蛋白质的提取的两种常用方法
蛋白质的提取的两种常用方法
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大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
沉淀蛋白质的常用方法
沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤） TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面： 一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。 制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态
蛋白提取步骤
提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。
细胞总蛋白提取方法
细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×
6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）
蛋白质提取方法
蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
蛋白质的分离纯化方法(参考资料)
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如
中图版高中生物选修1 6.1蛋白质的提取和分离_教案设计1
蛋白质的提取和分离 【教学目标】 1．知道蛋白质分离和提取技术的基本原理。 2．能进行血清蛋白的提取和分离。 3．尝试提取和检测牛奶中的酪蛋白。 4．尝试卵清蛋白的分离。 【教学重难点】 1．知道蛋白质分离和提取技术的基本原理。 2．能进行血清蛋白的提取和分离。 【教学过程】 一、蛋白质分离提纯技术 1．将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离，就可以得到高纯度的、甚至是单一种类的蛋白质。 2．蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中，电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。 二、电泳技术及分离蛋白质的原理 1．电泳现象：带电粒子在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。电泳常用的支持物是聚丙烯酰胺凝胶，由此而来的技术称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2．电泳技术分离蛋白质的原理： （1）蛋白质含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。 （2）蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，则移动越快。 （3）不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质。将这些带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液中的蛋白质做进一步的分离。如果待测洗脱液不能再分离，则这个带纹中很可能含有一种单纯蛋白质。如果待测洗脱液还能再分离，则这个带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。 三、血清蛋白的提取和分离 1．新鲜血液在体外凝固后，会析出清亮的淡黄色液体——血清。血清中含有丙种球蛋白、
凝集素等多种蛋白质。 2．过程： （1）点样：取新制血清与蔗糖溶液及溴酚蓝指示剂等体积混匀后，小心加到电泳样品槽的胶面上。 （2）电泳。 （3）染色：取出凝胶，放入质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液中。染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min。 （4）脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液浸泡漂洗数次，每隔1~2h更换脱色液，直至底色脱净，背景清晰。 （5）制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3~4h，然后放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得血清蛋白的电泳谱带。 四、其他蛋白质的提取与分离 1．牛奶中酪蛋白的提取与检测： 当pH=4.8时，酪蛋白的溶解度降低，并析出沉淀。用酒精除去酪蛋白沉淀中的脂肪后，即得到纯的酪蛋白。 酪蛋白中含有酪氨酸，能与米伦试剂起颜色反应，首先生成白色沉淀，加热后变成红色。 2．卵清蛋白质的分离： 选取鸡、鸭、鹅、鹌鹑等动物的新鲜卵清做实验材料。采用电泳法分离卵清蛋白质。 自主思考： 可否利用蛋白质的提取与分离技术快速诊断早期癌变？ 提示：可以。只需从早期患者的尿液、血液或细胞裂解液中提取少量蛋白质样品，采用蛋白质指纹图谱技术，就可以更加快速、简便、准确地对细胞癌变做出诊断。 探究一：蛋白质的分离原理 问题导引： 为年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增强其身体的抵抗力。在动物体内，丙种球蛋白和许多蛋白质混在一起。要获得纯净的丙种球蛋白，就必须进行提取和分离。你能提供分离蛋白质的思路吗？ 提示：可根据蛋白质各种特性的差异，如分子的大小、所带电荷的性质和多少等来分离不同种类的蛋白质。 名师精讲： 蛋白质的分离方法：
蛋白质的提取方法
沉淀法分级蛋白质： 水溶性蛋白质分子表面带有亲水性基团，因此很容易进行水合作用，顺利进入水溶液中。如果溶液的pH偏离等电点，则所有分子会带相同电荷，这进一步增进了它们的分散能力。因此，凡是能破坏蛋白质分子水合作用或者减弱分子间同性相斥作用的因素，都可能降低蛋白质在水中的溶解度，使其沉淀。常用的方法有盐析法和有机溶剂法。 （一）盐析法向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响：一是盐离子与蛋白质分子中的极性和离子基团作用，降低蛋白质分子的活度系数，使其溶解度增加。在盐浓度较低时以这种情形为主，蛋白质表现为易于溶解，称为盐溶现象；二是盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活度降低，导致蛋白质水合程度的降低，使蛋白质溶解度减少。在盐浓度较高时这种情形起决定性作用，蛋白质便会沉淀，称为盐析现象。采用加入中性盐的方法使各种蛋白质依次分别沉淀的方法称为盐析法。 各种离子盐析能力的强弱可用Hofmeister序列表示： PO4>SO4>C2O4>(CHOHCOO)2>AC>Cl>NO3, K>Rb>Na>Cs>Li>NH4 实际工作中，常用的盐析剂是硫酸铵，因为它盐析能力强，在水中溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质生物活性的丧失。硫酸铵浓溶液的pH约为5.5，配置硫酸铵饱和溶液时，可在水中加过饱和量的硫酸铵，加温至50℃，至大部分盐溶解，室温放置过夜后，再用NaOH或硫酸调所需pH。 （二）有机溶剂沉淀法在等电点附近，蛋白质分子主要以偶极离子形式存在。这时如果添加有机溶剂，由于有机溶剂有较低的介电常数，会使溶液介电常数减小，根据库伦定律，这样会增强偶极离子之间的静电引力，从而使分子聚集沉淀。另一方面，有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也促使蛋白分子脱水沉淀。选用有机溶剂的原则是：1.必须能与水完全混溶；2.不与蛋白质发生反应；3.要有较好的沉淀效应；4.溶剂蒸汽无毒，且不易燃。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。在低介电常数环境中，蛋白质分子基团间的作用力会受到影响，超过限度时会使蛋白质变性。因此，有机溶剂沉淀法一般都要在低温下进行。蛋白质分子本身是多价离子，对溶液介电常数有相当贡献。当蛋白浓度太低时，如添加有机溶剂过度会产生变性现象，若这时加入介电常数大的物质（如甘氨酸），可避免蛋白变性。蛋白浓度高时，介电常数也相应提高，可以减少蛋白变性。 （三）有机聚合物沉淀法除了盐和有机溶剂能使蛋白质沉淀外，水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白质。分子量高于4000的PEG可以非常有效地沉淀蛋白质。最常用的使分子量6000和20000的PEG。PEG可以看作是聚合的有机溶剂，其作用原理可能与有机溶剂类似。聚丙烯酸可以沉淀带正电蛋白质。聚丙烯酸分子上有相当多的羧基，碱性蛋白质含较多的碱性基团，羧基和碱性基团形成盐键，则把聚丙烯酸和碱性蛋白结成成很大颗粒沉淀下来。沉淀时碱性蛋白与溶液分开，加入钙离子后，聚丙烯酸成钙盐，蛋白质则游离出来。
蛋白提取方法
?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品
蛋白质分离与纯化教学设计课题
蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点
【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。
蛋白质的十种提取方法
蛋白质的十种提取方法.txt大人物的悲哀在于他们需要不停地做出选择；而小人物的悲哀在于他们从来没有选择的机会。男人因沧桑而成熟，女人因成熟而沧桑。男人有了烟，有了酒，也就有了故事；女人有了钱，有了资色，也就有了悲剧。蛋白质提取方法-------列举10种方法 [ 来源：绿谷生物网点击数： 4587 更新时间： 2008年05月30日 ][ 收藏本文 ] 一、 植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、 植物组织蛋白质提取方法 (summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空 干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小 时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、 组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
蛋白质的提取与分离
蛋白质提取与制备具体操作方法 1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间 隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的 也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局 部往往生热导致变性或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损 失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法 一、原料选择和前处理 （一）原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 （二）前处理 1.细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 Ⅰ.反复冻融法 于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。 Ⅱ.冷热变替法 将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 Ⅲ.超声波法 暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些