仔猪心肌细胞分离及培养方法研究

吴旭颖,郭亮

(天津农学院动物科学系,天津 300384)

摘要:为探讨仔猪心肌细胞的分离及培养方法,采用胶原酶型和胰酶同时消化心肌组织,用10%胎牛血清终止消化,并用100目细胞筛过滤后,1200r/min离心沉淀细胞,再加入培养液重悬细胞。采用差速贴壁法纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育。结果显示,未贴壁时心肌细胞呈圆形,培养12~24h心肌细胞开始贴壁生长,细胞伸出伪足呈梭形、多角形,3~4d后形成细胞簇,5~7d后细胞汇合成片。因此,同时使用胶原酶型和胰酶消化仔猪心肌可简便、快速地获得高活力的心肌细胞。

关键词:心肌细胞;细胞培养;仔猪

中图分类号:S816.79 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2010)03-0052-03

心肌细胞分离培养是一种研究心脏和心肌细胞的有效方法,也是简化分析心肌细胞功能的有效方法之一。心肌细胞培养还有助于研究心脏疾病的病理机制,在哺乳动物上,人们利用小鼠的心肌细胞为模型研究人类相关的心血管疾病(Zhang等,2006;牛建立等,1997),关于小鼠心肌细胞原代培养的方法已较为成熟。然而在猪上的相关研究,尤其是出生后仔猪心肌细胞培养的相关报道还较少。随着对猪心脏显微解剖、细胞与分子生物学特性的不断深入研究,猪逐渐被认为是潜在的器官提供者。Rose 等(2000)研究结果证明,向猪心内皮细胞转入DAP、MCP及CD59补体调节蛋白基因能克服人体对异种器官与组织的超急性排斥反应。因而,猪心逐渐成为矫治人类各种心脏疾病的适宜材料来源,因此需要尽快探索出一种细胞分离培养方法来获得仔猪心肌细胞,以便对猪心脏进行更深入的研究。

1 材料与方法

1.1 试验动物试验动物均选取刚出生7日龄的健康原种仔猪,大约克夏长白猪原种子一代,品种为二元长白种猪,出生时平均体重为1.32kg,购自天津国家级宁河原种猪场。

1.2 主要试剂和仪器无钙镁PBS购自美国Cam brex公司;0.25%胰蛋白酶、0.1%胶原酶购自美国M ediatech公司;IM DM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国H y clo ne公司;青霉素、链霉素购自

收稿日期:2009-08-28

作者简介:吴旭颖(1983-),女,天津人,硕士生,研究方向:动物疾病病原学与免疫学。

通信作者:郭亮(1964-),女,山东人,教授,主要从事生物细胞研究。E-mail:liangguo177@https://www.360docs.net/doc/75907888.html, 哈药集团制药总厂; -巯基乙醇、台盼蓝购自美国Sigm a公司;0.9%生理盐水购自华北制药股份有限公司;培养液组成:IM DM、10%胎牛血清、0.1 m mol/L -巯基乙醇、100U/mL青霉素G及100 g/mL链霉素。M CO-17AIC CO2培养箱(日本三洋株式会社);倒置相差显微镜日本(OLYMPUS);电子分析天平、恒温磁力搅拌器、电热恒温水箱(北京长安科学仪器厂);电热鼓风干燥箱(天津市中环是验电炉有限公司);普通光学显微镜、数码照相机、手提式压力蒸汽消毒器、超净净工作台、高速台式离心机、超低温冰箱、滤器、培养皿、微量加样枪、100目细胞筛、血球计数板等。

1.3 试验方法

1.3.1 采集心脏取出生7d的仔猪,从养殖场运回实验室,放血致死,用含双抗生理盐水冲洗仔猪3次,每次5min。固定仔猪,然后用75%的酒精消毒胸腹部皮肤。用灭菌的手术刀将仔猪胸部皮肤切开,立即用酒精棉球擦拭胸腹部肌肉消毒。用灭菌剪刀沿最后一根肋骨向前剪开胸腔,暴露心脏,用无菌剪刀剪开心包膜,取下心脏,立即放入盛有50mL 预冷的无钙镁PBS的烧杯中,洗去血细胞和血凝块。放入4 冰箱保存,12h内处理。

1.3.2 分离心肌细胞从冰箱取出样品,用镊子将心脏转移到无菌的平皿中,加入适量预冷的无钙镁PBS冲洗,剔除血管、脂肪和结缔组织,再用无钙镁PBS漂洗2~3次。用眼科剪刀将转移到平皿内的心脏剪成1~2m m3的碎块,将剪碎的心肌组织转移到20m L离心管中,加入无钙镁PBS溶液充分漂洗组织碎块2~3次以洗去血细胞,自然沉淀后弃掉洗涤液留下组织块以备消化。向离心管内加入

生理生化中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期

0.1%胶原酶 ,置磁力搅拌器上37 水浴60~80 r/min,消化20min。消化完毕后用滴管轻轻吹打离心管中组织碎块数次,再加入0.25%胰蛋白酶到离心管中,继续消化约15min。在显微镜下观察可见细胞变圆、浮起,则立即加入胎牛血清终止消化,消化产物用100目铜网过滤后,以1200r/m in,离心10min,弃去上清液后,用培养液洗涤细胞1次,并重悬细胞,调整细胞接种密度为2 105个/mL,接

种于25cm2细胞培养瓶中,37 、5%CO2培养箱中连续2次差速贴壁60m in,分离纯化心肌细胞,并用台盼蓝进行活性鉴定。24h后换液,换液时充分冲洗细胞以洗去血细胞和未贴壁的细胞,以后每2~3d换液1次。

1.3.3 心肌细胞的形态学观察用倒置相差显微镜观察培养细胞的形态。

1.3.4 心肌细胞活性检测台盼蓝染色法检测细胞活性:接种前取部分心肌细胞悬液稀释后,吸取0.5mL细胞悬液,加入0.5m L0.4%台盼蓝溶液混匀,染色3m in后,吸取一滴于血球计数板上,置显微镜下观察心肌细胞成活情况。死细胞能被台盼蓝染上色,镜下可见深蓝色的细胞;活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。

2 结果

2.1 心肌细胞形态学的观察心肌细胞在开始分离时,由于受到生物酶及机械作用的破坏,使刚分离的心肌细胞存在不同程度的皱缩,未贴壁前细胞为圆形,悬浮于培养液中(图1);12~24h后开始贴壁生长,贴壁后逐渐呈扁平形、梭形。也有的细胞在贴壁后形成三角形,顶部突出,之后细胞展开,伸出伪足,形成不规则星形;随着细胞的生长,3~4d后形成细胞簇(图2),一般5~7d可汇合成单层。

图1 刚开始分离的心肌细胞(100 )

2.2 心肌细胞的活性经台盼蓝染色法检测发现,约有83%的心肌细胞呈杆状,92%的心肌细胞台盼蓝染色呈阴性。因此,本试验方法获得了高活性的心肌细胞。

图2 培养4d的心肌细胞(100 )

3 讨论

在心肌细胞培养中,经常遇到杂细胞干扰的问题。由于动物心脏组织由18种细胞组成(许秀芳, 2000),其中近75%是非心肌细胞,如成纤维细胞、血细胞、血管内皮细胞等,而心肌细胞不易贴壁且只占整个心脏组织细胞的25%(M in等,2002)。新鲜消化离心后的细胞悬液中有大量成纤维细胞存在,分泌较多胶原,贴壁增殖快,因此在数量上抑制了心肌细胞的分化(Simpso n等,1982),但利用此特点进行差速贴壁,能降低其对心肌细胞的影响(To shiyu-ki等,2000)。故本试验采用差速贴壁60m in去除其干扰,培养24h后存活的心肌细胞即可贴壁生长,而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死,此时换液后可进一步获得高存活率的心肌细胞(王亭忠,2005)。

3.1 关于细胞分离分离心肌细胞常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶(Ko no等,1968)。胰酶主要用于分解组织间质的蛋白成分,作用很强,容易造成心肌组织消化过度而无法获得足够的心肌细胞,同时对细胞膜也有较强的破坏作用,因此对其要求比较严格。胰酶消化同时还需根据消化时心肌组织的形态、色泽及消化液的浑浊程度来判断心肌细胞分离的情况,并不断地在显微镜下取消化液来观察其消化程度,以便及时用胎牛血清来终止消化。而胶原酶主要通过作用间质中的胶原纤维,达到释放心肌细胞的作用,其作用缓和,胶原酶型较适合心肌细胞的分离(Clark等,1998),它可以和胰蛋白酶同时使用(Suzuki等,1989)或分开使用(Yonem ochi等, 1998;Baltoli等,1997),但应用效果国内外文献报道并不相同,且尚无一致意见。试验中同时运用这两种酶,0.1%的型胶原酶37 消化20min,同时再加0.25%的胰酶消化15min,结果能够较好的分离心肌细胞(葛建军等,2005;王娜等,2007)。而离心速度超过1500r/min,易造成细胞机械损伤;过

中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期生理生化

小则会引起细胞沉淀不完全,一般不低于800r/min 。本试验采用1200r /min,离心10m in 。

3.2 关于细胞培养在细胞培养中,培养液的缓冲作用很关键。打开培养瓶时,CO 2逸出易引起pH 升高。为了避免培养液中溶解的CO 2和碳酸盐完全丢失,目前多采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(H EPES),控制pH 在7.2~7.6范围内。对于消化后培养的心肌细胞的接种密度,国内外报道不一(陈妍等,2006),范围多在1 105

~5 105

个/mL,接种的细胞数不能太多,也不能太少。细胞数过多,易发生细胞生长营养不良;而细胞数过少,细胞之间又无法进行信息交流,心肌收缩不易同步。本试验中首次接种的心肌细胞密度为2 105

个/m L,以利于细胞的生长,以后的接种密度比较低些。4 小结

综上所述,本试验认为胶原酶和胰酶共同作用心肌组织,用10%胎牛血清及时终止消化反应,同时又采用连续2次差速贴壁60min 去除成纤维细胞的干扰,可获得数量多、纯度高和活力高的心肌细胞。

参考文献

1 牛建立,张宝仁,朱家麟.培养心肌细胞在心肌损伤模型中的应用

[J].第二军医大学学报,1997,18(2):192~194.

2 王娜,关鹏,段相林,等.新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进

[J].河北师范大学学报(自然科学版),2007,2(31):256~261.3 王亭忠.大鼠成体心肌细胞的分离和培养[J].第四军医大学学

报,2005,26(17):1544~1546.

4 许秀芳.成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察[J].首

都医科大学学报,2000,21(2):104~107.

5 吴宏梅,刘帅,包阿东,等.不同胎牛血清对动物细胞体外培养的

影响[J ].中国畜牧兽医,2009,36(4):96~99.

6 陈妍,王振远,郭秀侠,等.乳鼠心肌细胞的原代培养方法的改进

[J].中国生物制品学杂志,2006,19(5):520~521.

7 葛建军,周正春,汪学龙.原代培养小鼠心肌细胞的观察与鉴定

[J].中国药理学通报,2005,21(11):1402~1403.

8 Clark W A,Decker M L,Jan es D M ,et al.C ell con tact as an in -dependen t factor moduletating cardiac myocytes hytertrophy an d su rvival in long -term primary cultu re.J M ol C ell Cardiol,1998,30:139~155.

9 Baltoli M ,Clay comb W C.T rans fer of macromolecules into livin g

adult cardiomyocytes b y micr oin jection.M ol Cell Biochem ,1997,172:103~109.

10Kono T ,Pollman M ,Corvol P,et al.Roles of collagenase an d

other proteolytic enzymes in the dispersal of anim al tiss ues.Bio -chem Acta,1968,178:397~400.

11M in J Y,Yang Y K,et al.Transplantation of em bryonic stem

cells improves cardic function in p os tin farcted rats [J ].Appl Physiol,2002,92(1):288~296.

12Ros e A M ,Qazzaz H M ,Zolotarjova N,et al.Sodium pum p

isoforms in xen otransplantation:importan ce of biochemical com -patibility.C lin Chem ,2000,46(2):234~241.

13Sim pson P,M cGrath A,Savion S.M yocyte h ypertrophy in neo -natal rat cu lture and its r egulation by serum and catech olam ines [J].Circ Res,1982,51:787~801.

14Suz uki T ,Ohta M ,Hos h H.S eru m -free,ch emically defined med-i

um to evaluate the direct effects of grow th factors and inhibitors on proliferation and fun ction of neonatal rat cardiac m uscle cells in cultu re.I n Vitr o Cell Dev Biol,1989,25:601~606.

15T os hiyuki M ,Ryoji,Tets uya O,et al.Ty pe 2angioten sin re -ceptor is dow nregu lated in cardiomyoytes of patients w ith h eart failu re.Cardiovas c Res,2000,46:73~81.

16Yonem ochi H,Yasunaga S ,T es hima Y,et al.M echan ism of ad -ren ergic receptor upregulation indu ced by ACE inhibition in cul -tured neon atal rat cardiac m yocytes.Circ Res,1998,97:2268~2273.

17Zhang J F,H ou J F,Zhang J ,et al.Study on the clonin g,ex -pres sion,and bioactivity of recombin ant chicken IGF - [J].Ag -ricultu ral Sciences in China,2006,5(6):462~467.

Study of Methods on Myocardial Cells Isolation and Culture in Piglets

WU Xu -y ing,GU O Liang

(Department of A nimal Science,T ianjin A gr icultural College,T ianjin 300384,China)

Abstract:T o fo und an easy w ay to isolate and cult ur e myocar dia l cells o f piglets,the hear ts w ere dig ested by collagenase

type and tr ypsin.T he digestio n w as stopped by adding 10%F BS.Ca rdiocyt es were filtered by 100item o f cells sieve and pr ecipitated by centrifug atio n,and t hen added the medium to car diocytes.Cells w ere pur ificated t o reduce fibro blast content by adhere bott le and then incubated in the CO 2incubato r.T he r esults show ed that the cells wer e round before adhesio n;12t o 24ho ur s later ,the cells of fusifor m and polyg on began to adhere and str etch o ut the par apo dium;3to 4days later,cell clust er s formed;5to 7day s later ,the cells g rew tog ether flakily.L arg e ca rdiocyt es w ith w ell morpholog y and hig h livability could be co nv enient and quickly o bt ained by dig esting of collag enase ty pe and t ry psin.

Key words:car diocyte;cells culture;piglet

54 生理生化中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期

原代心肌细胞培养技巧【转】

原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳. 2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染. 6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞. 7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响. 8抗污染措施

大鼠原代心肌细胞提取方法

大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。

造血干细胞分离培养方法

一造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。（二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。（三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。

心肌细胞2

Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率。 4．心肌细胞纯化在心肌细胞培养中，成纤维细胞具有分裂增殖能力，且生长迅速，比心肌细胞更早贴壁，如不加以控制，常可生长为优势细胞。细胞纯化方法有很多因此，目前，常用化学试剂抑制法和差速贴壁分离法来抑制其生长，而化学试剂势必对培养细胞生长环境有一定影响，因此，依据心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的原理做差速分离，成了广泛采用的纯化方法，其优点是对目的细胞影响小，经比较，结果显示差速贴壁在60min、90min时最为理想方法简便，纯化率较高，可达到95%以上。经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞。因此再加上化学试剂抑制，加入分裂抑制剂(如丝裂霉素c) ，有时在培养早期如入溴脱氧脲苷，或加入不利非心肌细胞生长的成分(如谷氨酰胺)。如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine， BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常

乳鼠心肌细胞原代培养综述

乳鼠心肌细胞原代培养综述【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。 (2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则

临床级干细胞分离培养

临床级干细胞分离培养等产业化关键技术研发一、项目背景和意义：作为生物技术最新的研究领域，干细胞的发现和干细胞技术的发展为人类疾病的治疗提供了独特的视角、方法和手段，为人类疾病治疗提供了新的希望和曙光，必将引起一场医学的革命。干细胞的重要性奠定了其在医药卫生、科技产业和国防等领域内的重要地位，因此干细胞的研究开发和应用是人类的健康工程，预期在未来几年内会有更大的飞跃。尤其是近年来，干细胞研究的进程和产业化速度大大加快。干细胞的产业化是指依托于干细胞采集、储存、研发、移植、治疗等产品或服务以满足人类各种治疗和应用目的的行业种类的总称，干细胞产业已成为一个生机无限的经济增长点，蕴含着巨大的利润空间，是21世纪最有前景的朝阳产业。临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节。什么样的干细胞能从体外培养进入临床疾病治疗？这就需要建立一个临床级干细胞的标准，它可以极大促进干细胞临床疾病治疗的研究和发展。目前干细胞治疗研究中开展最广泛的两类细胞是造血干细胞和间充质干细胞。对于造血干细胞，目前全世界已经建立了很多脐带血库来保存造血干细胞，并已得到广泛的应用。而间充质干细胞的建库和临床应用才刚刚起步，目前已初步应用于治疗血液病（与造血干细胞共移植）、心脏病、脊髓损伤和多种自身免疫性疾病等，并取得了一定进展。在间充质干细胞治疗同种异基因造血干细胞移植后发生

的GVHD方面，美国Osiris公司已完成了III期临床试验。间充质干细胞具有广泛的应用前景，但是，迄今为止仍没有一个国际公认的能够用于分离和鉴定间充质干细胞的表面标志，这造成了制剂细胞成分不均匀、质量难以控制等困难。因此，开发特异性分离间充质干细胞的新方法是进一步推动间充质干细胞临床应用的必然趋势。按照临床应用的标准开发骨髓、脂肪、脐带等间充质干细胞的特异性分离纯化工艺，建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序对于间充质干细胞的未来应用具有重大的推动作用。二、项目目标 1. 总体目标：建立临床级干细胞标准、开发临床级干细胞分离与培养工艺以及建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序等。 2.具体技术指标：建立1项成体干细胞的临床级分离纯化的关键技术、标准化操作程序和质控标准，实现间充质干细胞治疗产品生产的标准化、规模化运行，质量达到临床应用标准。三、主要研究内容：针对干细胞临床应用中所面临的分离、培养、扩增等关键问题，重点确定与国际接轨的临床级干细胞的标准，建立多种临床级干细胞的分离纯化和培养新技术，为实现干细胞产业化奠定基础。

原代心肌细胞培养方法探讨

原代心肌细胞培养方法探讨1 邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014）周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021）摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6％；肌动蛋白（HHF35）经S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4％。表明该方法培养的心肌细胞生长迅速、活性好、纯度高。关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠 Explore a method of neonatal rat myocardial cells in culture ZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the people’s hospital of Shandong province, Jinan 250021, China Abstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission electron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. The cell purity was up to 96.4% by Actin （HHF35）of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity. Key words Myocardial Cells; Culture; Rat 随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。 1材料与方法 1.1 心肌细胞的培养取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1mm3的小块，加2～3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM 3ml培养液，做好标记置于37℃恒温培养箱中30～40min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，3～4天后多数连接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1％胰蛋白酶1ml，放置倒置显微镜下观察，约3～5min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰 1山东省自然科学基金资助项目（No.Q99C03）

成年大鼠心肌细胞分离方法

成年大鼠心肌细胞分离方法【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be

免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的

人表皮干细胞的分离培养

人表皮干细胞的分离培养【摘要】目的探索人表皮干细胞原代培养方法。方法将皮肤标本进行分离，用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后，重悬细胞，接种于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养。表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物β1整合素、CK19的表达。对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。结果倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好，表皮干细胞β1整合素及CK19角蛋白染色阳性。表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞（P＜0.05）。结论采用本方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。【Abstract】Objective The present research was performed to find primary cell culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were isolated by Dispase Ⅱ，the cells were seeded in culture flask which was dealed with type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical technique for the detection of integrin β1 and CK19. The cell clone formation of epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was observed under microscope and good growth status inverted，epidermal stem cells were positive reaction to integrin β1 and CK19 antibody. Epidermal stem cell clone formation rate is higher than that of keratinocytes （P＜0.05）.Conclusion Our results indicate that the method was effective for culture human epidermal stem cells. 【Key words】Epidermal stem cell；Culture；Identification 表皮干细胞具有无限增殖的能力，在组织工程皮肤的研究中具有重要的作用，本文就表皮干细胞的原代培养进行探讨。 1 材料与方法 1. 1 主要试剂DMEM培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM），单克隆抗体β1整合素，单克隆抗体CK19，Ⅳ型胶原，DispaseⅡ酶，胎牛血清（FBS），表皮细胞生长因子，0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）。 1. 2 实验设备CO2恒温培养箱，无菌超净工作台，倒置相差显微镜，普通光学显微镜。 1. 3 方法 1. 3. 1 原代培养严格无菌操作，切取5×5 mm2左右的皮肤标本，标本源自本院4月龄自愿引产胎儿包皮，切取前分离皮下组织，将分离得到的皮肤组织用含青-链霉素的PBS冲洗3次，切成小皮块后置于含 2.5 mg/ml DispaseⅡ酶的DMEM培养基中4℃过夜，培养基中含有青霉素（100 U/ml）及链霉素（100 μg/ml），第二天分离表皮和真皮层，收集表皮皮片，37℃条件下0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化15 min，胎牛血清终止消化，轻轻吹打，200目

心肌细胞培养

新生大鼠心肌细胞培养技巧原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长大量观测表明，选择1~3d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳 2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用 . 消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏 .胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶 I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1g?L1,我们使用的为0.8gL1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感 .消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测 .消化过程中使用磁力搅拌器时应注意 :(1)转速一般控制在60~80rmin1左右 .(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织 .(4)适宜温度为35~37℃

.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率接种细胞的绝对数量应经精确计算 . 一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象. 因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染 6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞 .溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长 .但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％上的心肌细胞 . 7 换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48h后换液 .这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实此外，去血清后可用ITS和0.1gL1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响 .

心肌细胞分离方法

成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：

4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35) 4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶 45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ 4.2 [王振国.四医大硕士论文。2005] 30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA 5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35) 5.1 20mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。 5.2 100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。 100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。 50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。 5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL 复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL 复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。 6.心肌细胞分离其步骤简述如下： 1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重） 2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。 3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液 4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙台式液灌流约10min 5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶液约2min。 6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB（37℃）液中。 7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。 8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100×离心5min），保留沉淀并换入新鲜含2%BSA的KB液。 9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8×10-3mol/L（一说1.25×10-3mol/L）,得到钙耐受心室肌细胞，保存于含1.8×10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。另一说： 8. 250目尼龙网过滤，静置10min，弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min( 使心肌细胞自然沉降) ，弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C，静置15min备用。 9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针染色，500μL台式液加1μL DMSO（二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上

细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞培养的基本方法-细胞分离技术细胞分离技术一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的

干细胞分离培养步骤

家兔BMSC分离培养步骤 1.麻醉、备皮、消毒、铺巾：取1只4-5周龄新西兰幼兔，速眠新肌肉注射(0．1～0．2mL／kg)麻醉。仰卧固定于操作台上，褪毛，备皮，2%碘酒、75%酒精（或碘伏）常规消毒，铺洞巾(洞巾孔洞应控制在lcm左右，以利于减少污染)。 2. 在双侧踝关节处环形剪开皮肤，再纵行剪开皮肤至骶尾部，分离肌肉、筋膜等软组织至见骨膜，电锯离断踝关节、膝关节及髋关节，获取家兔股骨和胫骨（桡骨）,置于装有PBS液的无菌盒内。（亦可从髂前上棘穿刺抽取骨髓） 3．用PBS液体清洗骨组织3-4遍，去除杂物、血迹后，在超净工作台上，无菌条件下剥离骨周围的肌肉软组织，用眼科剪从股骨和胫骨的干骺端打开骨髓腔，用含有适量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液冲洗骨髓腔，收集冲洗液约 6 ～ 8 mL。吸管反复吹打后，1 500 r/min，离心5 min，弃上清。加入 DMEM 培养基重悬，将上述细胞重悬液按照1∶ 1 的比例缓慢滴加到密度为 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分离液中，1 500 r / min 离心 20 min。离心后管内容物分为 3 层，收集中间乳白色云雾状的单个核细胞层，加入 DMEM 培养液稀释混匀，1 500 r/min 离心 5 min，洗涤 2 ～ 3 次，去除多余的脂肪细胞及组织液。用含双抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，以 2. 0 × 10^5个/cm2的细胞密度接种于25cm^2培养瓶中，置于37 ℃，5%、饱和湿度的孵箱中培养。 4. 48小时后首次半量换液，去除浮物及其它非贴壁细胞（如造血干细胞），后每隔3天换液一次。 5. 7-10天后，待细胞融合长满至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代。经过第一次传代后，骨髓间充质干细胞大约能占60%左右，并且呈漩涡状生长；一般经过3次左右传代后，骨髓间充质干细胞大约能占90%左右。

原代心肌细胞培养技巧【转】

作者：王涛，余志斌，谢满江，车红磊【关键词】细胞培养【关键词】细胞培养；心肌细胞；大鼠引言原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中。我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1. 新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想。其中，尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳。 2. 消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用。消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶。透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用。胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏。胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I。文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g ?L，我们使用的为0.8 g?L。胶原酶最好现用现配。 3. 消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感。消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测。消化过程中使用磁力搅拌器时应注意：(1)转速一般控制在60~80 r?min左右。(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定。(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织。(4)适宜温度为35~37℃。 (5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化。 4. 接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率。接种细胞的绝对数量应经精确计算。一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量。例如，如作形态学观测，六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个。