红墨水染色法快速测定小麦生活力

一、红墨水染色法快速测定小麦、玉米种子生活力的具体方法如下：

选取玉米种子100粒、小麦种子200粒，在30℃~35℃温水中浸泡6小时~8小时，使种子充分吸胀。取吸胀的种子100粒，用刀片沿胚部中线切为两半，其中一半用于测定。将准备好的半粒种子置于杯中，加入稀释20倍的红墨水溶液，以浸没种子为好。染色15~20分钟后捞出，用清水冲洗种子，洗去颜色。观察冲洗后种子胚部着色情况，胚部不着色或略带浅红色者，即为有生命力的种子。若胚部染成与胚乳相同的深红色，则为无生命力的种子。依次计算活种子百分率，即为发芽率。

小麦种子发芽率快速测定法

1、浸种将小麦种子用28℃～30℃的温水浸泡3～5小时，让种子充分吸收水分膨胀。

2、切取选择具有代表性的种子，用刀片沿麦粒的腹沟切成两半，留取带有胚部的一半作测定之用。

3、染色先配制好5%的红墨水溶液（即将1份红墨水加入19份清水中，混合均匀即成），然后将切取的麦种半片均匀摊在培养器皿或瓷盘中，将红墨水倒入（用量以浸没种子为宜）。

4、冲洗染色5～10分钟以后，将种子取出，用清水反复冲洗数次，直到冲洗后的水不再见到红色为止。

5、观察种子的胚不着色或仅带有浅红色的，即为具有生命力的种子。如果胚部呈红色，与胚乳着色的程度不同，即表明该小麦种子已经丧失了生命活力，观察时将其拣出。

6、计算数出具有生命力的种子数目，除以供测试种子的总数，即可得出该小麦种子的发芽率。如果供测试的种子正好是100粒，那么具有生命活力的种子就是该小麦种的发芽率。

种子发芽率快速测定法——————红墨水染色法

宝兴县明礼乡朱范刚舒正蓉科技下乡应深入农户种子发芽率是指在最适宜的条件下，在规定的天数内，发芽的种子占供试种子的百分数，它是决定种子品质和实用价值大小的主要依据，与播种时的用种量直接相关。但是常规发芽（直接发芽）方法测定发芽率所需时间较长，特别是有时为了应急需要，没有足够的时间

来测定发芽率，遇到休眠种子也无法知道。这里介绍红墨水染色法却能在较短时间内获得结果。其原理是：凡生活细胞的原生质膜具有选择性吸收物质的能力，而死的种胚细胞原生质膜丧失这种能力，于是染料便能进入死细胞而染色，活种胚细胞则不被染色。操作方法：将待测种子在30～35℃温水中浸种6～8小时左右，以增强种胚的呼吸强度，使显色迅速。

染色。取已吸胀的种子20粒，用刀片沿种子胚的中心线纵切为两半，将一半置于培养皿中，加入5％红墨水（以淹没种子为度），染色10～15分钟，染色后倒去红墨水，用水冲洗多次，至冲洗液无色为止即可检查种子的死活。凡种胚不着色或着色很浅的为活种子；凡种胚与胚乳着色程度相同的为死种子。可将另一半种子用沸水杀死后作对照观察。计数种胚不着色或着色浅的种子数，就可算出发芽率。

（邓云彬）

二、生活力的四唑测定

2.1 意义

四唑测定的意义是迅速了解某些用普通发芽方法其发芽缓慢种子的生活力。便于休眠种子检验、种子收购和管理工作中的初步检查以及种子变质原因的诊断。即测定种子潜在的发芽能力。

2.2 原理

氯化或溴化三苯基四唑，经过氢化作用，在活细胞中产生红色稳定的不扩散物质，即三苯基甲?（triphenylformazan）。种子活细胞内发生的还原过程，在脱氢酶催化之下，氢从各种呼吸物质中脱离出来，遇到浸入的无色红四氮唑溶液，则红四氮唑与氢离子相结合，产生红色物质。由此可以区别种子红色的有生命部分和无色的无生命部分。除完全染色的有生命活力的种子及完全不染色的无生活力种子外，一些不同部分染上红色，是存在不同大小的坏死组织。种子生活力的有无，不是决定于颜色的深浅，而是决定于胚和胚乳的坏死组织所在部位和蔓延情况。

2.3 一般说明

2.3.1 试剂准备

a.四唑溶液：采用2，3，5-三苯四唑氯化物（TTC），通常配成1％水溶液（pH6.5～

7.0）保存。如果水的酸碱度不在中性范围内，则四唑盐应溶解在磷酸盐缓冲液中。其缓冲液的配制如下：

溶液A──在1000毫升水中溶解9.078克KH2PO4，溶液B──在1000毫升水中溶解11.876克

Na2PO4，取溶液A400毫升和溶液B600毫升混合在一起。将10克四唑盐溶解于按上法混合的1000

毫升缓冲液中，即得到pH7.0的1.0％四唑溶液。

须将配好的溶液贮存在黑暗处或棕色瓶里，以免照光而变质。这种溶液可在室温里保存几个月，但每次用过后即作废。

b.乳酸苯酚溶液

为辨清某些牧草种子如早熟禾、猫尾草、小糠草等的生活力，经四唑处理后，用2～3滴乳酸苯酚液浸泡，能使稃壳变为透明，易看清胚的染色部分。其配制方法是20份乳酸、20份苯酚、40份甘油和20份水。应注意不能接触与吸入，因乳酸苯酚有毒。并保持通风，以降低其空气中的浓度。

2.3.2 程序

a.测定种子准备。每次测定应不少于200粒种子。一般种子在水中浸3～10小时，使组织稍变柔软。根据不同种子特点进行纵切或横切以及刺破种皮的准备。

b .染色。准备好的种子，放在小玻璃容器里染色。各类种子染色所需的时间要根据种子的具体情况以及四唑溶液浓度和温度而变化。

c.鉴定。种子染色结束后立即进行鉴定。小粒种子须放在立体显微镜下检查。紫花苜蓿、三叶草可用乳酸苯酚液洗净，不必剥去种皮，放透射光下检查。一般胚的构造发育良好，未受损伤，并染成正常红色者应作为有生活力的种子（见图1、2）。

2.4 牧草种子四唑测定方法

根据种子四唑测定的程序，按不同种类牧草将准备方法、溶液浓度、染色时间列于表6.4.A。

2.5 结果的计算和报告

测定种子生活力的百分率根据4个重复计算。重复间最大容许差距与发芽试验的规定相同，平均百分率计算到最接近的整数。四唑测定报告：有生活力种子……％；空壳……％，带有幼虫的……％，破裂或腐烂……％。

5、发芽试验

5.1 目的

发芽试验的最终目的是获得关于种子在草地建设中种的利用价值，并提供试验结果，以比较不同种子“批”的用价。

利用实验室方法检验，在能控制部分或全部外界条件的情况下，使各类种子样品，大多数可以获得最整齐而迅速的发芽。这些控制条件应逐步达到标准化，使试验结果尽可能接近。

5.2 定义

在鉴定实验室发芽试验所产生的幼苗其主要构造的发育阶段必须达到能够查出某些不正常的没有实用价值的幼苗。在检验证书上填报的发芽百分率是指规定条件下和时间内，产生了正常幼苗的种子比例。

5.2.1 正常幼苗

在计算发芽百分率时，必须将正常幼苗与不正常幼苗分开。为了使鉴定正常幼苗具有一致性，正常幼苗必须符合下列规定之一。

a.一个发育良好的根系，包括一条初生根，其主根长于种子。

b.一个发育良好的下胚轴，其输导组织未受损伤的。

c.一个完整的胚芽，具有一张发育良好的叶片，或一个具有正常胚芽的上胚轴。

d.单子叶植物幼苗具有一片子叶，双子叶植物具有两片子叶。

5.2.2 不正常幼苗

是指生长在良好土壤及适宜的水分供应、温度和光线条件下，表现不能继续发育为不正常植株的幼苗。

具有下列缺陷之一者：

a.损伤的幼苗：幼苗没有子叶；幼苗带有皱缩、裂缝、破裂或损伤而影响上胚轴、下胚轴与根的输导组织。幼苗没有初生根。

b.畸形的幼苗：幼苗细弱、发育不平衡；发育停滞的胚芽、下胚轴或上胚轴；肿胀的幼芽及发育停滞的根；子叶出现后没有进一步发育的幼苗。

c.***的幼苗.：幼苗的某种主要构造染病或***严重，以至阻碍幼苗的正常发育。

d.子叶从珠孔发育出来或胚根从珠孔以外的其他部分发育的幼苗。

5.2.3 硬实

豆科牧草种子，由于它们有一层不透水的种皮不能吸水，到规定的试验日期结束时，仍是坚硬的，这类种子列为硬实。硬实百分率应与发芽百分率分开填报在检验证书上。

5.2.4 新鲜的未发芽种子

除硬实外，种子经适当的破除休眠处理后仍保持原状，而外表看来有生活力的，应列入新鲜的未发芽种子，必须与发芽百分率分开填报。灌木植物在常规发芽试验末期，具有活胚的新鲜未发芽种子，可用四唑测定其活动力。

5.3 一般原则

所有发芽试验都要从净种子分出来的种子进行。净种子应充分混和，从中随机数取400粒种子，使成为100粒、50粒或25粒的重复。种子应均匀的放在发芽床上，并有足够的

距离，尽可能防止种苗在计数和取出前相互接触。在表5.A 所规定的各个种的发芽床类型、温度及对光的要求，可在指定的方法中任选一种。

5.4 材料和条件

5.4.1 纸床

纸上：种子放在一层或多层纸上发芽。纸放在（1）玻璃培养皿里，（2）光照发芽器（Jacobson apparatus）内，（3）直接放在发芽箱或发芽室内的发芽盘上。第（2）法的每一重复盖有一个钟罩，它的顶上有一小孔以便通气。用一条灯芯，其下端放在水中，以便将水吸收到纸上。第（3）法的发芽箱或发芽室必须保持相对湿度为90％～95％。经过湿润的疏松纸或脱脂棉可用来垫在纸底下，亦可直接作为发芽床。

纸间：种子放在两层纸中间发芽。纸层可（1）直接放在发芽箱或发芽室内的发芽盘上，或（2）放在金属、塑料玻璃盒内。方法（1）的发芽箱或发芽室内必须保持相对湿度达90％～95％。纸可以折好或卷好，平放或竖放。金属的、玻璃的或塑料的框架可插入纸间以保持通气。经湿润的疏松纸或脱脂棉可作纸的衬底或直接作为发芽床（规定用光照的，只能用纸上法）。

5.4.2 砂

砂用于表5.A所规定的下列方法的发芽床：

砂中：种子播在一层均匀的湿沙上，然后加盖1～2厘米深松散的砂。

砂上：种子压入砂的表面。

用砂做发芽床在必要时，必须预先洗涤消毒，以杀灭各种细菌、真菌、孢子、线虫瘿及混入的其他种子。砂粒不应过大过小。几乎全部的砂粒应通过筛孔直径0.8毫米的筛子，而留在筛孔直径为0.5毫米的筛子上。pH值应在6.0～7.5范围内。

5.4.3 土壤

土壤或人造堆肥（相当于营养土）可用以代替砂中及砂上两法中的砂，不过一般更难于标准化，所以容易造成结果之间的更大差异。但对鉴定的幼苗发生怀疑时，以及某些样品在纸上或砂上发芽而所产生的幼苗表现生物中毒症状时，必须用这种发芽床加以证实。

土壤中加水，应该使土壤达一定粘度，使其在手掌中能捏挤成团，而放在两指间一压时，容易散开。

5.4.4 水分和通气

在全部发芽过程中，发芽床必须含有足够水分，以满足发芽需要，但水分不宜过多。发芽床不应湿到有一层水膜围绕着种子。在建议用低水分时，湿的发芽床须压上一种能吸水

的干物品，如干的擦脸纸或吸水纸，以除去过多的水。在种子四周的空气相对湿度，应保持在90％～95％，以防止蒸发散失。

水应相当地不含酸碱有机物质或其他杂质。有时需要应用0.2％的硝酸钾（KNO3）或应用0.2％的双氧水处理24小时以打破休眠。如用蒸馏水，必须通气增加氧的含量。

5.4.5 温度

表5.A中所规定的温度，应在和发芽床上种子相同的水平进行测定，发芽箱或发芽室的温度必须尽可能均匀一致。在日光直射或在人造光源下试验时，应注意温度不超过规定标准。规定的温度应作为最高限度，仪器的温度变幅，在24小时内应不超过1℃。

当规定用变温时，应保持低温16小时及高温8小时。非休眠的种子，在3小时内逐渐变温，一般就可以。但有的种子可能是休眠的，应该在1小时以内完成急剧变温，或将试验移到另一温度较低的发芽箱中。如因特殊情况不能控制变温时，则应将试验保持在低温条件下。

5.4.6 光

表 5.A所规定的光（L），可由自然或人工光源供给；但必须注意保证在整个试验面上都有均匀的光照强度，而光源所放出的热量不致影响规定的温度。

5.5 程序

5.5.1 幼苗鉴定

对幼苗要作出正确鉴定，只能当幼苗已经发育到能够确定它们是否具有主要构造阶段。

5.5.2 试验持续时间

试验时间是按规定的最后计数时间（表5.A）而定，但试验前或试验进行中为了打破休眠需要的冷冻时间不包括在内。在规定试验时间之末，有几颗种子刚开始发芽，则试验时期可再延长7天。

第一次计数的时间只要求大约接近，允许有1～3天的偏差。但中间计数的次数应降到最低限度，以减少未充分发育的幼苗遭受损伤的危险。

当一个样品含有感染真菌或细菌的种子时，在试验规定时期内，必须经常间隔一定时间，将幼苗取出并计数。明显死亡和腐烂的种子，可能是健康幼苗染病的根源，应在每次计数时取出，并记录其数目。

5.5.3 复粒种子

无芒虎尾草（Chloris gayana）、鸭茅（Dactylis glomerata）、早熟禾属（Poa）的复小花，应作为单粒种子进行试验。要确定幼苗从那一颗复粒种子长出来，可用两种方法：在它

们分开前计数，并取出或试验时设法将复粒种子隔开。试验结果所表明的为至少长出一个正常幼苗的复粒种子的百分率。从100 粒种子产生的幼苗平均数，亦可由检验站酌情进行填报。

5.5.4 发芽率的计算

当每个试验中的4次重复（每重复测100粒种子）结果都在最大容许误差的范围之内，其平均值即代表发芽百分率。为了求得最大容许差距，首先确定试验重复的平均发芽百分率，如有必要，将发芽器中最靠近的50粒或25粒种子的重复合并成为100粒种子的重复。平均百分率计算到最接近的整数。将其平均发芽百分率填报在证书上。

当试验结果具有下列情况，不可填报，而应用同样方法或另一方法进行第二次试验。

a.100粒种子发芽率各重复的差距超过表5.B的最大容许差距。

b.试验条件不适当，幼苗鉴定有差错或因休眠、生物中毒、真菌或细菌的传布而使结果不准确。

第二次试验（也可以同时做）的结果如果和第一次试验符合的，则用二次试验的平均数代表发芽率，填入检验证书上。为了判断二次试验是否符合，可计算两次试验平均数，并在表5.C第1栏或第2栏查出平均数。如两次相差不超过3栏的容许差距，则试验是符合的。超过容许差距，则至少再做一次试验。

5.6 结果报告

当发芽试验结果填报在检验证书上时，除正常幼苗百分率、硬实百分率、不正常幼苗百分率、死种子百分率等栏，都应填写，若没有情况则将符号“—○—”填入该位置，不可空白。

5.7 休眠种子特殊处理

5.7.1 预先冷冻

进行发芽的各重复在移到规定的温度以前，先放在湿润的发芽床上，开始时保持低温。开始7天保持3～5℃或5～10℃，因品种而异。预先冷冻不包括在发芽试验的时期内。5.7.2 预先干燥

进行发芽的各重复在放入规定发芽条件以前，先在不超过40℃的温度和空气畅通情况下加热7天。有时，可能需要延长预先干燥的时间。干燥的时间及温度应在证书上填报。5.7.3 硝酸钾

发芽床可用0.2％的硝酸钾溶液湿润。将硝酸钾2克溶解在1000毫升水内配制。在试验开始时，用溶液浸透发芽床，但以后用水湿润。应用此法处理，须在检验书上注明。

5.7.4 双氧水

用0.2％双氧水处理24小时。一般种子放在小玻璃容器内，加双氧水液浸泡，要配加合适的盖子，处理以后的种子放在发芽床上。

5.7.5 低温发芽

发芽试验除表5.A4栏所规定外，可在较低的恒温下或在高低温交替的条件下进行。发芽可能较慢，因此试验时期可以延长。温度及试验持续时间均应在证书上填报。

5.7.6 预先洗涤

发芽试验以前，为除去种子中的某些抑制物质，可将种子置于水中浸渍及洗涤除去该物质。处理持续时间及控制水温均须在证书上填报。

5.8 发芽器具

5.8.1 光照发芽器

一个锌制的水槽，上面配制有圆孔或长孔的玻璃或不锈钢的金属板，在孔上放置适宜的发芽床（最好用滤纸），并用灯芯连接发芽床，通过小孔，伸入水槽，以保持发芽床湿润。每个发芽床上盖一个密缝的钟形罩，罩的顶部有一孔，可以通气，但不会有过份的蒸发。整个发芽床放在直射或漫射光下。槽里的不用电力加热，温度用温度调节器控制。

5.8.2 发芽箱

通常由绝缘的双层壁的小室构成，有电热加温和冷却两种设备，并且小室可由空气或一层绝缘物质隔热以防止箱内温度的变化。箱内装备着合适的可抽动的浅盘，以便于放置各实验室所选用的发芽盘。箱底的空气或储水器都可以加温。这种发芽箱内的温度可以任意调节，约在8～40℃之间，箱内空气必须保持饱和湿度的90％～95％，以避免发芽床变干燥。

发芽箱有很多改制的型式，例如一种玻璃壁的日光照发芽器，是专门为对光敏感的种子设计的。

5.8.3 发芽室

其构造原理与发芽箱相同，但容积扩大，工作人员可以进入内部，并可将试验放到中心走道的两边。通常需要风扇，以防止温度分成层次。同时还要有特别设备以保持较高的相对湿度。

5.8.4 数粒设备

数种板：面积接近于放置种子的发芽床的大小。上层有一层固定的板，板上有50或100个孔，孔的一般形状和大小与所计数的种子相近似。板的下层衬有一块薄板，无孔，作为假底，可以来回抽动。操作时，数种板放在发芽床上，把种子撒布在板上，并将板稍微倾斜，除去多余的种子。然后进行核对，当所有孔装满了种子而每孔只有一粒种子时，抽去可

以移动的板，种子就在适当的位置落到发芽床上。

真空数粒器：包括三个部分

a.真空系统，包括皮管；

b.数种盘或数种头；

c.活门。

若数大粒种子，则实验室需专设一个系统；其数种头连接处能支持50到70厘米水银柱，每秒钟抽出500到700升游离空气；而对紫花苜蓿每秒钟抽出225到450升的空气，即可。

真空数种器可以直接操作（即当真空抽气机开动时，数种头即产生真空），有的是自动的（即在数种头与抽气机之间有一种箱，在箱内的真空自动控制抽气机的运转）。

5.9 纸床说明

一般用吸水纸、滤纸或纸巾。应是表面多细孔的结构，无真菌和细菌的沾染。纸应为白色或用一种对发芽幼苗无毒的染料染色。纸的质地应使发芽幼苗的根生长在纸上而不是伸入纸中。发芽床在潮湿时的总厚度应不少于约2毫米。

2．四唑染色

(1)目的其目的是通过染色反应，能将胚和活的营养组织里的健壮、衰弱和死亡部分的差异正确地显现出来，以便进行确切的鉴别，可靠地判断种子生活力和活力。

(2)染色程序按要求，将经过样品准备或不须准备的规定数量种子分别放入四唑溶液里染色。小粒种子可用6cm培养皿，大、中粒种子可用9cm培养皿或更大的容器。特别细小的种子可包在滤纸内，分别放入容器里，然后加入适宜浓度的四唑溶液，以淹没种子为度，移置一定温度的黑暗恒温箱内或弱光下进行染色反应。因为光线可能使四唑盐类还原而降低其浓度，影响染色效果。

(3)染色的温度和时间染色时间因种子种类、样品准备方法、本身生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH和温度等因素的不同而有差异。其中特别是温度影响为最大。染色时间可按需要在20～45℃度范围内加以适当选择。在这种温度范围内，温度每增加5℃，其染色时间可减少一半。例如，要求在30℃下适宜染色时间为6h的种子样品，移到35℃下则只需染色反应3h，在40℃下仅需1．5h。另一方面，种子的健壮、衰弱和死亡不同等级的组织，其染色的快慢也是不同的。一般来说，衰弱组织四唑溶液渗入较快，染色也较快；健壮组织酶的

活性强，染色明显。为了使这些不同等级的组织均能达到良好的染色程度，以便于鉴别。有时可根据样品的实际情况，适当调整染色时间，即缩短或延长。

如果已到规定染色时间，但样品的染色仍不够充分，这时可适当延长染色时间，以便证实染色不够充分是由于四唑溶液渗入缓慢所引起，还是由于种子本身的缺陷所引起的。但必须注意，染色温度过高或染色时间过长，也会引起种子组织的变质，而可能掩盖住由于遭受冻害、热伤和本身衰弱而呈现不同颜色或异常的情况。

有些种子要求在各重复中加入微量的杀菌剂或抗生素，以避免在染色过程产生带有黑色沉淀物的多泡沫溶液。

4．鉴定前处理为了确保鉴定结果的正确性，还应将已染色的种子样品，加以适当的处理，再进一步使胚的主要构造和活的营养组织明显地暴露出来，以便观察鉴定和计算，这里将目前国际上采用和有效的处理方法介绍如下。

(1)不须处理，直接观察适用于染色前已进行样品准备的整个胚、摘出的胚中轴、纵切或横切的胚等样品。因为这些种子胚的主要构造已暴露在外面，所以不须附加处理，就可直接观察鉴定。

(2)轻压出胚，观察鉴定适用于样品准备时仅切去种子的一部分，胚的大部分仍留在营养组织内的样品。在鉴定前须用解剖针在种子上稍加压力，使胚向切口滑出，以便观察。(3)扯开营养组织，暴露出胚适用于染色前样品准备时仅撕去种皮或仅切去部分营养组织的样品。如冷杉等种子。其方法是扯去遮盖住胚的营养组织或弄掉切口表面的营养组织，使胚的主要构造完全暴露出来，以便鉴定。

(4)切去一层营养组织，暴露出胚和活营养组织适用于样品准备时，仅切去或切开种子上半粒或基部的种子样品。因为这些种子的胚仍被营养组织所包围，所以需在适当的位置切去一层适宜厚度的营养组织，才能看清胚和活营养染色情况。

(5)沿胚中轴纵切，暴露出胚的构造这种方法适用于样品未准备的种子。如有些豆类种子。

(6)沿种子中线纵切，暴露出胚和活营养组织这种方法适用于样品准备时，仅除去种子外面构造，或仅切去基部的种子。如五加科等种子。

(7)剥去半透明的种皮或种子组织，暴露出胚这种方法适用于四唑染色前样品未加准备或仅切去基部的种子。如大豆、豌豆等种子。

(8)切去切面碎片或掰开子叶，暴露出胚这种处理主要适用于切得不好或有些豆科双子叶种子。如鉴定前发现胚中轴被若干切面碎片所遮盖，以致难以正确鉴定，则需切去一层子叶，或者为了可靠观察子叶之间胚中轴的染色情况，则需掰开子叶。

(9)剥去种皮和残余营养组织，暴露出胚这种处理适用于在样品准备时仅切去种子一部分的样品。如红花种子在样品准备时，仅切去种子的上部，仍有种皮和残余营养组织包着胚，因此，只有除去这些部分，才能暴露出胚的主要构造。

(10)乳酸苯酚透明液的应用在四唑染色反应达到适宜时间后，小粒种子用载玻片挡住培养皿口的一边，留下一条狭缝，让其只能沥出四唑溶液，注意不能溜出种子。万一不小心，跑出几粒种子，则可用小吸管吸回种子。对更细小的种子(如小糠草)等，则可用管口比这种种子小的吸管吸去四唑溶液，这样就不会吸进种子而仅吸去溶液。然后用厚型吸水纸片吸干残余的溶液，并把种子集中在培养皿中心凹陷处为一堆，再加入2～4滴乳酸苯酚透明液，适当摇晃，使其与种子良好接触，马上移人38℃恒温箱保持30～60min，经清水漂洗或直接观察。这种有效的透明程序可使果种皮、稃壳或胚乳变为透明，则可清楚地鉴定胚的主要构造的染色情况。

5．观察鉴定四唑测定样品经染色和样品处理后，进行正确的观察鉴定是十分重要的。测定结果的可靠性取决于检验人员对染色组织和部位的正确识别、工作经验和判断能力等综合运用能力。为了避免判断的错误，检验人员应按鉴定标准，认真观察，以高度的责任感，确保鉴定结果的正确性。

(1)目的观察鉴定主要着眼于以下三个目的：

①确切计算种子在适宜条件下(包括在杀菌剂处理有效的情况下)能产生正常幼苗的能力，即种子生活力百分率。

②按种子样品染色程度和组织特征，判断其强壮程度，将种子分为强或弱2～3个等级，以便统计种子活力。

③按局部解剖染色图形，观察染色部位，查明种子劣变和生活力丧失的原因，为种子生理、种子加工、种子贮藏和种子处理提供指导情报。

(2)鉴定因素每个染色样品的鉴定应根据种子染成的颜色、组织状态，有无肿胀、破裂、虫伤、衰弱模糊，以及其他异常情况等鉴定因素作出正确的判断。同时，还应考虑其胚的主要构造机能与其他部分之间的关系，即与营养组织的损伤面积(指不染色的面积)、位置和程度的关系。因为这些部分对胚发育成正常幼苗也是不可缺少的。

同时，还要注意观察种子的健壮水平。这种水平是以染成的颜色、膨胀程度和软腐等状态显现出来的。据此，可将种子分为健壮、活的衰弱组织、死的衰弱组织和死亡等4个等级水平。

(3)胚的组织特征种子胚组织特征在种子种类之间、预湿温度和时间等因素的不同而可能

有所变化。为了便于正确判别，这里将不同健壮水平的组织特征分述如下。

①健壮组织。一般情况，这种组织表现为在暴露的表面颜色正常、均匀一致，无明显的分界、色泽鲜红且有光泽，并且组织状态正常。其湿润的染色组织通常具有高度的膨胀性和弹性。当用解剖针稍压时，表面不会留下压痕。当用针挑出胚根或其他构造时，表现出一定的硬性，并在干燥失水后仍具有均匀一致的收缩特性，保持着正常的色泽。

②衰弱的活组织。这是指已有不同程度劣变的活组织。其劣变程度可从几乎接近健壮到已经衰老而活着的不同衰弱程度。但其染色程度和组织特征是随着劣变的加深和范围大小而呈现出一定的差异。其颜色的异常情况也随着种子劣变程度的增加而加深。如玉米和小麦的胚染色组织，其衰弱活组织切面的颜色要比正常组织略深，呈灰暗红色，并随着暴露时间的增加而变深。

特别要注意，子叶、胚芽鞘和胚根的尖端的劣变症状要比其他部分出现得早。如子叶尖端呈现膨胀纹条或斑点。胚芽鞘和胚根尖端染的颜色很浅或不染色，这就表明这些部分的组织已经劣变或损伤。当让这些部分气干时，较为容易收缩，并且其颜色也变为深红。

③衰弱的死组织。这是指已严重劣变而仍有染色的死组织。有时这种组织往往被健壮或衰弱的活组织所包围或埋藏着，只有切开时，才能观察得到。这种组织颜色杂有斑点，或呈淡紫色、淡棕色、暗红色等不同的变化。当切开胚轴时，其切面已呈现出异常的白色。若再刮去表面的白色层，其下层则为暗红色，并且组织已变为糊状，无膨胀力，切面呈软腐状态，并带有污点。当让其气干时，则很快收缩。

④不染色的死组织。通常死组织是染成很浅而无光泽的红色或灰白色，并且组织软腐、模糊，与活组织有明显的分界。但应注意，当延长染色时间时，其颜色可能会变深，因此绝对不能错误地将其当作活组织。

⑤不同组织的区分。正确区分健壮、衰弱活组织、衰弱死组织和死亡组织对取得可靠的测定结果是十分重要的。这些组织的差异可从颜色、组织状态和分界等特征加以区别。从染成的颜色看，健壮组织是染成有光泽的鲜红色，有光泽的淡红色或有光泽的淡黄白色，衰弱的活组织通常染成稍深的红色，并随着劣变程度的加深，其颜色也随之变化。先在子叶和胚根鞘出现不染色或异常的颜色。衰弱死组织则染成淡紫色、淡红棕色、灰红色，并往往带有斑点。其颜色可从黑色到灰红色等不同等级的变化。死组织则不染色，或略带淡红色、灰白色，并且无光泽。

从组织状态看，健壮组织具有弹性和膨胀感。死组织则缺乏弹性和膨胀感，而且呈软腐和糊状状态。当然也应注意，有些禾本科大粒种子的活组织有时也表现软腐和糊状状态。这可

能是由于切开技术不当或暴露在空气后引起的不良反应，但只要叶表面有明显的叶脉，仍应当作活组织。

再从染成颜色的分界线看，健壮组织与衰弱活组织之间没有明显的分界线，但它们与衰弱死组织之间有明显的分界线。当切开组织时，就能看到其内部的正确分界线。

(4)观察鉴定从上述胚的组织特征分析，已掌握了区分健壮、衰弱和死组织的知识，但在实际鉴定时还应认真考虑下列有关方面。

①胚的主要构造部位及主要细胞分裂区的染色状况和组织状态是否正常。

②正确区分正常与不正常胚组织的染色特征的差异。

③全面观察正常、不正常或死种子的胚及活营养组织的特征及其关系。

④判断引起染色等级不同的原因。

⑤正确识别由于测定技术不当而人为造成的损伤和异常染色情况。

⑥如果全部胚的主要构造的染色和功能均在可接收的正常范围内，那么，即使胚的构造和组织状态有些不正常情况，也不能认为种子已丧失生活力。

(5)几种种子的鉴定标准为了确切掌握四唑染色样品的鉴定技术，这里介绍几种种子鉴定标准的实例供参考。

一般鉴定原则是，凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有生活力种子。凡是胚的主要构造局部不染色或染成异常的颜色和光泽，并且活营养组织不染色部分已超过1／2，或超过允许范围，以及组织软化的，为不正常种子。凡是完全不染色或染成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已软腐或异常、虫蛀、损伤、腐烂的为死种子。

在鉴定时，可借助于放大器具，认真观察鉴别。大、中粒种子可直接用肉眼或5～7倍放大镜进行观察鉴定。对小粒种子最好利用10～100倍体视显微镜进行仔细观察鉴定，在观察时，先打开底射灯光和侧射灯光，开始用低倍(10 x)观察，大致将正常染色种子，每10粒放成一堆，而将异常染色及有怀疑的种子放在一起，然后再用30 x～40 x物镜进行仔细观察核实，最后正确地区分和计算种子生活力或活力。

(七)结果表示与报告计算各个重复中有生活力的种子数，重复间最大容许差距不得超过表6-22的规定，平均百分率计算到最近似的整数。

在GB／t3543．1的结果报告单“其他测定项目”栏中要填报“四唑测定有生活力的种子______％”。

对豆类、棉籽和蕹菜等需增填“试验中发现的硬实百分率”，硬实百分率应包括在所填报有

生活力种子的百分率中。

另外，种子生活力测定，还有甲烯蓝(MB)法、溴麝香草酚兰(BTB)法、红墨水染色法和软X射线造影法等。

实验十一植物种子生活力快速测定

文章来源：生命科学系发布者：123 发布时间：2009-5-15 13:31:52 阅读：1396次

一、实验目的

掌握植物种子生活力检测的基本原理及快速鉴定植物种子生活力的方法。二、实验原理

种子活力是决定种子在发芽和出苗期间的活性强度和种子特性的综合表现（指田间条件下的出苗能力及与此有关的其他特征和指标），种子生活力是指种子的发芽潜在能力和种胚有的生命力（通常指一批种子中具有生命力种子数占种子总数的百分率）。种子贮藏过程中必须维持种子是有活力的，因此定期进行生活力和活力的检测是非常重要的。测定种子生活力方法常用发芽率测定法，该法是指在最适宜的条件下，在规定天数内发芽的种子占供试种子的百分数。它是决定种子品质和实用价值大小的主要依据，与播种时的用种量直接有关。但是常规方法（直接发芽）测定种子发芽率所需的时间较长，对于处于深休眠状态的种子，几乎难于应用。特别是有时为了应急需要，没有足够的时间来测定种子发芽率，所以有必要根据种子的生理特性建立起一套快速测定种子生活力的方法。目前，植物种子生活力的快速测定法有多种，常用的有以下3种：

1．氯化三苯基四氮唑法（TTC法）或溴麝香草酚蓝法(BTB 法)

凡有生命活力的种子其胚在呼吸作用过程中都会发生氧化还原反应，而无生命活力的种子胚则无此反应。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH或NADPH）上的氢还原时，便由无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，可溶于水）变为红色的三苯基甲腙（TTCH，不溶于水）。

生活的种子充分吸胀后，呼吸强度迅速增加，吸收空气中的氧，放出二氧化碳。二氧化碳溶于水成为碳酸，碳酸解离成H＋和HCO3-，使种胚周围酸度增加，可用溴香草酚蓝(BTB)来测定酸度变化。BTB 的变色范围为pH 6.0～7.6，

酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色(变色点为pH 7.1)，色泽差异显著，易于观察。因此，可从种子的呼吸强弱来判断种子的发芽率。

2．红墨水染色法或酸性靛蓝染色法

凡是生活的活细胞的原生质膜都具有选择吸收能力，它对某些染料不让透过，因此用这类染料(如红墨水、酸性靛蓝等)不能使种胚染色。而死种子的胚细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，于是染料进入死细胞，将胚完全染色。因此，可根据种胚或子叶对染料的着色情况判断种子的发芽率。

三、实验材料

小麦种子、大麦种子、籼稻种子、玉米种子、粳稻种子、蚕豆种子、大豆种子。

四、设备与试剂

恒温箱，培养皿，烧杯，镊子，刀片，紫外荧光灯，滤纸（无荧光），琼脂，沸水。0.5％TTC 溶液：称取TTC 0.5 g 放烧杯中，加入少许95％乙醇使其溶解，然后用蒸馏水稀释至100 mL。配好的溶液需避光保存，若呈红色时，则不能再用。5％红墨水：市售红墨水5 mL加95 mL自来水。0.1％酸性靛蓝溶液：称0.1 g 酸性靛蓝，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。0.1％BTB水溶液：称取BTB 0.1 g溶于冷开水(配制指示剂的水应为微碱性，使溶液呈蓝色或蓝绿色，而蒸馏水为微酸性，故宜用煮沸的自来水或井水)，用滤纸去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴稀氨水，使之变为蓝色或蓝绿色。此液可长期贮于棕色瓶中。

五、实验步骤

（一）氯化三苯基四氮唑法（TTC法）或溴麝香草酚蓝法(BTB法)

1．氯化三苯基四氮唑法（TTC 法）将待测种子在30～35℃温水中浸种（小麦、大麦、籼稻种子6～8 h；玉米蚕豆种子5 h 左右；粳稻种子2 h），以增加种胚的呼吸速率，使显色迅速；取吸胀种子200 粒，用刀片沿种子胚的中心线纵切为两半，将其中一半置于30℃恒温箱中0.5 ～1 h，另一半在沸水中煮5 min 杀死种胚，作为对照观察；向上述样品中加入TTC作染色处理，凡被染为红色的种子是活种子。

2．溴麝香草酚蓝法(BTB法) 浸种同TTC法；0.1％BTB琼脂凝胶的制备: 取0.1％BTB溶液50 mL于烧杯中，加剪碎成小块的琼脂0.5 g，用小火加

热并不断搅拌。待琼脂完全溶解，保温备用；取吸胀种子30～50粒，(根据种子大小，及培养皿大小而定)用自来水冲洗，沥干，用吸水纸吸去种子表面的水分，使胚向下均匀放于培养皿中(种子间距离至少应1 cm)。然后再倒入40℃左右的BTB琼脂液。以淹没种子为度，约0.2～0.4 cm。琼脂液层不宜太厚，否则会影响观察)置于30～35℃的温箱中保温30 min(夏天可放在室温下)。另取一些吸胀种子置沸水中煮5 min杀死种子作同样的处理，进行比较观察；经0.5 h后(BTB 琼脂溶已凝固)将培养皿拿到光线比较亮的窗前。将培养皿反过来(从底部)进行观察若种胚附近呈现较深黄色晕圈则是活种子，若种胚周围黄色很淡或没有色环则是无生活力的种子。

（二）红墨水染色法或酸性靛蓝染色法

1．红墨水染色法将待测种子在30～35℃温水中浸种（小麦、大麦、籼稻种子6～8、14、6h；玉米种子5 h 左右；粳稻种子2 h），以增加种胚的呼吸速率，使显色迅速；取吸胀的种子200 粒，沿种子胚的中心线纵切为二半，将其中的一半置于红墨水培养皿中5～10 min；用红墨水染色后，倒去废液，用水冲洗多次，至冲洗液无色为止，并检查种子死活。凡种胚不着色或着色很浅的为活种子，种胚与胚乳着色程度相同的为死种子。也可用沸水杀死的种子作为对照观察。2．酸性靛蓝染色法浸种同红墨水染色法；将吸胀的种子沿胚和中线切为两半，一半置于培养皿中加0.1％酸性靛蓝溶液。以淹没种子为度，染色15min，另一半弃去；染色时间到后，用自来水反复冲洗种子，将吸附在种子表面的染料冲洗干净。然后观察冲洗后的种子子叶或胚部着色情况。凡生活力强的种子胚完全不着色(白色)；有生活力的子叶和胚上有不太明显的淡色斑点；整个胚全部着色或子叶和胚根上有着色很浓的斑点，就是完全丧失或大部分丧失生活力的死种子。

六、实验结果

分别计算经不同方法处理的植物种子的生活力。

七、注意事项

1. TTC 溶液最好现配现用。如需贮藏则应贮于棕色瓶中，并放在阴凉黑暗处，如溶液变红则不可再用，处理时药液以浸没种子为度，温度一般以25～35℃为宜。

2. TTC 法判断有生活力的种子应具备如下特征：胚发育良好、完整、整个胚

染成鲜红色；子叶有小部分坏死，其部位不是胚中轴和子叶连接处；胚根尖虽有小部分坏死，但其他部位完好。而无生活力的种子：胚全部或大部分都染色；胚根部染色部分只限于根尖；子叶不染色或丧失机能的组织超过50％；胚染成很淡的紫红色或淡紫红色；子叶与胚中轴的连接处或在胚根上有较重的坏死部分；胚根受伤以及发育不良的未成熟的种子。

3. 红墨水染色时间不能太长，因细胞膜的选择透性具有相对性，染好色后，一定要反复冲洗干净。

八、问题讨论

1. 红墨水或酸性靛蓝将活种子或死种子内淀粉部分均能染上色，为什么?

2. 实验测得的发芽率与实际发芽率是否一致？为什么？

3. 比较本实验几种快速测定植物种子生活力方法所测得结果的异同，同时

简述各方法的原理、优缺点及其应用范围。

4. 溴麝香草酚蓝法(BTB法)放置培养皿中的种子之间的距离，为什么至少

在1 cm左右?

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