常见生物相容性实验汇总

常见生物相容性实验汇总

细胞复苏

材料准备：

培养基、培养皿、70%酒精、一次性吸管、FBS、15ml&50ml离心管

实验步骤：

1.先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入5ml培养基；准备37℃的水浴，取

出冻存管后立即置于水浴中融化，确保细胞全部浸入液面，快速摇动，1min内使管内的细胞融化，注意不要让水没过管口，液氮会从口子喷出，小心。

2.把培养基融化后的管子用75%酒精擦拭消毒后，放入安全柜内操作。

3.小心打开冻存管，将细胞悬液转移到有培养基的15ml离心管中。

4.1200rpm离心3min，弃上清，加入6ml含10%FBS的完全培养基，转移至新培养

瓶（小瓶6ml培养基，大瓶10ml培养基）中，做好标记（细胞类型、传代数、培养基、复苏时间、复苏人），置于CO2培养箱中37℃培养，培养24h后视情况换液。

5.复苏后细胞生长状况正常后，进行常规培养，最好在第二次传代后冻存若干管细胞，

不可只取不存，在第三次传代后可用于细胞实验。

TIPS：

a.解冻细胞必须迅速，防止细胞低温损伤，慢冻速融。

b.细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

细胞传代（TE消化法）

实验前准备事项：

1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养基、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃

水浴锅内预热（可以省去）。

2.用75％酒精擦拭双手，生物安全柜经过紫外线照射超过30min，实验前通风至少开

启15分钟让空气循环起来，橱内不要使用火焰灯，它们会影响橱内空气的流动方式。

3.实验前把可能用到的试剂、吸管及离心管等全部拿到厨内，并正确摆放使用的器械，

保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

材料准备：

TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次性吸管若干、培养皿等

实验步骤：

1.观察细胞生长状况后，取出实验所需物品，可在50ml离心管中配制40ml培养基

（4ml FBS+36ml α-MEM）待用。

2.用一次性吸管从细胞单层吸出培养基，缓慢加入PBS或者不含血清的培养基没过

细胞，摇晃洗涤培养皿1~2次。

3.再吸出PBS或培养基，吸的越干净越好，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）

TE（胰蛋白酶），以刚刚没过细胞为宜。（视细胞种类也可不洗涤直接加入TE消化液）

4.稍加摇匀，使TE消化液均匀覆盖皿内所有细胞，置37℃条件下温育1~3分钟。消

化程度以用肉眼观察当培养皿晃动时飘起单层细胞为准，可在显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，视细胞不同而调节。

5.消化适度后，加入适量培养基2~3ml于培养皿中终止消化，沿四个方向吹洗培养

皿，确保细胞均从板上消化下来，最后全部转移到15ml离心管中。

6.用吸管将已经消化的细胞轻轻吹打成细胞悬液。精确配平后放入台式离心机内

1200 rpm离心3分钟。

7.弃上清液，加入适量PBS，重悬后1200rpm离心3分钟。

8.弃上清液，先加入2~3ml含10%血清的培养基于15ml离心管中，将适量细胞重悬

液转移至含有培养基的6cm培养皿中进行培养，做好标记（细胞类型、传代数PxNy、培养基D-L-5、传代时间、传代比例1:5；操作人），置于CO2培养箱中37℃培养，清理操作台，处理垃圾，记录笔记。

TIPS：

a.消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素

的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

b.胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，细胞从平板上脱落可以

用枪头吹打实现，但必须观察到细胞间已经分离。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为

8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强，针对不同细胞，建议初次消化时

均在显微镜下观察细胞形态以确定消化程度。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。EDTA 可以螯合2价金属离子，故常用TE溶液。终止消化时，可用含有血清培养基或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用，利用培养基稀释也可以达到一定效果。

c.每次传代可以按1:3~1:10等比例进行，以ATCC数据建议和实际生长状况考虑，

请协商好细胞需要立即使用还是长期培养，合理保持培养箱中不同细胞的平板数量。

d.用一次性吸管吹匀细胞时，切勿产生大量气泡，在气泡破裂时产生的剪接力对活细

胞有致命威胁。建议吸管在吸取液体前尽量排空气体，缓慢松手以吸取更多液体，继而以合适的力度吹匀细胞。

细胞冻存

材料准备：

TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次性吸管若干、专用冻存塑料管（1ml）等

实验步骤：

1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；

2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；

3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；

4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，冻存管必须将盖子盖紧，防止液氮侵入，并做好标记（细胞类型、培养代数、培养基、冻存时间、冻存人、编号）。按下列顺序梯度降温：室温→4℃（10~20min）→冰箱冷冻室-20℃（0.5~1.5h）→低温冰箱-80℃（过夜）→液氮罐-196℃（长期）（冰上转移）。

5、整理，做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录（细胞信息、具体冻存位置、管数等）。

TIPS：

a.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase)且存活率高之状态，约为80-90%致密

度。

b.细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活

力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

c.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生

长期细胞。

d.DMSO稀释时会放出大量热能，为了防止局部DMSO浓度过高，请滴加培养基并

且不时摇晃，当然，最佳的是配制好冻存培养基，加入离心管中对细胞沉淀小心吹打制悬。

e.梯度降温转移细胞时注意放置冰盒上，避免敏感温度变化。不宜将冻存细胞放置在

0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。

f.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

g.专用冻存塑料管，带有螺旋的平底塑料盖，并且可以耐受低温，注意冻存时拧紧。细胞计数

材料准备：細胞計數器、Eppendorf 管等

实验步骤：

1.制备细胞悬液，可稀释数倍以使每小格的细胞数可数。

2.取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3.将悬液摇匀，用移液器吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边

缘滴入一小滴（不宜过多），让悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，不要使计数区两边平台沾上悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高，可用吸水纸吸去沟槽中流出的多余悬液。

4.静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜

的载物台上，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

5.细胞计数时，计数区是由4个16格小方格组成，按对角线方位，数左上、左下、

右上、右下的4个大方格(A、B、C、D)的细胞数，数完计4个大方格读数的平均数。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如细胞位于大方格的粗线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6.测数完毕，取下盖玻片，喷酒精将细胞计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，

以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干、滤纸吸干或用吹风机吹干，放入盒内保存7.细胞计数板-计数公式：

计算公式：细胞数/ml=16小格内细胞总数×104×稀释倍数

SD幼鼠骨髓间充质干细胞提取

1.准备好已灭菌的手术器械和需要用到的离心管、培养皿等器材，于紫外照

射30min灭菌。

2.先将培养基配好，并在培养皿中加入PBS和10% FBS Medium。

3.将出生7-8 天的SD幼鼠处死，喷酒精后放入超净台的培养皿中。

4.左手拿镊子将SD幼鼠后腿脚掌夹起，右手持剪刀沿着SD幼鼠后腿将皮剪

开，且将皮剪至股骨部分，要将皮剪开点，以免沾到毛发。找到股骨与身

体相连的关节处剪断，取出后腿，并将脚掌与胫骨相连位置的皮剪掉，去

除脚掌，余下部分放置于装有PBS的培养皿中。

5.重新取新一套镊子与剪刀，用镊子将腿夹起，在胫骨与股骨关节相连处用

剪刀剪断，得到分离的胫骨与股骨。

6.左手用镊子将胫骨节气，右手持剪刀对骨头进行剔肉，尽量将骨头上的肉

剔干净后，剪断胫骨两端的关节，使胫骨两端相通后放入装有10%FBS

Medium 的培养皿中，股骨处理与胫骨相同。

7.用1ml注射器插入到骨髓腔中，并不断用medium进行吹打，直至腔体发

白为止，再用1ml枪头吹打培养皿中的细胞，以免细胞成团。

8.用细胞滤网对培养皿中的细胞悬液进行过滤，去除液体中的组织和肉末，

将滤液放入10 cm 培养皿中培养过夜。

9.第二天，去除上清液，PBS清洗两次（要沿壁加PBS，以免将贴壁不牢固

的细胞吹起），再加入10% FBS Medium 培养。（由于刚提取的细胞中含有

多种杂质，刚提取的细胞经过过夜培养后，细胞上清液浑浊属于正常现象，

在提取后的两天内，细胞要每天换液，且换液时候加PBS和10%FBS

Medium 时候必须缓慢沿壁加入，以免将细胞吹起。）

10.2天换液一次，等到细胞长满之后，对细胞进行传代，传至第三代即可

进行冻存和做实验用。

CCK-8

实验目的：考察合金改性前后对对细胞毒性的变化

细胞：小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1，大鼠骨髓间充质干细胞RBMSC

实验原理：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450 nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

保存条件： 4℃干燥避光保存，有效期一年（推荐）。-20℃干燥避光保存，有效期二年。

直接在材料上种细胞的CCK8实验方案

1.准备一个小烧杯，将材料放置于烧杯中，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐物，用

75%的乙醇灭菌10 min，将材料转移至24孔板中，用PBS清洗两次，尽量减少清洗时间，再用培养基清洗一遍，加入800μl培养基使材料浸没在培养基中。（若材料为钛合金，可把75%灭菌后的材料放置于超净台，再用紫外照射一段时间后，将材料放置于24孔板中，用PBS清洗后，再用培养基进行清洗。）

2.取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血清α-MEM

培养液配成单个细胞悬液，计数，在材料上种细胞，密度为3*104/孔（可根据材料调整细胞密度），使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面(先加入800l培养基（含血清），观察是否浸没了样品，若不够再加一些。若有气泡，戳破。再以转圈的方

式加入200μl细胞重悬液至材料表面，轻微震荡)，5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁。每个材料4个复孔。（若材料为钛合金，则可将细胞悬液配成配制浓度为2×104个/mL的细胞悬液，分别注入已置入材料的无菌24孔板，每孔500μL。48孔板，每孔300μl。）

3.由于镁合金与CCK8会产生假阳性结果，所以在检测吸光度的时候，需要将细胞消

化后再与CCK8进行孵育：待细胞贴壁后，吸去培养基，加入新鲜培养基继续分别培养1,3,7天(每天需更换新鲜培养基)，弃培养基，PBS洗2次(PBS需吸干)，清洗后，将材料转移至别的空白孔中，每孔加入200μl 胰酶消化1-2 min后，在显微镜下观察control组的细胞是否消化下来，如没有消化下来，用枪吹打至细胞完全消化后，每孔加入500μl 10%胎牛血清α-MEM培养液终止消化，1200 rpm离心5min，弃上清，加入400 μl 10%CCK8的不含血清的培养基（10%CCK8溶液须提前配置好），避光培养4h，终止培养，于酶标仪450nm 波长测定其吸光度。（其他材料：待细胞贴壁后，吸去培养基，加入新鲜培养基继续分别培养1,3,7天，弃培养基，PBS 洗2次(PBS需吸干)，清洗后，将材料转移至别的空白孔中，每孔加入400μl10%CCK8的不含血清的培养基（10%CCK8溶液须提前配置好），避光培养4h，终止培养，于酶标仪450 nm 和650 nm波长测定其吸光度。）

4.实验对照组：种3*104/孔细胞于24孔板中，加入培养基分别孵育1,3,7天后，弃培

养基，PBS洗2-3次(PBS需吸干)，每孔加入与实验组相同体积的10%CCK8溶液，避光培养4h，测定450 nm的吸光度。（若为镁合金的control组，则应将control组中的细胞消化下来，再与CCK8进行孵育。）

5.空白对照：在空白孔中加入与实验组相同体积的10%CCK8溶液，避光培养4h，测

定450nm的吸光度即为空白对照。

备注：①一个方块材料为1cm2，一块材料消耗1ml培养基

②在材料上培养细胞时，需每天进行换液，防止镁合金腐蚀对细胞造成影响。

③当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确

而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。

④特别重要的是，在加入CCK8之前，必须把材料转移至其他空白孔中，以免贴

壁在材料外的细胞造成的实验误差。

材料浸提液CCK8的实验方案

1、对材料先进行封胶处理，封胶时底面只弄一次，尽量平整、薄。封胶完毕后，在干燥箱中存放3天，多余的胶用手术刀切掉，尽量使底部保持平整。在用于浸泡之前，用2000#砂纸对WE43再次进行打磨，以去除表面的氧化膜。

2、准备一个小烧杯，在烧杯中灭菌，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐物。将材料于75%的乙醇中灭菌10 min，再用PBS清洗3次，转移至24孔板中，加入培养基后在桌面来回动10-20 s。

3、材料与a-MEM+双抗培养基在5%CO2，37℃条件下孵育3天（1ml/cm 2）。

4、提取上层液在4℃中保存，使用前用0.22μm的滤头过滤除菌（加过双抗可不灭菌），离心去上清液（液体有挥发就补齐），4℃保存，材料回收。

5、细胞用α-MEM培养基+10%FBS+100U/ml 双抗培养。

6、取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血清-MEM 培养液配成单个细胞悬液，计数，在96孔板上种细胞，密度为5*103/孔，5%CO2培养箱中培养24h使细胞贴壁。

6. 24h后吸去培养基，每孔加入材料提取液90μl+10μl FBS(10%)。进一步稀释成50%，25%，10%的提取溶液，以加入90 μl培养基和10 μl FBS位对照组，每一样品设5个复孔。

7. 37℃培养1,3,7天，弃提取液，PBS洗2-3次，每孔加入100 μl不含血清的10%CCK8培养4h，终止培养，于酶标仪450 nm 波长测定其吸光度。

8.空白对照：在空白孔中加入与实验组相同体积的10%CCK8溶液，避光培养4h，测定450nm的吸光度即为空白对照。

9. 按细胞增值度法计算细胞相对增值率（Relative growth rate，RGR），并按表1的要求，将RGR值转化成六级，评定材料毒性。

RGR(%)=(材料组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度) ×100%

表1 分级标准和评定结果

0级1级2级3级4级5级

RGR(%) ≧100 75-99 50-74 25-49 1-24 0

评定结果合格合格结合细胞

形态综合

评价

不合

格

不合格不合格

注意事项：

由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

细胞CCK8实验结果参照下图：

如图所示，相同浓度浸提液与细胞共培养1天和3天后，100%WE43浸提液对细胞的毒性比较大，细胞存活率分别为60%和40%左右，而钕元素等离子注入WE43 100%浸提液与细胞共培养1天和3天后，细胞存活率分别为90%和100%左右，且在低浓度情况下钕元素等离子注入WE43能够促进细胞增殖，表明经过改性后的WE43具有良好的生物相容性。

Improvement of corrosion resistance and biocompatibility of rare-earth WE43 magnesium alloy by neodymium self-ion implantation, Corrosion Science 94 (2015) 142–155.

细胞骨架和DAPI染色（细胞粘附测试）

定义：细胞骨架是由蛋白质丝搭建起的骨架网络结构,主要包括微管，微丝，中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化、物质运输、能量转换、信息传递、基因表达等都起到重要作用。

实验目的：比较材料表面改性前后早期细胞直接粘附的状态

细胞：小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1

原理：利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就有目的蛋白。罗丹明荧光物质标记的鬼笔环肽可特异的与真核细胞的F-actin结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA 结合而发挥标记的作用，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。

实验方案：

1.准备一个小烧杯，将材料浸没在装有乙醇的小烧杯中灭菌10-15min。将材料放置

24孔板中用PBS震荡洗两次，培养基洗一次。材料放置孔板中部。

2.细胞以5*104/孔接种，使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面，孵育5 h。(先加入800μl

培养基（含血清），观察是否浸没了样品，若不够再加一些。若有气泡，戳破。再加入200 μl细胞重悬液至材料表面，轻微震荡。)（若材料为钛合金，则可将细胞悬液配成配制浓度为2×104个/mL的细胞悬液，分别注入已置入材料的无菌24孔板。）

3.细胞孵育5h后，弃去培养液，用PBS震荡清洗两次（24h时间点：加入新鲜培养

基继续培养24h后，弃上清，用PBS振荡清洗两次），3.7%甲醛（PBS中）在室温下固定5min，吸出固定液，PBS清洗2次。

4.加入0.1%（体积比）TritonX-100（PBS中）破膜5-8min，弃去TritonX-100上清液，

PBS洗3次。

5.在暗室中，取5μl

6.6μM罗丹明标记的鬼笔环肽用PBS稀释至200 μl(终浓度为

165nM，加入鬼笔环肽（覆盖即可，用完可以回收利用），室温避光孵育40 min，吸出染液，用PBS清洗洗3次。

6.加入DAPI溶液室温下染色3-5min，弃去染液，用PBS洗3次，加入PBS，荧光显

微镜观察，并拍照记录。

省染料的做法：取封口膜一块，滴加染料在封口膜上，倒扣材料，使细胞直接接触染料染色，注意过程中染料不能干。

正置荧光显微镜观察法：取干净载玻片，将材料放在载玻片上（事先泡在PBS中，取出时用吸水纸轻轻拭干，有细胞的表面朝上放置）。打开显微镜，荧光，电脑。

先在显微镜以（X100）即（10倍物镜）观察整体情况。

荧光：1 通道：DAPI，2通道：FITC，3通道：罗丹明

观察：1. 细胞骨架形态是否发生变化

2. 肌动微丝是否出现增粗

3. 细胞间连接是否增多

4. 细胞形态：多角形变成梭形，伪足明显增多

注意：DAPI和鬼笔环肽具有剧毒性，在使用的时候应尽量小心，一定要带手套操作，避免将染料弄到皮肤上。

细胞骨架和DAPI荧光染色图片结果如下图：

如上图所示，在1h的时候，纯钛上的细胞基本上呈现球形状态没有铺展，而其他三种实验组，细胞有部分铺展在材料表面，且存在有丝分裂期的细胞。同时，在4h的时候，与纯钛相比，其他三种实验组均能够明显看到材料表面上的细胞明显铺展，且在Zn/Ag-PIII材料表面上细胞的微丝更明显，说明Zn/Ag-PIII材料表面更适合细胞生长。细胞在四种材料上培养24h后，均能发现细胞上的微丝结构，且细胞与细胞之间有明显的链接，表明Zn/Ag 共注入钛合金能够增强合金对rBMSCs细胞的初始粘附和伸展状态，同时表明材料对细胞是没有毒性的。

Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 -7713,

SEM观察细胞的样品制备

目的：比较Magnesium alloys表面改性前后的细胞直接粘附材料表面的状态

细胞：小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1

方案：

7.准备一个小烧杯，将材料浸没在装有乙醇的小烧杯中灭菌10min。将材料放置24

孔板中用PBS震荡洗两次，培养基洗一次。材料放置孔板中部。

8.细胞以5*104/孔接种，使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面，孵育5 h。(先加入800μl

培养基（含血清），观察是否浸没了样品，若不够再加一些。若有气泡，戳破。再加入200μl细胞重悬液至材料表面，轻微震荡。)

9.固定：细胞孵育5h后，弃去培养液，用PBS震荡清洗两次，加入2.5%的戊二醛溶

液（PBS稀释）4℃固定1-2h。固定是利用化学试剂使细胞的细微结构或化学成分保持生前状态。

10.脱水：将双蒸水洗过3次的固定的样品依次放入30%乙醇中脱水30min，，50%乙醇

中脱水30min，70%乙醇中脱水30min，80%乙醇中脱水10 min，90%乙醇中脱水

10 min，95%乙醇中脱水10 min，100%的乙醇中脱水10 min，100%的乙醇中脱水

2-3次。

11.干燥：采用冷冻干燥法，将脱水后的样品投入液氮中，使样品迅速冷冻，然后再把

冷冻的样品放入真空内，让样品中已结成冰的溶剂及水分在高真空下升华，即由固体直接变成气体，从而使样品得以干燥。由于升华过程不经液态，不存在表面张力的作用，因而样品的变形较小，干燥效果较好。但是由于冷冻干燥需要低温条件，且时间长（通常需要数小时或数十小时），样品也较容易冻伤或产生冰晶。

12.样品的安放及粘贴：扫描样品在干燥之后、金属镀膜之前，应用特制的导电胶或其

他代用品将样品粘贴在金属样品台上。粘贴时应注意动作轻巧，保持观察面清洁。

13.镀膜：将干燥的标本用导电胶粘在标本台上（观察面向上），对样品进行金属镀膜，

使样品表面形成连续均匀的金属膜（20nm左右），使样品具有良好的导电性，有利于进行样品观察。

Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 -7713,

促成骨相关实验

配制成骨分化诱导液

1、将50 mg ASAP溶解于10 ml α-MEM配制成浓度为5mg/ml(100X)的储存液，用

0.22μm滤头过滤后于4℃保存,工作浓度为50μg/ml。

2、将630mg β-glycerophosphate 溶解于20 ml α-MEM配成浓度为100mM (10X)的储

存液，用0.22μm滤头过滤后于4℃保存,工作浓度为10 mM。

3、将1.23mg Dex溶于1223μl乙醇中，浓度为2.5*10-3

M。从2.5*10

-3

M储液中取10μl

稀释至2.5ml，浓度为1*10-5

M(100X),分装，-20℃保存，工作浓度为100nM。

配制10%的氯代十六烷基吡啶

目的：为茜素红定量测OD值做准备

步骤：

1.称取1.79g磷酸氢二钠溶于500mL水中，配制成10mM磷酸氢二钠溶液。

2.称取5g氯代十六烷基吡啶加入50mL磷酸氢二钠溶液（10mM）中溶解。

3.放入离心管内加热溶解备用；

4.最终10%的氯代十六烷基吡啶应呈微黄色。

茜素红染色

实验目的：了解各种合金促进细胞外基质的情况

实验原理：茜素红和钙离子以鳌和方式形成复合物，通过茜红素染色，可产生桔红色沉积（钙结节）用以识别组织细胞的钙盐成分，钙盐变化是骨细胞增殖分

化和骨组织成骨潜能的标志之一，钙结节是成骨分化晚期的标志。

材料数量：每种材料3个时间点（7day，14day，21day），每个时间点4个平行样。

步骤：

1. 准备小烧杯，将材料放置于烧杯中，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐物,先用无水乙醇浸泡材料并超声5-10min后，用75%的乙醇灭菌30 min，将材料转移至孔板中，用PBS清洗两次，尽量减少清洗时间，再用培养基清洗一遍.

2. 取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血清α-MEM 培养液配成单个细胞悬液，计数，在材料上种细胞，密度为1*104/孔（24孔板）和5*103/

孔（96孔板）[细胞密度根据孔板和材料可进行调整]，使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面，轻微震荡，5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁。每个材料4个复孔。

3. 细胞贴壁生长至70%-80%后，吸去培养基，加入含有成骨诱导液的新鲜培养基（50μg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM β-glycerophosphate）继续培养7,14，21天后（每三天需更换含成骨诱导液的新鲜培养基，在诱导后期，需每天对细胞进行换液，以保证能够提供足够的营养；同时，在诱导后期，对细胞进行换液一定要小心），弃培养基，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定15 min 。

4. PBS洗3次，加入20 mg/ml pH为4.1-4.3的茜素红置于37℃培养箱染色30min；(染料要没过材料)

5. 弃茜素红，PBS洗6次至无色。

6. 正置显微镜拍照。

7. 每孔加入氯代十六烷基吡啶（10%）（要没过材料表面）溶解后取150ul裂解液加入96孔板内于620nm波长处测OD值

注意事项：茜素红染色的成功关键步骤是固定液的选择和茜素红的PH，这个很重要。如上图所示，蓝色箭头指示的为钙结节。从图a可知，四种材料均能够促进rBMSCs 细胞的成骨分化，经过等离子注入的材料对细胞的促成骨效果比纯钛强，且Zn/Ag-PIII 材料对大鼠骨髓间充质干细胞的促成果效果更佳有效。从图b的吸光度可以看出结果和图a是一致的。

Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium, Biomaterials 35 (2014) 7699 -7713,

天狼星红染色

目的：考察Titanium alloys 表面改性后对细胞成骨诱导后胶原蛋白结果的影响

细胞：小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1

直接实验方案：

1.准备小烧杯，将材料放置于烧杯中，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐物,先用

无水乙醇浸泡材料并超声5-10min后，用75%的乙醇灭菌30 min，将材料转移至孔板中，用PBS清洗两次，尽量减少清洗时间，再用培养基清洗一遍.

2.取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血清

α-MEM培养液配成单个细胞悬液，计数，在材料上种细胞，密度为1*104/孔（24

孔板）和5*103/孔（96孔板），使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面，轻微震荡，5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁。每个材料4个复孔。

3.细胞贴壁生长至70%-80%后，吸去培养基，加入含有成骨诱导液的新鲜培养基

（50 g/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM β-glycerophosphate）继续培养7,14，21天后（每三天需更换含成骨诱导液的新鲜培养基，在诱导后期，需每天对细胞进行换液，以保证能够提供足够的营养；同时，在诱导后期，对细胞进行换液一定要小心），弃培养基，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定15 min 。

4.PBS洗3次，加入0.1%天狼星红置于37℃培养箱染色30min；(染料要没过材料)

5.弃天狼星红，PBS洗6次至无色。

6.用正置显微镜拍照。

7.每孔加入0.2 M NaOH/methanol (1:1) 溶解后取150ul裂解液加入96孔板内于

540nm波长处测OD值

Non-viral oligonucleotide antimiR-138 delivery to mesenchymal stem cell sheets and the effect on osteogenesis, Biomaterials 35 (2014) 7734 -7749.

碱性磷酸酶ALP

实验目的：ALP是成熟成骨细胞的标志性酶，检测材料是否存在促成骨作用

实验原理：Para-nitrophenyl phosphate (p-NPP)是一种常用的磷酸酶显色底物，在碱性条件下，可在碱性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol，呈黄色产物，

可在405nm检测吸光度。产物黄色越深，吸光度越大，说明碱性磷酸酶检

活性越高，反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸

酶活性水平，进而反应出材料是否有促成骨作用。

实验周期：7,14，21天

实验材料数量：每种材料三个时间点，每个时间点4个平行样。

实验步骤：

1.准备小烧杯，将材料放置于烧杯中，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐物,

先用无水乙醇浸泡材料并超声5-10min后，用75%的乙醇灭菌30 min，将材

料转移至孔板中，用PBS清洗两次，尽量减少清洗时间，再用培养基清洗

一遍.

2.取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血

清α-MEM培养液配成单个细胞悬液，计数，在材料上种细胞，密度为1*104/孔（24孔板）和5*103/孔（96孔板），使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面，轻微震荡，5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁。每个材料4个复孔。

3.细胞贴壁生长至70%-80%后，吸去培养基，加入含有成骨诱导液的新鲜培

养基（50μg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM β-glycerophosphate）继续培养7,14，21天后（每三天需更换含成骨诱导液的新鲜培养基，在诱导后期，需每天对细胞进行换液，以保证能够提供足够的营养；同时，在诱导后期，对细胞进行换液一定要小心），至既定时间点(天)后，取出相应时间点培养板，吸弃培养液，PBS/生理盐水清洗两遍（要轻柔，最好用巴氏吸管），500ul（24孔板）或者300ul（48孔板）0.2%tritonx-100裂解过夜4度。（细胞或组织裂解液的准备：采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞和细胞，如果有必要需进行适当匀浆，随后离心取上清，用于碱性磷酸酶的检测。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制剂。样品可以-80℃冻存，但需避免反复冻融。）

4.试剂准备：将所有试剂取出，恢复至室温使用。

a. 显色底物溶液：取一管显色底物，溶解于2.5ml的检测缓冲液中，充分溶

解和混匀，冰上放置。新鲜配制的显色底物溶液需在6小时内使用。

b. 标准品工作液：取10 uL p -nitrophenol溶液(10mM)，用检测缓冲液稀释

至0.2ml，最终浓度为0.5mM。

5.取各种裂解后溶液50 uL顺序加入到96孔板内，而后在每孔中再加入50uL

p-Npp工作液，37℃，孵育30min。同时设置空白组和标准曲线组。（空白组为50 uL显色底物+ 50uL检测缓冲液，标准曲线组分别为4、8、16、24、32和40微升p-Npp +96、92、84、76、68、60微升显色底物。）

6.每孔加入100uL反应终止液终止反应。此时，标准品或有碱性磷酸酶活性

的孔会呈现不同深浅的黄色。

7.在405nm测定吸光度。如果不能测定405nm，也可以在400-415nm范围内

检测吸光度。如果不能立即测定，可以在数小时内完成测定，所显现的黄色

在数小时内稳定。

8.碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH9.8 的diethanolamine(DEA) 缓冲液中，

37 ℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔

p -nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个

DEA酶活力单位。在pH9.6的甘氨酸缓冲液中，25℃条件下，每分钟水解

para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p -nitrophenol所需的碱

性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个Glycine酶活力单位。

一个Glycine酶活力单位约相当于3个DEA酶活力单位。本试剂盒测定的

是DEA酶活力单位。

9.取25ul各种裂解液加入96孔板内，每孔加入100ul的BCA(A:B=50:1)（测

定细胞内总蛋白）,37℃，孵育30min。在酶标仪下测定其OD值。（562nm）

{需做BSA蛋白的标准曲线，以便计算总蛋白。}

10.根据酶活性定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性。

Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 -7713,

细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

因此，有关凋亡的研究在临床和基础等各个领域已经广泛开展，凋亡细胞的检测方法显得非常重要。

细胞凋亡检测可以：（1）用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究；（2）应用于临床诊疗，新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治疗；（3）对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。

一、实验原理

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。

PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。

Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。

PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

二、实验方法和步骤

1. 流式细胞分析操作方法：

1) 细胞收集：

对贴壁生长细胞，离心收取培养液内的悬浮细胞，并用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞（消化时间不宜过长，否则容易引起假阳性），合并两部分细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。

2) 用冰冷PBS洗涤细胞后，1000g离心5 min，弃上清，加入500uL的Binding Buffer轻轻重悬细胞。

3) 加入5uL Annexin V-FITC混匀后，加入5uL DAPI，轻轻混匀，避光，反应5-15min

4) 在1h内，进行流式细胞上机检测

流式细胞仪分析：FITC: Ex=488，Em=530nm；PI: Ex=488，Em=≥630

a. Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测，PI红色荧光（流式Ex=488，Em≥630）通过FL2或FL3检测，建议使用FL3。

b. 荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿去除光谱重叠和设定十字门的位置。

5) 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限

为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

2. 荧光显微照相操作方法：

1) 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；

2) 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；应同时设置阴性对照。

a. 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；

b. 用冰冷PBS洗涤细胞两次；

c. 在500μL的BindingBuffer中加入2μL Annexin V-FITC，5 μLPI，混匀；

d. 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；

e. 避光、室温反应5 min。

3) 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和Rhodamine）观察AnnexinV- FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色

4) 结果判断：结合Annexin V-FITC的凋亡细胞的质膜将显示绿色光圈；膜结构不完整的坏死细胞和晚期凋亡细胞在整个核区被PI染成红色而质膜为AnnexinV-FITC阳性呈现为绿色光圈。

HUVECS cells 实验protocol

Transwell

1．实验用品：

小室: coster的24孔板的transwell的8μm。

上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。使用前于4℃冰箱冰水混合物中融化过夜。

下层培养液：下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。

包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。

2 制备细胞悬液

2.1 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

2.2 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105，最好不要超过5×105。

3 接种细胞

3.1 取细胞悬液100－200μl加入Transwell小室，24孔板小室一般200μl。

3.2 24孔板下室一般加入500μl含FBS或趋化因子的培养基。（这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。）

4 培养细胞

常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

5细胞染色

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

染色：推荐采用0.1%结晶紫染色。（这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞，直接染色即可。(2). 配制简单方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。）

显微镜照相和细胞计数：取若干个视野计数细胞个数一般采用5-10个，随机选取，统计计数。

另：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费。