰尖左右对称，拉的宽度要超过峰的起点和终点。

3.7.4单击工作曲线图标，在工作曲线设置页面，填入

Concen trati on Un its:浓度单位，例女口n g/ml, ug/kg，ppb, ppm 等。Concentration of Standard: Level—选择ConcA

Poly no mial Type—选择Lin ear.（可根据自己行业的规定）

Calibration Origin卫择exclude排除原点），include（包含原点），force（强制过原点） Weitht ing Fu nctio n（权重）_1/x （根据自己行业规定）

Propagate Calibratio n Parameters如果所有的化合物均用相同的工作曲线的参数，选Yes

3.7.5打开积分参数列表，选中Apex Track Enabled （打勾，YES, Integration Window Extent 输入2,选中Propagate Integration Parameters 打勾），如果色谱峰并不是很对称的色谱图，可先在色谱图上先设定参数，积分，好积分参数满意之后，process/integrate…/copy，在Targetlynx 方法中Edit/Past 就可将其粘贴到Targetlynx方法中。建议用Apex Track积分方法，Smooth方法建议用smooth iteration 1,smooth width 2。重复上面的过程，把其他几个化合物的信息全部加入，保存方法：File/Save As,保存到当前项目的MethDB文件夹中，正确的samplelist 表格模板，除了前面进样时的选项之外，还要有sample type, ConA,等选中要处理的样品，单击Process Samples出现下图的对话框，确保选中，Integrate、sample ，calibrate Standard, Quantify Sample选择刚才编辑的Targetlynx 方法，单击OK后, 出现定量结果对话框。可根据自己的需要，用鼠标右键，Cha ng Column Order来增加或减少Summary中的选项。

3.8关机程序

3.8.1日常关机：

381.1如果流动相中有缓冲盐必须先将缓冲盐换成水，灌注2分钟，流速设为

0.2ml/min，80%水相，冲洗至少30分钟，换成80%有机相，冲洗至少20分钟，停流速，水相，冲洗至少30分钟，换成80%有机相，冲洗至少20分钟，停流速，柱温为室温。

3.8.1.2关质谱：主界面mass tune或者电脑下面仪器图标一界面左侧偏上fluidics---flow state选择为waste、关氩气，mass tune界面或者电脑下面仪器图标工具栏第6个＞关高压mass tune界面右下角＞等待去溶剂气温度降低至100度以下mass tune界面或者电脑下面仪器图标左侧偏上。

ES+source——temperature---desolvation ＞关氮气，点击氮气发生器开启开关。

3.8.2彻底关机

3.8.2.1先完成日常关机

3.822泄真空：tune page > vacuum > vent---yes >等待涡轮分子泵转速降到10以

下 ,masslynx主界面——左侧instrument----Mass tune---界面左侧偏上diag no stics---vacuum---source turbo speed]%]

3.8.2.3退出软件，其他界面先退出，主界面最后退出

3.8.2.4关质谱电源> 关所有UPLC电源，计算机电源，仪器三个电源顺序无所谓，关氮气发生器，氩气。

3.8.2.5如果有UPS关闭UPS电源，计算机电源。

4日常维护、保养及注意事项

4.1仪器室要保持整洁、干净、无尘；配套设施布局合理。

4.2仪器室温度应相对稳定，一般应控制在20-25 C,保持恒温；相对湿度最好为50-70%,室内应备有温度计和湿度计，一般采用空调和吸湿机调节温度和湿度。

4.3气压过滤机械泵油，停止样品采集、停止流动相、关闭高压、关闭所有气流, 关闭离子源内的真空隔离阀。用一字镙丝刀顺时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast阀四分之一圈，运行30分钟后再把Gas Ballast阀旋转到原来关闭的位置。对于ESI源，至少每星期做一次，对于APCI源，每天做一次。

4.4开高压之前一定要先开氮气，关氮气之前一定要先关高压。

4.5 ESI离子化与溶剂密切相关，在使用某些溶剂和添加物需要注意以下几个方

面：三氟乙酸(TFA多用于蛋白质和多肽分析，但对ESI离子化有抑制效应；三乙胺(TEA在m/z 102处有较强的[M+H]+峰，有可能会抑制某些碱性化合物在正离子ESI条件下的离子化，也有可能会增强某些碱性化合物在负离子ESI条件下

的响应；

4.6 要避免使用非挥发性的盐(phosphate, borate, citrate, etc.) ;表面活

性剂、清洁剂和去污剂(会抑制离子化)；以及无机酸(sulphuric acid, phosphoric acid